陳向陽(yáng)，王 浩，王梓菲，萬(wàn)志兵,2，胡長(zhǎng)玉

（1.黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，安徽 黃山 245041；2.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海 西寧 810016）

夏秋茶是指夏秋季節(jié)采摘加工的茶葉，其產(chǎn)量很高，占全年的60%以上。夏秋茶的苦澀味較重，鮮爽味、品質(zhì)較低，目前夏秋茶在經(jīng)過(guò)修剪之后往往作為肥料留在茶園當(dāng)中，利用率極其低下[1]。然而夏秋茶富含茶多酚、咖啡堿類(lèi)、茶多糖等生物活性物質(zhì)[2]，具有預(yù)防心血管疾病、修復(fù)化學(xué)性肝損傷、增加機(jī)體免疫和抗皮膚衰老等作用[3，4]。因此，充分開(kāi)發(fā)與利用夏秋茶，將對(duì)提高夏秋茶附加價(jià)值、促進(jìn)茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展、增加茶農(nóng)收入具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

茶酒是以茶葉為主要原料，經(jīng)直接浸提、配制或生物發(fā)酵制作出具有茶的清香與酒的醇柔的一類(lèi)飲用酒的統(tǒng)稱(chēng)[5]。目前，茶酒制作的主要類(lèi)型為配制型茶酒和發(fā)酵型茶酒，將夏秋茶與高粱、大米、小麥等釀酒原材料進(jìn)行混合，經(jīng)蒸餾制成的發(fā)酵茶酒的研究還鮮有報(bào)道。鑒于此，本研究將夏秋茶與釀酒原料進(jìn)行混合固體發(fā)酵，運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)發(fā)酵茶酒酒醅的微生物群落結(jié)構(gòu)構(gòu)成進(jìn)行分析，并對(duì)成品酒基本理化組成、茶多酚含量及香氣物質(zhì)進(jìn)行分析，且對(duì)發(fā)酵茶酒的抗氧化功效進(jìn)行評(píng)價(jià)，旨在為準(zhǔn)確認(rèn)識(shí)發(fā)酵茶酒的微生物群落結(jié)構(gòu)組成及發(fā)酵品質(zhì)提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

夏秋茶（屯溪綠茶）購(gòu)于安徽省黃山市休寧縣榮山茶廠；硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（國(guó)家二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)），上海市計(jì)量測(cè)試研究院；DPPH 和ABTS：美國(guó)sigma 公司；七水合硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉等：西隴科學(xué)股份有限公司；其它所用試劑均為國(guó)產(chǎn)，購(gòu)于南京化學(xué)試劑有限公司。

TU-1810 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；ME 55 電子天平上海梅特勒-托利多儀器有限公公司；SCQ-8201恒溫水浴鍋：上海聲彥超聲波儀器有限公司；TGL-16A 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：湖南平科科學(xué)儀器有限公司；Spectra-Max-190 型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀：美國(guó)MolecuLar Devices公司；HP7890A/5975C 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 茶酒發(fā)酵工藝流程及操作要點(diǎn)

茶酒發(fā)酵工藝流程如圖1所示。

圖1 茶酒發(fā)酵工藝流程圖

圖1 所示工藝流程：夏秋茶和原糧（拌勻）→接種酒曲→入窖、密封發(fā)酵60 天→出窖→蒸酒→成品。操作要點(diǎn)：取夏秋茶30kg 與高粱300kg、大米150kg、小米50kg 混勻，接種酒曲（酒曲和稻糠的量為總重的30%）并攪拌均勻，入窖池，保持窖池溫度為30℃、濕度為70%～80%，發(fā)酵60 天后蒸餾，按照采用掐頭去尾的方法摘酒，得發(fā)酵成品茶酒，密封避光儲(chǔ)存[6]。同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，為未添加茶葉進(jìn)行固體發(fā)酵制得的白酒。

1.2.2 DNA提取及測(cè)序

采集發(fā)酵60天的茶酒酒醅，運(yùn)用試劑盒提取微生物宏基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取結(jié)果，用NanoDrop2000檢測(cè)濃度和純度。參考吳永祥等[7]，使用引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）對(duì)細(xì)菌16S rDNA基因V3～V4區(qū)域擴(kuò)增；使用引物ITS1F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAA GTAA-3’）和ITS2R（5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）對(duì)真菌ITS區(qū)域擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序工作委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行。

1.2.3 成品茶酒的理化指標(biāo)測(cè)定

1.2.3.1 感官分析

參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)白酒感官品評(píng)術(shù)語(yǔ)的方法（GB/T33405-2016），由7 名經(jīng)過(guò)專(zhuān)業(yè)訓(xùn)練食品專(zhuān)業(yè)人員通過(guò)色澤、外觀、香氣和口味等方面進(jìn)行評(píng)定。

1.2.3.2 pH、酒精度和總酸含量的測(cè)定

pH 值采用pH 測(cè)定儀測(cè)定，具體操作步驟見(jiàn)說(shuō)明書(shū)；酒精度的測(cè)定參照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)酒中乙醇濃度的測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)和方法（GB5009.225-2016）；總酸、總酯含量的測(cè)定參照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)白酒分析方法的標(biāo)準(zhǔn)和方法（GB10345-2022）。

1.2.3.3 茶多酚含量的測(cè)定

參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的酒石酸亞鐵比色法（GB/T21733-2008）。

1.2.4 發(fā)酵茶酒揮發(fā)性成分分析

對(duì)王曉娜等人[8]的方法加以改進(jìn)，取樣品5mL于固相微萃取儀采樣瓶中，插入裝有2cm、50/30μm DVB/CAR/PDMS Stableflex 纖維頭的手動(dòng)進(jìn)樣器，在60℃條件下萃取35min，快速移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進(jìn)樣口，熱解析5min進(jìn)樣。

氣相色譜條件:色譜柱HP-5MS（50m×0.25mm×0.20μm）；升溫程序?yàn)椋撼跏紲囟?0℃，保持5min，以4℃·min-1升溫至200℃，保持10min，進(jìn)樣口溫度250℃；以氦氣（純度99.99%）為載氣,流速1mL·min-1，不分流進(jìn)樣。MS 條件：離子源為電子電離源（EI）；離子源溫度200℃；轉(zhuǎn)接口溫度200℃；掃描范圍為50～550Amu。

總離子色譜圖積分得到的各組分在NIST17 質(zhì)譜庫(kù)中進(jìn)行檢索，篩選出匹配度≥85%的化合物，對(duì)各個(gè)化合物進(jìn)行定性，同時(shí)利用面積歸一法計(jì)算各個(gè)香氣成分的相對(duì)含量。

1.2.5 發(fā)酵茶酒的抗氧化能力測(cè)定

ABTS 自由基清除基清除能力的測(cè)定參考文獻(xiàn)[9]；DPPH 自由基清除基清除能力的測(cè)定參考文獻(xiàn)[10]；超氧陰離子自由基清除基清除能力的測(cè)定參考文獻(xiàn)[11]。測(cè)定時(shí)以未添加茶葉進(jìn)行固體發(fā)酵制得的白酒作為對(duì)照組。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)用xˉ±s表示。采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵茶酒酒醅的細(xì)菌多樣性分析

在屬水平上發(fā)酵茶酒酒醅的細(xì)菌菌群豐度如圖2 所示。在發(fā)酵60d 的茶酒成熟酒醅中乳桿菌屬（Lactobacillus）和克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）為主要優(yōu)勢(shì)菌群，相對(duì)豐度分別為88.68%、10.51%，與之前諸多報(bào)道一致[12，13]。這可能由于在茶酒酒醅發(fā)酵初始階段，多種微生物共同分解利用有機(jī)物，隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，窖池內(nèi)部酸、醇含量升高抑制了絕大多數(shù)不耐酸類(lèi)微生物的生長(zhǎng)，池內(nèi)氧含量降低，微生態(tài)由復(fù)雜的多菌屬生態(tài)結(jié)構(gòu)演替為單一的乳酸桿菌屬（Lactobacillus）為主導(dǎo)的生態(tài)結(jié)構(gòu)[12]。

圖2 屬水平上的發(fā)酵茶酒酒醅的細(xì)菌豐度分析

2.2 發(fā)酵茶酒酒醅的真菌多樣性分析

在屬水平上發(fā)酵茶酒酒醅的真菌菌群豐度如圖3 所示。出窖成熟酒醅的真菌微生物多樣性較為豐富，主要由Cutaneotrichosporon、unclassified-f-Dipodascaceae、復(fù)膜胞酵母屬（Saccharomycopsis）、Geotrichum、雙足囊菌屬（Dipodascus）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）、曲霉屬（Aspergillus）、紅酵母菌屬（RhodotoruLa）、哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania）、鐮孢霉屬（Fusarium）組成。優(yōu)勢(shì)菌群為Cutaneotrichosporon、Saccharomycopsis、Geotrichum，相對(duì)豐富分別為21.23%、13.77%、9.92%，在茶酒發(fā)酵過(guò)程中能分泌多種有利于淀粉糖化以及蛋白質(zhì)分解的酶類(lèi)，如淀粉酶、糖化酶和蛋白酶等，促進(jìn)茶酒發(fā)酵的形成[14]。本研究結(jié)果與大多數(shù)濃香型白酒所展現(xiàn)的真菌菌群組成略有不同[15，16]，可能與添加茶葉發(fā)酵，影響部分微生物的生長(zhǎng)，致使真菌菌群結(jié)構(gòu)組成發(fā)生改變。

圖3 屬水平上的發(fā)酵茶酒真菌豐度分析

2.3 發(fā)酵茶酒的理化性質(zhì)分析

由表1可以看出，發(fā)酵茶酒在香氣、口味與一般白酒（對(duì)照組）均存在差異。發(fā)酵茶酒茶香凸顯，具有茶酒的獨(dú)特風(fēng)味。依據(jù)GB/T10781.1-2021《濃香型白酒》及其明示指標(biāo)，可得出發(fā)酵茶酒的pH、酒精度、總酸和總酯含量均符合該標(biāo)準(zhǔn)，在酒精、總酸和總酯等指標(biāo)上達(dá)到了高度酒優(yōu)級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)。相比于對(duì)照組，發(fā)酵茶酒中檢測(cè)出茶多酚，其含量為14.8±1.31mg·kg-1。有研究表明以茶多酚為主體的茶特征成分與茶酒在抗氧化活性上具有協(xié)調(diào)增效作用[17]。

表1 發(fā)酵茶酒的理化性質(zhì)

2.4 發(fā)酵茶酒的揮發(fā)性成分分析

發(fā)酵茶酒的主要成分及相對(duì)含量如表2所示。

表2 發(fā)酵茶酒主要成分及相對(duì)含量

由表2 可得，利用HS-SPME/GC-MS 方法檢測(cè)到發(fā)酵茶酒與對(duì)照組的揮發(fā)性成分種類(lèi)差異較大。對(duì)照組共鑒定得到53種化合物，其相對(duì)含量占揮發(fā)性成分總量的96.56%，分為醇類(lèi)8 種（82.05%）、酯類(lèi)22種（12.3%）、醛酮類(lèi)4種（0.62%）、有機(jī)酸類(lèi)9種（1.45%）、烷烴類(lèi)8 種（0.11%）、呋喃類(lèi)1 種（0.01%）、烯類(lèi)1 種（0.02%）；發(fā)酵茶酒中共鑒定出30 種揮發(fā)物，其相對(duì)含量占揮發(fā)性成分總量的96.93%，分為醇類(lèi)5種（86.03%）、酯類(lèi)12種（10.33%）、醛酮類(lèi)2種（0.19%）、有機(jī)酸類(lèi)4 種（0.17%）、烷烴類(lèi)7 種（0.21%）。

醇類(lèi)是發(fā)酵茶酒揮發(fā)性成分的第一主要成分，主要為乙醇、異戊醇、異丁醇、2-甲基-1-丁醇等化合物。發(fā)酵茶酒中醇類(lèi)化合物主要是通過(guò)糖酵解的途徑產(chǎn)生，同時(shí)氨基酸在厭氧條件下可以通過(guò)埃里希代謝途徑形成高級(jí)醇[8,18]。酯類(lèi)是發(fā)酵茶酒揮發(fā)性成分的第二主要成分，主要為棕櫚酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯、十四酸乙酯、乙酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、硬脂酸乙酯等，呈現(xiàn)出茶酒特殊的水果香味、花香味。結(jié)果表明，發(fā)酵茶酒和一般白酒的醇類(lèi)、酯類(lèi)等主要揮發(fā)性成分含量上相差不大，然而發(fā)酵茶酒中的棕櫚酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯、硬脂酸乙酯、全順式9,12,15-十八碳三烯酸乙酯、癸酸乙酯等酯類(lèi)成分有所提高，說(shuō)明發(fā)酵茶酒的主要揮發(fā)性成分是來(lái)自于釀酒過(guò)程，茶組織帶來(lái)的香氣成分對(duì)發(fā)酵茶酒整體香氣有一定的貢獻(xiàn)[17]。發(fā)酵茶酒特定的生產(chǎn)工藝導(dǎo)致了發(fā)酵茶酒酒醅中獨(dú)特性的微生物組成和動(dòng)態(tài)變化，物質(zhì)代謝、能量代謝的結(jié)果也有所差異，是茶酒獨(dú)特風(fēng)味形成的主要因素[13]。

2.5 發(fā)酵茶酒的抗氧化作用分析

發(fā)酵茶酒的抗氧化作用如圖4所示。

圖4 發(fā)酵茶酒的抗氧化作用

由圖4 可知，發(fā)酵茶酒的ABTS、DPPH 以及超氧陰離子自由基清除能力較對(duì)照組均有較大程度的提高，其中發(fā)酵茶酒的自由基清除率分別為（99.76±0.06）%、（57.01±0.49）%、（48.20±2.35）%，而對(duì)照組的自由基清除率僅為（8.63±1.26）%、（23.55±2.71）%、（24.36±1.34）%。結(jié)果表明，發(fā)酵茶酒的抗氧化能力高于一般白酒。茶多酚是茶葉中多酚類(lèi)物質(zhì)的總稱(chēng)，主要包括兒茶素類(lèi)、黃酮類(lèi)、花青素類(lèi)等物質(zhì)，具有酚羥基、醇羥基等多個(gè)反應(yīng)活性基團(tuán)，具有抗氧化和抑菌等多種作用，可用于延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期、改善產(chǎn)品口感等[19]。相比于對(duì)照組未添加茶葉釀造的白酒，發(fā)酵茶酒中檢測(cè)出較高含量的茶多酚，呈現(xiàn)出顯著的自由基清除能力、較強(qiáng)的體外抗氧化活性。

3 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，發(fā)酵茶酒酒醅的優(yōu)勢(shì)微生物為乳桿菌屬、Cutaneotrichosporon、復(fù)膜胞酵母屬和Geotrichum。發(fā)酵茶酒的pH、酒精度、總酸等理化指標(biāo)均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。發(fā)酵茶酒的揮發(fā)性成分主要為醇類(lèi)、酯類(lèi)、醛酮類(lèi)和有機(jī)酸等，具有茶酒獨(dú)特的特性。對(duì)比未添加茶葉釀造白酒，發(fā)酵茶酒具有更顯著的ABTS、DPPH以及超氧陰離子自由基清除效果，這與發(fā)酵茶酒中富含茶多酚等多種抗氧化成分有關(guān)。本研究揭示了發(fā)酵茶酒酒醅的微生物菌群組成，對(duì)比分析了茶酒的基本理化組成、揮發(fā)性成分和抗氧化作用，為夏秋茶綜合利用及茶酒開(kāi)發(fā)提供參考。