鐘 緣，蔣鵬飛，趙 盼，譚 詩，彭 俊，彭清華*

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙410007；3.湖南省中醫(yī)藥防治眼耳鼻咽喉疾病與視功能保護(hù)工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙410208

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy, DR）是糖尿病中常見的微血管并發(fā)癥，是機(jī)體持續(xù)糖代謝紊亂和微循環(huán)障礙在眼部的表現(xiàn)，是20～60 歲勞動(dòng)人群致盲的首要原因，也是世界范圍內(nèi)重要的致盲眼病[1]。 目前，DR 的治療方法主要包括視網(wǎng)膜激光治療、激素治療、玻璃體內(nèi)注藥及玻璃體切割手術(shù)等[2]，但這些治療措施主要應(yīng)用于晚期增生性DR。 對于早期DR，目前臨床上尚無療效確切的治療方案。

中醫(yī)藥治療早期DR 具有獨(dú)到優(yōu)勢，彭清華教授認(rèn)為目絡(luò)阻滯、血水溢出脈外是早期DR 發(fā)病的重要病理因素，氣陰兩虛、目絡(luò)瘀滯、血水溢出脈外是重要病機(jī)，并針對該病機(jī)創(chuàng)制了益氣養(yǎng)陰活血利水方[3]。 全方由黃芪、黃精、生地黃、墨旱蓮、茯苓、蒲黃、蠐螬、葛根、益母草、車前子、甘草組成，共奏益氣養(yǎng)陰、活血利水之功。 前期研究表明，益氣養(yǎng)陰活血利水方能減輕早期DR 患者的臨床癥狀，能提高視力、減少微血管瘤、減少眼底出血滲出、改善毛細(xì)血管通透性、降低血液黏稠度，從而改善微循環(huán)[4]。

早期DR 最具特征的組織學(xué)改變是視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞的選擇性喪失[5]，周細(xì)胞喪失引起血-視網(wǎng)膜屏障（blood-retinal barrier, BRB）受損無法修復(fù)，故應(yīng)重視DR 的早期干預(yù)治療。 早期防治的關(guān)鍵在于減少微血管周細(xì)胞的丟失，防止無細(xì)胞新生血管的形成，阻止病情進(jìn)展[6]。 多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，磷酸肌醇3-激酶蛋白（phosphatidylinositol 3-kiases, PI3K）/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（phospho-alpha serine/threonine-protein kinase, AKT） 信號通路在維持BRB完整性、抑制視網(wǎng)膜新生血管生成和調(diào)控視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮重要作用，與DR 的發(fā)生與發(fā)展關(guān)系密切[7-9]。 本研究擬在前期研究基礎(chǔ)上， 進(jìn)一步以PI3K/AKT 信號通路及其下游凋亡蛋白為切入點(diǎn)，探討益氣養(yǎng)陰活血利水方治療早期DR的作用機(jī)制， 以期為治療早期DR 找到有效的候選藥物。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級SD 雄性大鼠138 只，體質(zhì)量（200±20） g，購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號：ZS-202106150022。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購入后飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)單位使用許可證號：SYXK（湘）2020-0005。 自由飲食飲水，12 h 晝夜節(jié)律。 實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（LL2021061607）。

1.2 主要藥物與試劑

益氣養(yǎng)陰活血利水方組成：黃芪20 g、生地黃10 g、黃精10 g、墨旱蓮10 g、蒲黃10 g（包煎）、蠐螬3 g（磨粉沖服）、葛根10 g、茯苓10 g、益母草10 g、車前子10 g、甘草5 g。 總藥量為108 g，為50 kg體質(zhì)量成人量。 由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供，按傳統(tǒng)工藝煎煮一次，并濃縮成85 mL的混懸液，濃度為1.27 g/mL；羥苯磺酸鈣膠囊（貴州天安藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格0.5 g/粒，國藥準(zhǔn)字：H20110031，批號：14201658642）。

鏈脲佐菌素（streptozocin, STZ）（北京索萊寶科技有限公司，批號：301V021）；梓檬酸、檸檬酸三鈉（上海展云化工有限公司，批號：01B221210、03A221023）；伊紅、蘇木精染液（長沙艾碧維生物科技有限公司，批號：06K230425、11Q230210）；蛋白酶抑制劑（中國北 京 金泰宏達(dá)公司，批號：583794）；Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl2-associated X protein, Bax）、胱天蛋白酶-8（cysteine aspartic acid specific protease-8, Caspase-8）、胱天蛋白酶-3（cysteine aspartic acid specific protease-3, Caspase-3）、細(xì)胞凋亡死亡激動(dòng)劑BID 蛋白（apoptotic death agonist BID protein, Bid）、PI3K、AKT 抗體（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號：AC220112006、AC210828016、AC220128020、AC210823018、AC2110 15003、AC220122010）；mRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號：09623、25722）；Trizol（美國Thermo 公司，批號：3877101223）；瓊脂糖（長沙艾碧維生物科技有限公司，批號：02C230423）。

1.3 主要儀器

電子天平（美國雙杰，型號：JJ224BC）；精密pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司，型號：PHS-3C）；手術(shù)顯微鏡（蘇州六六視覺科技股份有限公司，型號：YZ20T4）；超薄切片機(jī)（中國浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司，型號：YD-315）；包埋機(jī)（常州市中威電子儀器有限公司，型號：BMJ-A）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、LD5-10B 低速離心機(jī)、熒光PCR 板（美國Thermo公司，型號：PIKOREAL96、Fresco 17、TSPL0960）；紫 外可見分光光度計(jì)（上海Spectrum 公司，型號：SP-752）；臺式冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，型號：H1650R）；恒溫水浴箱（河南金博儀器制造有限公司，型號：THH-S2）。

1.4 分組、造模及給藥

SPF 級SD 雄性大鼠138 只，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后隨機(jī)分成6 組，空白組、模型組、羥苯磺酸鈣組及益氣養(yǎng)陰活血利水方低、中、高劑量組。 每組23 只，并進(jìn)行編號。 除空白組外，其余各組進(jìn)行早期DR 模型造模。

參照高玉等[10]早期DR 模型建立方法。 除空白組外，其余各組均以1% STZ 溶液按照60 mg/kg 體質(zhì)量腹腔注射，72 h 后尾靜脈采血測定其空腹血糖值（每次測血糖前禁食過夜），血糖≥16.7 mmol/L提示糖尿病模型造模成功，血糖不達(dá)標(biāo)或死亡大鼠予以剔除。 空白組大鼠腹腔注射相同劑量的檸檬酸鈉緩沖液。 造模成功后，維持高血糖狀態(tài)10 周。 檢測大鼠血糖和體質(zhì)量變化，每周檢測1 次。 灌胃4周后再次測量，記錄所有大鼠的血糖及體質(zhì)量。

在模型組、羥苯磺酸鈣組及益氣養(yǎng)陰活血利水方低、中、高劑量組維持高血糖10 周后，益氣養(yǎng)陰活血利水方低、中、高劑量組予以不同濃度益氣養(yǎng)陰活血利水方混懸液連續(xù)干預(yù)4 周，每日灌胃1 次。給藥劑量計(jì)算方式參照《中醫(yī)科研設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)學(xué)》[11]中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥方法部分，D2=D1×R2/R1 （D1 為50 kg 成人的劑量（108 g），查表得R2為200 g 大鼠對應(yīng)體表面積（7.040），R1 為50 kg 成人對應(yīng)體表面積（307.00），計(jì)算得到D2 約為12.4 g/(kg·d)。 結(jié)合文獻(xiàn)及實(shí)際給藥合理性[12]，低劑量組、高劑量組以中劑量組的1/2 倍、2 倍劑量給藥， 分別為6.2、24.8 g/(kg·d)?？瞻捉M、模型組給予3 mL 蒸餾水灌胃，羥苯磺酸鈣組予羥苯磺酸鈣150 mg/（kg·d）灌胃治療，實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)死亡的大鼠予以剔除并根據(jù)要求進(jìn)行補(bǔ)充。

1.5 取材

藥物干預(yù)4 周后開始取材，以3%戊巴比妥鈉30 mg/kg 腹腔注射后處死大鼠，取帶有視神經(jīng)的大鼠眼球，用4%多聚甲醛固定12 h 以上，于-80 ℃液氮下冷凍儲存。

1.6 指標(biāo)檢測

1.6.1 HE 染色觀察視網(wǎng)膜組織形態(tài)結(jié)構(gòu) 各組取材后，置于多聚甲醛固定，蔗糖脫水后置于石蠟中包埋，將包埋視網(wǎng)膜的石蠟塊切成4 μm 的切片，經(jīng)二甲苯和梯度乙醇常規(guī)脫蠟至水，自來水沖洗，經(jīng)蘇木精初染5 min 和伊紅復(fù)染4 min，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.6.2 TUNEL 染色檢測視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞凋亡取大鼠眼球，將組織進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋，制成石蠟切片，對其進(jìn)行TUNEL 染色。 根據(jù)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書，將切片進(jìn)行脫蠟、潤洗等步驟后，蘇木精復(fù)染核，梯度乙醇脫水，二甲苯15 min透明，中性樹膠封片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖像，凋亡細(xì)胞的陽性細(xì)胞核呈棕褐色，計(jì)數(shù)每平方毫米微血管周細(xì)胞調(diào)亡數(shù)目。

1.6.3 免疫組織化學(xué)法檢測視網(wǎng)膜血管Bax、Caspase-8、Caspase-3、Bid、PI3K、AKT 表達(dá) 切片經(jīng)脫臘、復(fù)水、通透及抗原修復(fù)后行標(biāo)準(zhǔn)的免疫組織化學(xué)染色，使用單克隆抗平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體標(biāo)記周細(xì)胞。每張切片隨機(jī)取2 個(gè)視野，應(yīng)用MIAS 2000型圖像分析系統(tǒng)測定Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-8、PI3K 及AKT 在視網(wǎng)膜血管周細(xì)胞的免疫反應(yīng)強(qiáng)度（灰度值）。

1.6.4 RT-PCR 檢 測 視 網(wǎng) 膜 組 織Bax、Caspase-8、Caspase-3、Bid、PI3K、AKT mRNA 表達(dá) 取各組大鼠眼球，剝離視網(wǎng)膜，采用Trizol 法提取總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA，聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增cDNA。 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s。 Bax、Caspase-8、Caspase-3、Bid、PI3K、AKT 引物序列如下。Bax：正向5'-ACGCATCCACCAAGAAGC-3'，反向5'-GCCACACGGAAGAAGACC-3'；Caspase-8：正向5'-CACCCGGACCCAGAATACC-3'，反向5'-TGTTGCTGGTGAGTGTGCATT-3'；Caspase-3：正向5'-TTAATAAAGGTATCCATGGA-3'，反向5-TTAGTGATAAAAATAGAGTT-3；Bid：正向5'-TGGTCTCGGTGGTCTTGGTA-3'，反向5'-CGTTGTTGGTCGGGGATTTG-3'；PI3K：正向5'-AATGGCGACGATTTGCGG-3'，反向5-CAGCCATAGGGGAGCATTCG-3'；AKT：正向5'-CAGACCCACGACCGCCTC-3'，反向5'-GACACAATCTCCGCACCGTAG-3'；內(nèi)參β-actin：正向5'-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3'，反向5'-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3'。 采用瓊脂糖凝膠電泳，Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描，分別記錄Bax、Caspase-8、Caspase-3、Bid、PI3K、AKT 及相應(yīng)β-actin 的 光 密 度 值（A），以β-actin 為內(nèi)參進(jìn)行半定量，分析Bax、Caspase-8、Caspase-3、Bid、PI3K、AKT mRNA 表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。 符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以“±s”表示，采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。 P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 益氣養(yǎng)陰活血利水方對大鼠體質(zhì)量的影響

治療前，與空白組比較，其余各組大鼠體質(zhì)量均明顯降低（P<0.01）。 治療4 周后，與模型組比較，各用藥組大鼠體質(zhì)量均明顯上升（P＜0.01）；與羥苯磺酸鈣組、益氣養(yǎng)陰活血利水方低劑量組比較，益氣養(yǎng)陰活血利水方中、高劑量組大鼠體質(zhì)量明顯增加（P<0.01）；與益氣養(yǎng)陰活血利水方中劑量組比較，益氣養(yǎng)陰活血利水方高劑量組大鼠體質(zhì)量明顯增加（P<0.01）。 詳見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較（±s，g，n=23）

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較（±s，g，n=23）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01；與羥苯磺酸鈣組比較，△△P<0.01；與益氣養(yǎng)陰活血利水方低劑量組比較，□□P＜0.01；與益氣養(yǎng)陰活血利水方中劑量組比較，■■P＜0.01。

組別空白組模型組羥苯磺酸鈣組益氣養(yǎng)陰活血利水方低劑量組益氣養(yǎng)陰活血利水方中劑量組益氣養(yǎng)陰活血利水方高劑量組治療前231.63±10.29 189.65±4.81**186.93±5.45**186.65±7.98**187.34±8.93**187.07±6.79**治療4 周后309.20±9.58 204.97±6.62**217.05±9.08**##220.03±9.75**##231.62±8.99**##△△□□245.70±9.04**##△△□□■■

2.2 益氣養(yǎng)陰活血利水方對大鼠血糖的影響

治療前，與空白組比較，其余各組大鼠血糖明顯升高（P<0.01）。 治療4 周后，與模型組比較，益氣養(yǎng)陰活血利水方中、高劑量組血糖明顯降低（P＜0.01）；與羥苯磺酸鈣組比較，益氣養(yǎng)陰活血利水方中、高劑量組血糖明顯降低（P＜0.05）；與益氣養(yǎng)陰活血利水方低劑量組比較，益氣養(yǎng)陰活血利水方高劑量組血糖明顯降低（P＜0.05）。 詳見表2。

表2 各組大鼠血糖比較（±s，mmol/L，n=23）

表2 各組大鼠血糖比較（±s，mmol/L，n=23）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01；與羥苯磺酸鈣組比較，△P<0.05；與益氣養(yǎng)陰活血利水方低劑量組比較，□P＜0.05。

組別空白組模型組羥苯磺酸鈣組益氣養(yǎng)陰活血利水方低劑量組益氣養(yǎng)陰活血利水方中劑量組益氣養(yǎng)陰活血利水方高劑量組治療前3.25±0.66 26.55±2.01**25.59±3.25**26.23±1.746**25.84±2.05**26.13±1.78**治療4 周后3.55±0.86 26.03±2.64**26.14±1.69**25.09±1.26**23.85±1.96**##△22.49±2.09**##△□

2.3 益氣養(yǎng)陰活血利水方對大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)的影響

空白組大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰，視網(wǎng)膜各層細(xì)胞連續(xù)，細(xì)胞核數(shù)量正常；模型組大鼠視網(wǎng)膜各層紊亂變性；羥苯磺酸鈣組大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)紊亂；益氣養(yǎng)陰活血利水方低、中劑量組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)較模型組清晰；益氣養(yǎng)陰活血利水方高劑量組大鼠視網(wǎng)膜連續(xù)，各層視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)較清晰。 詳見圖1。

圖1 各組大鼠視網(wǎng)膜HE 染色結(jié)果（×400）

2.4 益氣養(yǎng)陰活血利水方對大鼠視網(wǎng)膜周細(xì)胞凋亡的影響

空白組大鼠視網(wǎng)膜微血管未見明顯周細(xì)胞凋亡；模型組大鼠視網(wǎng)膜可見大量周細(xì)胞凋亡，呈棕褐色；羥苯磺酸鈣組及益氣養(yǎng)陰活血利水方低、中劑量組大鼠視網(wǎng)膜周細(xì)胞凋亡數(shù)雖高于空白組，但較模型組有減少；益氣養(yǎng)陰活血利水方高劑量組大鼠視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞凋亡數(shù)較模型組明顯減少。 詳見圖2。

圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜TUNEL 染色結(jié)果（×400）

與空白組比較，模型組凋亡細(xì)胞數(shù)增加（P＜0.05）；與模型組比較，各用藥組凋亡細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.05）；與羥苯磺酸鈣組比較，益氣養(yǎng)陰活血利水方低、中、高劑量組凋亡細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.05）；與益氣養(yǎng)陰活血利水方低、中劑量組比較，益氣養(yǎng)陰活血利水方高劑量組凋亡細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.05）。 詳見表3。

表3 各組視網(wǎng)膜周細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)比較（±s，n=8）

表3 各組視網(wǎng)膜周細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)比較（±s，n=8）

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與羥苯磺酸鈣組比較，△P<0.05；與益氣養(yǎng)陰活血利水方低劑量組比較，□P＜0.05；與益氣養(yǎng)陰活血利水方中劑量組比較，■P＜0.05。

組別空白組模型組羥苯磺酸鈣組益氣養(yǎng)陰活血利水方低劑量組益氣養(yǎng)陰活血利水方中劑量組益氣養(yǎng)陰活血利水方高劑量組凋亡細(xì)胞數(shù)/個(gè)12.27±1.24 36.85±6.71*30.56±8.42*#26.27±7.21*#△27.84±5.19*#△19.56±4.33*#△□■

2.5 益氣養(yǎng)陰活血利水方對大鼠視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞中PI3K、AKT 蛋白表達(dá)水平的影響

與空白組比較，模型組、羥苯磺酸鈣組及益氣養(yǎng)陰活血利水方低、中劑量組大鼠視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞中PI3K、AKT 蛋白相對表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）；與模型組相比，益氣養(yǎng)陰活血利水方低、中、高劑量組大鼠視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞中AKT 蛋白相對表達(dá)量升高（P＜0.01），益氣養(yǎng)陰活血利水方高劑量組大鼠視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞中PI3K 蛋白相對表達(dá)量升高（P＜0.01）；與益氣養(yǎng)陰活血利水方低、中劑量組比較，益氣養(yǎng)陰活血利水方高劑量組大鼠視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞中AKT 蛋白相對表達(dá)量明顯升高（P＜0.05）。詳見表4、圖3—4。

圖3 各組大鼠視網(wǎng)膜PI3K 表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)，×400）

圖4 各組大鼠視網(wǎng)膜AKT 表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)，×400）

表4 各組大鼠視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞PI3K、AKT 蛋白相對表達(dá)量比較（±s，n=6）

表4 各組大鼠視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞PI3K、AKT 蛋白相對表達(dá)量比較（±s，n=6）

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，##P<0.01；與益氣養(yǎng)陰活血利水方低劑量組比較，□P＜0.05；與益氣養(yǎng)陰活血利水方中劑量組比較，■P＜0.05。

組別空白組模型組羥苯磺酸鈣組益氣養(yǎng)陰活血利水方低劑量組益氣養(yǎng)陰活血利水方中劑量組益氣養(yǎng)陰活血利水方高劑量組PI3K 0.38±0.03 0.30±0.03*0.31±0.12*0.33±0.03*0.33±0.05*0.35±0.03##AKT 0.44±0.04 0.29±0.04*0.32±0.11*0.36±0.03*##0.36±0.03*##0.40±0.04##□■

2.6 益氣養(yǎng)陰活血利水方對大鼠視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞PI3K、AKT mRNA 表達(dá)水平的影響

與空白組比較，模型組、羥苯磺酸鈣組及益氣養(yǎng)陰活血利水方低、中劑量組大鼠視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞PI3K、AKT mRNA 相對表達(dá)量明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，羥苯磺酸鈣組大鼠視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞AKT mRNA 相對表達(dá)量升高（P＜0.05），益氣養(yǎng)陰活血利水方低、中、高劑量組大鼠視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞中PI3K、AKT mRNA 相對表達(dá)量明顯升高（P＜0.01）；與益氣養(yǎng)陰活血利水方低、中劑量組比較，益氣養(yǎng)陰活血利水方高劑量組大鼠視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞中PI3K、AKT mRNA 相對表達(dá)量明顯升高（P＜0.05）。 詳見表5。

表5 各組大鼠視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞PI3K、AKT mRNA 相對表達(dá)量比較（±s，n=6）

表5 各組大鼠視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞PI3K、AKT mRNA 相對表達(dá)量比較（±s，n=6）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與益氣養(yǎng)陰活血利水方低劑量組比較，□P＜0.05；與益氣養(yǎng)陰活血利水方中劑量組比較，■P＜0.05。

組別空白組模型組羥苯磺酸鈣組益氣養(yǎng)陰活血利水方低劑量組益氣養(yǎng)陰活血利水方中劑量組益氣養(yǎng)陰活血利水方高劑量組PI3K 0.54±0.21 0.12±0.03**0.14±0.05**0.29±0.07**##0.31±0.06**##0.42±0.11##□■AKT 1.59±0.46 0.36±0.10**0.55±0.16**#0.68±0.23**##0.64±0.26**##1.25±0.44##□■

2.7 益氣養(yǎng)陰活血利水方對大鼠視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞Bax、Caspase-8、Caspase-3、Bid 蛋白表達(dá)水平的影響

與空白組比較，模型組、羥苯磺酸鈣組及益氣養(yǎng)陰活血利水方低、中劑量組大鼠視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞Bax、Bid 蛋白相對表達(dá)量明顯升高（P＜0.05），各用藥組大鼠視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞Caspase-8、Caspase-3蛋白相對表達(dá)量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，羥苯磺酸鈣組大鼠視網(wǎng)膜周細(xì)胞Bid、Caspase-3 蛋白相對表達(dá)量降低（P＜0.05），益氣養(yǎng)陰活血利水方組低、中、高劑量組大鼠視網(wǎng)膜周細(xì)胞中Bax、Caspase-8、Caspase-3、Bid 蛋白相對表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）；與益氣養(yǎng)陰活血利水方低劑量組比較，益氣養(yǎng)陰活血利水高劑量組大鼠視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞Bax、Bid 蛋白相對表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）；與益氣養(yǎng)陰活血利水方中劑量組比較，益氣養(yǎng)陰活血利水方高劑量組大鼠視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞中Caspase-3 蛋白相對表達(dá)量明顯下降（P＜0.05）。 詳見表6、圖5—8。

圖5 各組大鼠視網(wǎng)膜Bax 表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)，×400）

圖6 各組大鼠視網(wǎng)膜Caspase-3 表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)，×400）

圖7 各組大鼠視網(wǎng)膜Caspase-8 表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)，×400）

圖8 各組大鼠視網(wǎng)膜Bid 表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)，×400）

表6 各組大鼠視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞Bax、Caspase-8、Caspase-3、Bid 蛋白相對表達(dá)量比較（±s，n=6）

表6 各組大鼠視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞Bax、Caspase-8、Caspase-3、Bid 蛋白相對表達(dá)量比較（±s，n=6）

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與益氣養(yǎng)陰活血利水方低劑量組比較，□P＜0.05；與益氣養(yǎng)陰活血利水方中劑量組比較，■P＜0.05。

組別空白組模型組羥苯磺酸鈣組益氣養(yǎng)陰活血利水方低劑量組益氣養(yǎng)陰活血利水方中劑量組益氣養(yǎng)陰活血利水方高劑量組Bax 0.31±0.02 0.42±0.02*0.38±0.06*0.35±0.03*#0.36±0.06*#0.32±0.02#□Caspase-3 0.30±0.02 0.39±0.03*0.35±0.04*#0.35±0.04*#0.37±0.03*#0.33±0.03*#■Caspase-8 0.29±0.03 0.44±0.04*0.38±0.07*0.36±0.03*#0.35±0.07*#0.33±0.04*#Bid 0.28±0.04 0.41±0.04*0.36±0.03*#0.37±0.03*#0.37±0.06*#0.32±0.04#□

2.8 益氣養(yǎng)陰活血利水方對大鼠視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞Bax、Caspase-8、Caspase-3、Bid mRNA 相對表達(dá)水平的影響

與空白組比較，其余各組大鼠視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞中Bax、Caspase-8、Caspase-3、Bid mRNA 相對表達(dá)量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，羥苯磺酸鈣組大鼠視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞Bax、Caspase-8 mR-NA 相對表達(dá)量降低（P＜0.05），益氣養(yǎng)陰活血利水方低、中、高劑量組大鼠視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞中Bax、Caspase-8、Caspase-3 mRNA 相對表達(dá)量明顯降低（P＜0.05），益氣養(yǎng)陰活血利水方高劑量組大鼠視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞Bid mRNA 相對表達(dá)量降低（P＜0.05）；與益氣養(yǎng)陰活血利水方低劑量組比較，益氣養(yǎng)陰活血利水方高劑量組大鼠視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞Bax、Caspase-8、Caspase-3 mRNA 相對表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）；與益氣養(yǎng)陰活血利水方中劑量組比較，益氣養(yǎng)陰活血利水方高劑量組大鼠視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞中Bax、Caspase-3 mRNA 相對表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）。 詳見表7。

表7 各組大鼠視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞Caspase-8、Caspase-3、Bax、Bid mRNA 相對表達(dá)量比較（±s，n=6）

表7 各組大鼠視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞Caspase-8、Caspase-3、Bax、Bid mRNA 相對表達(dá)量比較（±s，n=6）

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與益氣養(yǎng)陰活血利水方低劑量組比較，□P＜0.05；與益氣養(yǎng)陰活血利水方中劑量組比較，■P＜0.05。

Bid 0.11±0.04 0.73±0.27*0.66±0.24*0.53±0.17*0.52±0.21*0.23±0.08*#組別空白組模型組羥苯磺酸鈣組益氣養(yǎng)陰活血利水方低劑量組益氣養(yǎng)陰活血利水方中劑量組益氣養(yǎng)陰活血利水方高劑量組Bax 0.07±0.02 0.92±0.33*0.57±0.24*#0.39±0.12*#0.32±0.15*#0.14±0.07*#□■Caspase-3 0.09±0.02 1.28±0.36*0.94±0.41*0.44±0.20*#0.39±0.16*#0.25±0.07*#□■Caspase-8 0.06±0.02 1.29±0.42*0.87±0.26*#0.54±0.15*#0.43±0.11*#0.35±0.09*#□

3 討論

隨著物質(zhì)生活水平的提升以及人口老齡化比例的不斷升高，糖尿病發(fā)病率逐年增加[13]，糖尿病人群中DR 患病率達(dá)31.8%[14]，DR 的致盲率也呈上升趨勢[15]，早期防治DR 顯得尤為重要。研究表明，DR 早期的組織學(xué)病理改變之一是視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞的消失[5]，且周細(xì)胞缺失引起的BRB 功能受損是永久性的[16]。 因此，靶向減少微血管周細(xì)胞的丟失是治療早期DR 的關(guān)鍵。 目前對于早期DR 尚無療效確切的藥物。前期臨床研究表明，益氣養(yǎng)陰活血利水方能有效改善早期DR 患者的臨床癥狀[4]。

DR 屬中醫(yī)學(xué)“視瞻昏渺”“云霧移睛”等內(nèi)障眼病范疇。消渴病久傷陰，氣陰虧虛，氣虛帥血無力，無力運(yùn)化水濕，陰虛血行滯澀，脈絡(luò)不暢，致眼部血絡(luò)瘀阻或血溢脈外，引起微血管瘤、滲出、出血、水腫等眼底改變。根據(jù)早期DR 的病機(jī)特點(diǎn)，彭清華教授提出在辨證上須抓住“虛、瘀、水”三要點(diǎn)，以益氣養(yǎng)陰活血利水方加減治療。方中黃芪補(bǔ)脾益氣利水，氣行則血行，生地黃滋腎養(yǎng)陰，黃精平補(bǔ)氣陰，三藥合為君藥，共奏益氣養(yǎng)陰、補(bǔ)脾益腎之功；臣以葛根生津活血，蠐螬活血通絡(luò)，蒲黃活血止血，墨旱蓮滋補(bǔ)肝腎、涼血止血；佐以茯苓健脾利水，益母草活血利水，車前子利水滲濕，甘草調(diào)和諸藥。 全方共奏益氣養(yǎng)陰、活血利水之功[4]。

PI3K/AKT 信號通路是調(diào)控胰島素傳導(dǎo)信號的經(jīng)典途徑之一[17]，其下游多種靶蛋白參與調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞的凋亡，現(xiàn)已被證實(shí)調(diào)控該通路靶基因的表達(dá)能在一定程度上預(yù)防DR 的進(jìn)展[18]。PI3K/AKT 信號通路在視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞中被激活后，驅(qū)動(dòng)血管內(nèi)皮生長因子的細(xì)胞因子信號，介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及新生血管生成過程，導(dǎo)致DR進(jìn)展[19]。 同時(shí)，PI3K/AKT 信號激活后可作用于下游靶基因和靶蛋白，調(diào)控細(xì)胞凋亡[20]。 田麗珍等[21]發(fā)現(xiàn)，大黃庶蟲廣蟲丸能夠上調(diào)PI3K、AKT，降低Caspase-9 的表達(dá)，抑制糖尿病大鼠視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞的凋亡。CHENG 等[18]證實(shí)，DR 小鼠模型中發(fā)生了早發(fā)性周細(xì)胞丟失和細(xì)胞凋亡水平增加，并發(fā)現(xiàn)地諾前列素可以通過激活PI3K/AKT 信號通路來改善周細(xì)胞凋亡，阻止疾病進(jìn)展。

細(xì)胞凋亡主要由外源性和內(nèi)源性兩種途徑啟動(dòng)[22]，其中執(zhí)行凋亡的關(guān)鍵元素為Caspase 家族和Bcl-2家族。 Caspase-8 是外源性途徑中關(guān)鍵的啟動(dòng)型蛋白酶，而Caspase-3 是最終的凋亡執(zhí)行因子[23]，可被多種因素活化，引起激酶級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl-2 家族成員則在內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑中發(fā)揮重要作用[24]，凋亡級聯(lián)中Bcl-2 蛋白活化，激活下游Caspase 家族蛋白，作用于相應(yīng)底物，引起細(xì)胞凋亡。 Bax和Bid 是Bcl-2 家族促凋亡成員代表，Bax 通過與線粒體上的膜通道結(jié)合，促使細(xì)胞色素C 的釋放而促進(jìn)凋亡，并可與Bcl-2 形成異二聚體阻斷其抗凋亡作用，另一方面，凋亡過程啟動(dòng)后，被激活的Caspase-8 將Bid 切割為活性tBid，進(jìn)入線粒體后使得細(xì)胞色素C 高效釋放，細(xì)胞色素C 與胞漿中的凋亡酶激活因子結(jié)合，活化Caspase-9，進(jìn)而激活Caspase-3，促使細(xì)胞凋亡[25]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在益氣養(yǎng)陰活血利水方干預(yù)4 周后，與模型組比較，益氣養(yǎng)陰活血利水方中、高劑量組大鼠血糖均降低；益氣養(yǎng)陰活血利水方各劑量組大鼠體質(zhì)量均升高，大鼠視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞凋亡數(shù)減少；益氣養(yǎng)陰活血利水方高劑量組大鼠視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞中PI3K、AKT 蛋白和mRNA 表達(dá)水平均 升 高，Bax、Caspase-8、Caspase-3 及Bid 蛋 白 和mRNA 表達(dá)水平均降低。 說明益氣養(yǎng)陰活血利水方能夠降低早期DR 大鼠血糖、穩(wěn)定體質(zhì)量，上調(diào)早期DR 大鼠視網(wǎng)膜微血管中PI3K、AKT 表達(dá)，下調(diào)Bax、Caspase-8、Caspase-3 及Bid 表達(dá)，從而減少周細(xì)胞的凋亡，改善視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)紊亂。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，益氣養(yǎng)陰活血利水方能夠減少早期DR 大鼠視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞的凋亡，改善視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)紊亂，延緩DR 視網(wǎng)膜微血管病變的發(fā)生發(fā)展，可能是通過激活PI3K/AKT通路，下調(diào)Bax、Caspase-8、Caspase-3 及Bid 基因表達(dá)水平發(fā)揮作用。 DR 的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)明確了益氣養(yǎng)陰活血利水方對PI3K/AKT 信號通路的部分調(diào)控作用，希望能為未來DR的早期防治提供實(shí)踐依據(jù)。