聞曉強(qiáng)，阿榮，池海誼，席文琪，王秀清，云慶茹，張潔

1 呼和浩特市第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，呼和浩特010030；2 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科

酮癥傾向2型糖尿?。═2DM）是一類(lèi)不同于1型糖尿?。═1DM）和T2DM的混合型糖尿病綜合征。酮癥傾向T2DM主要以糖尿病酮癥酸中毒或酮癥伴嚴(yán)重高血糖起病，多見(jiàn)于體型肥胖者，大多數(shù)有糖尿病家族史，男女比例約3∶1，青中年男性較多［1］；發(fā)病時(shí)表現(xiàn)為胰島β細(xì)胞功能急性暫時(shí)性可逆性損傷，大多數(shù)患者經(jīng)過(guò)治療后，β細(xì)胞功能可達(dá)到胰島素非依賴(lài)性緩解［2］。目前臨床上將酮癥傾向T2DM均診斷為T(mén)2DM，但二者起病特點(diǎn)顯著不同?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)腸道菌群與T1DM及T2DM的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［3-4］。但對(duì)于腸道菌群在酮癥傾向T2DM發(fā)生發(fā)展中的作用鮮有報(bào)道。腸道菌群系統(tǒng)非常復(fù)雜，且數(shù)量非常龐大，正常情況下腸道菌群處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，維持腸道健康狀態(tài)［5］。腸道菌群失衡是指菌群結(jié)構(gòu)或數(shù)量發(fā)生改變，進(jìn)入病理狀態(tài)，從而破壞人體內(nèi)環(huán)境平衡，導(dǎo)致疾病發(fā)生發(fā)展［6］。本研究觀察并對(duì)比初發(fā)酮癥傾向T2DM與單純T2DM患者糞便樣本中腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異，分析差異菌種與酮癥傾向T2DM臨床代謝指標(biāo)的相關(guān)性，為酮癥傾向T2DM防治相關(guān)研究提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2021年3月—8月就診于呼和浩特市第一醫(yī)院內(nèi)分泌科的初發(fā)酮癥傾向T2DM患者和初發(fā)單純T2DM患者各34例，分別納入酮癥傾向T2DM組和單純T2DM組。酮癥傾向T2DM組納入標(biāo)準(zhǔn)［7］：①符合1999年WHO的T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)；②首次就診時(shí)尿酮體陽(yáng)性（尿酮體++或以上）、尿糖陽(yáng)性（尿糖+或以上）或血β-羥丁酸≥0.3 mmol/L，有糖尿病相關(guān)癥狀（多飲、多食、多尿、消瘦等）時(shí)間＜6個(gè)月且未使用任何口服降糖藥物或胰島素治療，無(wú)明顯感染或應(yīng)激狀態(tài)等誘因，胰島自身抗體谷氨酸脫羧酶、抗胰島素IgG抗體、抗胰島細(xì)胞抗體均陰性，空腹血清C肽≥0.33 nmol/L或胰高血糖素刺激后C肽峰值≥0.5 nmol/L［8］。單純T2DM組納入標(biāo)準(zhǔn)［7］：①T2DM患者符合1999年WHO的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)；②首次就診時(shí)不伴酮癥或酮癥酸中毒，有糖尿病相關(guān)癥狀時(shí)間＜6個(gè)月且未使用任何口服降糖藥物或胰島素治療，無(wú)明顯感染或應(yīng)激狀態(tài)等誘因。排除標(biāo)準(zhǔn)［7］：①合并有腸道感染性疾病、肝硬化、心臟疾病、高血壓、腎臟疾病、自身免疫性疾病及全身或局部感染等疾??；②15 d內(nèi)使用過(guò)抗生素或進(jìn)食含有益生菌的藥物、食物（如酸奶、含益生菌的飲料等）；③出現(xiàn)糖尿病并發(fā)癥。酮癥傾向T2DM組男26例、女8例，漢族28例、蒙古族6例；單純T2DM組男25例、女9例，漢族30例、蒙古族4例。兩組年齡、民族、身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）；酮癥傾向T2DM組甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、空腹血糖（FPG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）水平高于單純T2DM組（P均＜0.05）。見(jiàn)表1。本研究通過(guò)呼和浩特市第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批，所有受試者知情并自愿簽署知情同意書(shū)。

表1 兩組年齡、BMI、血脂及血糖指標(biāo)比較（）

表1 兩組年齡、BMI、血脂及血糖指標(biāo)比較（）

注：與單純T2DM組相比，*P＜0.05。

組別酮癥傾向T2DM組單純T2DM組HbA1c（%）11.84 ± 2.36*9.50 ± 1.93 n 34 34年齡（歲）43.71 ± 11.56 49.15 ± 11.28 BMI（kg/m2）26.73 ± 4.34 27.16 ± 3.31 TG（mmol/L）3.53 ± 3.14*2.14 ± 1.35 TC（mmol/L）5.51 ± 1.85*4.56 ± 1.00 FPG（mmol/L）18.81 ± 6.22*13.23 ± 4.87

1.2 糞便樣本獲取及腸道菌群檢測(cè)

1.2.1 糞便樣本獲取 囑兩組患者將糞便排在清潔袋上，隨后立即裝入糞便樣本盒中，迅速封口，從糞便排出到裝入糞便樣本盒的時(shí)間短于2 min，同時(shí)糞便樣本中避免混入尿液、血液等。每個(gè)樣本分裝5管，每管留取糞便樣本250 ～ 350 mg，將糞便樣本盒及5管分裝瓶放入-80 ℃冰箱中儲(chǔ)存待用。從糞便排出到凍存于冰箱的時(shí)間短于2 h［9］。

1.2.2 腸道菌群檢測(cè) 用MOBIO糞便DNA提取試劑盒進(jìn)行糞便樣本腸道細(xì)菌DNA提取。進(jìn)行PCR擴(kuò)增，16 S rRNA引物序列27 F為5′-AGRGTTTGATYNTGGCTCAG-3′，1 492 R為5′-TASGGHTACCTTGTTASGACTT-3′。構(gòu)建好的文庫(kù)使用PacBio公司提供的建庫(kù)試劑盒（SMRTbell_Template_Prep_Kit）對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行損傷修復(fù)、末端修復(fù)及連接接頭，最終磁珠純化回收后，由美國(guó)Pacific_Biosciences公司生產(chǎn)的單分子實(shí)時(shí)技術(shù)平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。將Effective_CCS序列進(jìn)行聚類(lèi)，獲得操作分類(lèi)單位（OTU）數(shù)量，進(jìn)一步對(duì)OTU進(jìn)行菌種注釋及豐度統(tǒng)計(jì)。然后在界、門(mén)、綱、目、科、屬、種各水平統(tǒng)計(jì)各樣本的菌種組成，并進(jìn)行α、β多樣性和顯著性菌種差異性分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布且方差齊的計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析法。采用QIIME2軟件進(jìn)行α多樣性指數(shù)分析；采用PERMANOVA_test進(jìn)行β多樣性指數(shù)分析；采用顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試（克魯斯卡爾—沃利斯檢驗(yàn)和兩兩Wilcoxon測(cè)試）和線性判別分析法進(jìn)行組間差異顯著菌種分析；選擇Rstats包中的wilcox.test函數(shù)或STAMP軟件中的Welch′st-test進(jìn)行組間差異分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組糞便樣本腸道菌群組成比較

2.1.1 α、β多樣性分析結(jié)果 單分子實(shí)時(shí)測(cè)序共獲得851 377條CCS序列，每個(gè)樣本至少產(chǎn)生7 909條CCS序列。在97.0%的相似度水平下將Effective_CCS序列進(jìn)行聚類(lèi)，獲得351個(gè)OTU，666 563個(gè)序列條數(shù)。酮癥傾向T2DM組α多樣性指數(shù)Chao1 Index、Shannon Index分別為139.52 ± 5.41、3.91 ±0.15，單純T2DM組分別為128.57 ± 5.93、4.06 ±0.16，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），考慮兩組間菌種多樣性和豐度差異較?。沪露鄻有苑治鲋兄髯鴺?biāo)分析法結(jié)果顯示兩組距離矩陣差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示兩組有明顯聚類(lèi)傾向，菌種及結(jié)構(gòu)分布相似度較大。見(jiàn)OSID碼圖1。

2.1.2 腸道菌群門(mén)、屬、種水平分布情況 共檢測(cè)出9個(gè)門(mén)水平菌種。兩組腸道菌群以厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）和變形菌門(mén)（Proteobacteria）為主要優(yōu)勢(shì)菌（占比均超過(guò)10%）；疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）也相對(duì)豐富。在屬水平上，以糞桿菌屬（Faecalibacterium）、擬桿菌屬（Bacteroides）、大腸桿菌屬（Escherichia）占比較高。在種水平上，主要以普拉梭菌（Faecalibacterium_prausnitzii、）大腸桿菌（Escherichia_coli）、單形巨單胞菌（Megamonasfuniformis）、普通擬桿菌（Bacteroide vulgatus）豐度較高。見(jiàn)表2及OSID碼圖2、3。

表2 兩組糞便樣本腸道菌群門(mén)水平分布情況（%）

2.1.3 差異菌種分析 LDA_Score柱狀圖及進(jìn)化分支圖顯示絕對(duì)值大于2、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的菌種。見(jiàn)OSID碼圖4、5。酮癥傾向T2DM組特異性菌種主要包括副溶血鏈球菌（Streptococcus_parasanguinis）、韋榮氏球菌科（Veillonellaceae）、Dialister_invisus、普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、普氏菌（Prevotellacopri），P分別為0.048 9、0.003 1、0.027 9、0.030 5、0.034 6；單純T2DM組特異性菌種主要包括Fusicatenibacter_saccharivorans、Anaerostipes_hadrus、乳酸明串珠菌（Leuconostoc_lactis），P分別為0.005 7、0.007 6、0.030 5。

2.2 糞便樣本差異菌種與酮癥傾向T2DM組臨床代謝指標(biāo)的相關(guān)性 酮癥傾向T2DM組差異菌種韋榮氏球菌科豐度與TG呈正相關(guān)（r=0.267，P＜0.05），但與FPG、HbA1c、TC無(wú)顯著相關(guān)（r分別為0.225、0.098、-0.048，P均＞0.05）；普雷沃氏菌、普氏菌與FPG、HbA1c呈正相關(guān)（r分別為0.294、0.260、0.337、0.295，P均＜0.05），但與TG、TC無(wú)顯著相關(guān)（r分別為0.229、0.163、0.197、0.085，P均＞0.05）；Dialister_invisus、副溶血鏈球菌豐度與FPG、HbA1c、TG、TC均無(wú)顯著相關(guān)（r分別為0.209、0.136、0.009、-0.149、-0.209、-0.127、0.069、-0.011，P均＞0.05）。

3 討論

酮癥傾向T2DM不同于T1DM和T2DM的發(fā)病特點(diǎn)，主要以糖尿病酮癥酸中毒或自發(fā)性酮癥起病，發(fā)病率較高，病因不明。腸道菌群可以調(diào)節(jié)宿主的能量?jī)?chǔ)存與代謝，被認(rèn)為與糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。酮癥傾向T2DM發(fā)病與腸道菌群的相關(guān)性尚不明確。腸道菌群在機(jī)體內(nèi)會(huì)受到多種因素影響，如生活環(huán)境、飲食結(jié)構(gòu)、抗生素、腸道疾病及合并其他疾病等［10］。為了更加準(zhǔn)確地研究酮癥傾向T2DM患者與單純T2DM患者腸道菌群的差異，首先排除生活環(huán)境及飲食結(jié)構(gòu)因素的影響，故入組患者均選擇長(zhǎng)期居住在呼和浩特市市區(qū)的居民，且通過(guò)飲食結(jié)構(gòu)表得出兩組患者在飲食攝入習(xí)慣方面無(wú)顯著差異。本研究結(jié)果顯示，兩組年齡、性別、民族、BMI差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而FPG、HbA1c、TG、TC差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。酮癥傾向T2DM除了以酮癥伴高血糖起病外，其臨床特征與T2DM相似，酮癥傾向T2DM組FPG、HbA1c高于單純T2DM組而兩組BMI差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義符合這一臨床特點(diǎn)。此外，酮癥傾向T2DM組高TG水平與既往研究結(jié)果一致，高水平的TG可導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)血漿游離脂肪酸含量增高，可能進(jìn)一步誘發(fā)、加重胰島素抵抗并促進(jìn)酮體的產(chǎn)生［11］。

酮癥傾向T2DM以酮癥起病的機(jī)制可能還與精氨酸代謝異常有關(guān)。精氨酸可參與生理代謝及維持細(xì)胞功能，如刺激胰島素分泌［12］。KASHYAP等［13］報(bào)道，典型T2DM患者與健康對(duì)照組相比血漿精氨酸水平相似。而MULUKUTLA等［12］研究發(fā)現(xiàn)酮癥傾向T2DM患者與健康對(duì)照組相比血漿精氨酸濃度降低了25%，由此考慮酮癥傾向T2DM患者精氨酸儲(chǔ)備受損。也有研究表明，精氨酸缺乏會(huì)導(dǎo)致胰島素減少［14］。由此推測(cè)酮癥傾向T2DM患者的精氨酸儲(chǔ)備及利用率降低，導(dǎo)致胰島素分泌不足；同時(shí)，胰島素分泌減少，機(jī)體糖代謝紊亂，不能利用葡萄糖供能，從而利用脂肪酸，產(chǎn)生了乙酰輔酶A，進(jìn)而導(dǎo)致酮體生成增多。

本研究發(fā)現(xiàn)，與單純T2DM組相比，酮癥傾向T2DM組以副溶血鏈球菌、韋榮氏球菌科、Dialister_invisus、普雷沃氏菌科、普氏菌等為主要差異性菌種。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，鏈球菌屬參與分解精氨酸［15］。同時(shí)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)精氨酸脫亞胺酶系統(tǒng)（ADS）是一種多酶反應(yīng)途徑（由操控子編碼），可以將精氨酸分解為鳥(niǎo)氨酸和二氧化碳等［16］。該系統(tǒng)多數(shù)存在于原核生物中，平時(shí)處于非表達(dá)狀態(tài)。一些細(xì)菌擁有一整套基因可以誘導(dǎo)ADS表達(dá)，其中包括副溶血鏈球菌。由此推測(cè)，酮癥傾向T2DM組的差異菌種副溶血鏈球菌可能導(dǎo)致精氨酸減少，進(jìn)而誘導(dǎo)了酮癥的發(fā)作。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)韋榮氏球菌科可以產(chǎn)生乙酸和丙酸［17］。乙酸是結(jié)腸中主要的短鏈脂肪酸，是肝臟膽固醇及脂肪酸合成的底物，高水平乙酸可促進(jìn)高甘油三酯血癥和高膽固醇血癥的形成［18］。目前對(duì)于丙酸的作用仍存在爭(zhēng)議，但現(xiàn)已證實(shí)其可以通過(guò)激活G蛋白偶聯(lián)受體43或游離脂肪酸受體2，抑制脂肪分解。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，丙酸能增加小鼠脂肪合成和抑制脂肪分解［19］。由此也解釋了與單純T2DM組相比，酮癥傾向T2DM組中的TG、TC水平明顯增高的可能原因。SERENA等［20］發(fā)現(xiàn)，普雷沃氏菌科（科水平）、普氏菌（種水平）可以產(chǎn)生琥珀酸，同時(shí)也明確指出，細(xì)胞外的琥珀酸是從存在特定腸道菌群的腸道內(nèi)產(chǎn)生。琥珀酸可以作為合成丙酸的關(guān)鍵中間體，促進(jìn)丙酸的合成。

本研究分析了差異菌種豐度與酮癥傾向T2DM組臨床代謝指標(biāo)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)酮癥傾向T2DM組韋榮氏球菌科豐度與TG呈正相關(guān)，推測(cè)韋榮氏球菌科豐度增高促進(jìn)了TG生成增加。而且LECOMTE等［18］的研究也表明韋榮氏球菌科與體質(zhì)量及TG變化呈正相關(guān)。韋榮氏球菌科產(chǎn)生的乙酸會(huì)導(dǎo)致高甘油三酯血癥。本研究結(jié)果與之基本一致。

一項(xiàng)研究表明，普氏菌與血糖、HbA1c呈正相關(guān)，考慮普氏菌豐度降低會(huì)導(dǎo)致血糖、HbA1c水平下降［19］。還有研究顯示，普氏菌、普雷沃氏菌可誘導(dǎo)胰島素抵抗，導(dǎo)致血糖、HbA1c升高［21］。本研究還發(fā)現(xiàn)普氏菌豐度與FPG、HbA1c呈正相關(guān)，與以上研究結(jié)論基本一致。然而，有研究表明普氏菌可通過(guò)產(chǎn)生的琥珀酸作為糖異生底物，或產(chǎn)生丁二酸激活腸道糖異生，從而改善葡萄糖耐受性及胰島素敏感性［20］。對(duì)于以上結(jié)論差異，考慮腸道菌群之間可能存在相互作用，因此不能僅通過(guò)單菌種作用下結(jié)論，需要進(jìn)一步深入研究。

研究發(fā)現(xiàn)，Dialister_invisus可以產(chǎn)生乙酸及丙酸，從而促進(jìn)TG和TC生成［18］，推測(cè)Dialister_invisus與FPG、HbA1c、TG、TC存在相關(guān)性。但本研究未發(fā)現(xiàn)它們之間的相關(guān)性?？紤]與其他研究相比，本研究入組對(duì)象含有蒙古族患者，因此可能與種族差異有關(guān)；其次，酮癥傾向T2DM患者腸道菌群相對(duì)豐富，是否因?yàn)榫N之間相互作用而導(dǎo)致此結(jié)果，需要進(jìn)一步完善菌種功能預(yù)測(cè)加以論證。對(duì)于副溶血鏈球菌與血糖、血脂指標(biāo)的相關(guān)性，暫無(wú)明確報(bào)道，仍需進(jìn)一步明確。

總之，與初發(fā)T2DM相比，酮癥傾向T2DM的腸道菌群相對(duì)豐富，其腸道菌群的結(jié)構(gòu)特征更容易導(dǎo)致酮體的生成及TG、TC的合成。由此推測(cè)酮癥傾向T2DM患者腸道差異菌種可能是導(dǎo)致其酮癥起病的原因之一。但腸道菌群系統(tǒng)非常復(fù)雜，僅靠幾種菌種無(wú)法做出確切結(jié)論，以上結(jié)論仍需證實(shí)。糞便微生物組移植可作為未來(lái)治療代謝疾病和胃腸道疾病的新方向［22］。飲食干預(yù)腸道菌群組成也有望作為預(yù)防代謝性疾病或其他疾病的一種選擇。