李鵬，歐陽運萍，陳濤，趙博，楊小軍

1 唐山職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬醫(yī)院急診科，河北唐山063000；2 唐山職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科；3 唐山職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科

急性肺損傷為嚴重的呼吸系統(tǒng)疾病，威脅生命。研究表明，活化轉(zhuǎn)錄因子3（STAT3）、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號通路參與調(diào)控急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展，能夠由促炎因子觸發(fā)，參與細胞增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)等病理生理過程［1-2］。因此，對急性肺損傷的發(fā)病機制進行研究并開發(fā)新的有效治療藥物具有重要意義［3-4］。目前臨床一般使用糖皮質(zhì)激素與其他抗炎藥物輔助呼吸支持治療急性肺損傷，雖然有一定療效，但急性肺損傷患者的生活質(zhì)量及病死率仍舊無法得到較好改善。張楚怡［5］研究顯示，NF-κB信號通路與Ⅱ型肺泡上皮細胞的上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）進程密切相關(guān)。有研究表明，二甲雙胍能夠通過NF-κB信號通路抑制腫瘤細胞生長［6］。Ⅱ型肺泡上皮細胞較難分離獲取且難以在體外傳代，是氧化損傷的主要靶點［7］。有學(xué)者利用過氧化氫（H2O2）構(gòu)建體外急性肺損傷細胞模型，發(fā)現(xiàn)姜黃素對H2O2誘導(dǎo)的A549細胞氧化損傷有治療作用［8］。人肺泡上皮細胞A549與Ⅱ型肺泡上皮細胞形態(tài)及生化特性相似，因此，2021年6月—2022年12月，本研究以A549細胞為研究對象，觀察二甲雙胍對H2O2誘導(dǎo)的A549細胞氧化損傷的抑制作用，并基于EMT及NF-κB信號通路調(diào)控探討相關(guān)機制。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要實驗材料 人肺泡上皮細胞A549購自武漢益普生物科技有限公司。二甲雙胍、H2O2、NF-κB通路抑制劑BAY 11-7082、NF-κB通路激活劑Prostratin購自上海源葉生物科技有限公司，F(xiàn)-12K培養(yǎng)基、胎牛血清購自北京索萊寶生物科技有限公司，CCK-8購自南京諾唯贊有限公司，ELISA檢測試劑盒購自上海恒遠生物科技有限公司，一抗［鼠抗人NF-κB p65、p-NF-κB p65、E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、波形蛋白、纖維黏連蛋白（FN）及內(nèi)參蛋白（β-actin）］、辣根過氧化物酶標記的二抗（山羊抗鼠IgG）購自上海翌圣生物科技股份有限公司。BZ-X倒置熒光顯微鏡購自中國基恩士有限公司，VS-840-1型層流超凈工作臺購自上海博迅實業(yè)有限公司，3H16RI型智能高速冷凍離心機購自湖南赫西儀器裝備有限公司，Victor X3型全自動酶標儀購自美國Perkin Elmer公司。

1.2 細胞分組處理及二甲雙胍作用濃度篩選 將凍存的A549細胞于-80 ℃超低溫冰箱中取出并進行復(fù)蘇，加入F-12K培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青—鏈霉素）于37 ℃、5% CO2環(huán)境培養(yǎng)，待細胞貼壁（80% ～ 90%）后傳代，取第3代（對數(shù)生長期細胞）進行實驗。將細胞分為對照組、模型組、二甲雙胍組、BAY 11-7082組、抑制劑組、激活劑組。對照組不給予藥物干預(yù)，模型組、二甲雙胍組、BAY 11-7082組、抑制劑組、激活劑組給予400 μmol/L H2O2刺激24 h構(gòu)建體外急性肺損傷細胞模型；二甲雙胍組在此基礎(chǔ)上分為三個濃度亞組，分別給予2.5、5、10 mmol/L的二甲雙胍；BAY 11-7082組加入5 mmol/L的BAY 11-7082。采用CCK-8試劑盒檢測細胞活力，對照組、模型組、BAY 11-7082組及2.5、5、10 mmol/L二甲雙胍組細胞活力分別為0.97 ± 0.09、0.40 ±0.04、0.83 ± 0.06、0.47 ± 0.03、0.71 ± 0.04、0.76 ±0.05，模型組細胞活力低于對照組，5、10 mmol/L二甲雙胍組細胞活力高于模型組（P均＜0.05），選擇5 mmol/L為二甲雙胍最佳作用濃度。抑制劑組、激活劑組造模后給予5 mmol/L二甲雙胍，并分別加入5 μmol/L的BAY 11-7082和1 μmol/L的Prostratin。后置培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2）培養(yǎng)細胞，各組均干預(yù)24 h。

1.3 細胞形態(tài)和生長觀察 取各組細胞，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并拍照記錄。

1.4 細胞遷移率測算 取各組細胞接種于6孔板，細胞密度達90%后用移液器槍頭（200 μL）劃痕，后置培養(yǎng)箱（于37 ℃，5% CO2）培養(yǎng)24 h。顯微鏡下拍照記錄0 h（S0）和24 h（S24）劃痕情況。Image J軟件分析遷移面積。細胞遷移率=（S0遷移面積-S24遷移面積）/S0遷移面積×100%。

1.5 細胞培養(yǎng)液上清丙二醛（MDA）、超氧化物岐化酶（SOD）檢測 采用ELISA法檢測各組細胞培養(yǎng)液上清中的MDA、SOD，按試劑盒說明書操作。

1.6 細胞中EMT及NF-κB信號通路相關(guān)蛋白檢測 收集各組細胞，提取總蛋白定量后上樣，電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉2 h。加入稀釋一抗（NF-κB p65、p-NF-κB p65、E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、波形蛋白、FN及β-actin）4 ℃孵育過夜后TBST洗滌，加入二抗（山羊抗鼠IgG）孵育2 h，洗滌3次，凝膠成像系統(tǒng)顯影后拍照記錄。Image J軟件分析蛋白灰度值，以目的蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值表示目的蛋白相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS26.0軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett′st檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞形態(tài)及生長情況比較 干預(yù)24 h后，對照組和抑制劑組細胞生長良好，具有較強的貼壁能力，細胞數(shù)量較多且形狀為正常生長狀態(tài)，碎片較少；二甲雙胍組和BAY 11-7082組細胞生長狀態(tài)次之；模型組和激活劑組細胞生長受抑制最明顯，細胞數(shù)量最少，貼壁能力最弱，細胞形狀不規(guī)則且細胞碎片增多。見圖1。

圖1 各組細胞形態(tài)

2.2 各組細胞培養(yǎng)液上清中MDA、SOD水平比較與對照組相比，模型組細胞培養(yǎng)液上清MDA水平升高、SOD水平降低（P均＜0.05）。與模型組相比，二甲雙胍組和BAY 11-7082組MDA水平降低、SOD水平升高（P均＜0.05）。與二甲雙胍組相比，抑制劑組MDA水平降低、SOD水平升高，激活劑組MDA水平升高、SOD水平降低（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組細胞培養(yǎng)液上清中MDA、SOD水平比較（）

表1 各組細胞培養(yǎng)液上清中MDA、SOD水平比較（）

注：與對照組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05，與二甲雙胍組相比，&P＜0.05。

SOD（U/mL）28.31 ± 2.57#28.67 ± 2.32#37.03 ± 3.88&20.12 ± 2.19&19.34 ± 1.96*38.33 ± 3.54組別二甲雙胍組BAY 11-7082組抑制劑組激活劑組模型組對照組MDA（nmol/mL）13.52 ± 1.52#12.92 ± 1.13#8.96 ± 0.88&16.98 ± 1.23&16.82 ± 1.41*8.28 ± 0.74

2.3 各組細胞遷移能力比較 對照組、模型組、二甲雙胍組、BAY 11-7082組、抑制劑組、激活劑組細胞遷移率分別為5.73% ± 0.48%、7.02% ± 2.32%、20.83% ± 1.79%、20.14% ± 1.73%、6.29% ±0.43%、34.51% ± 2.39%。與對照組相比，模型組細胞遷移率顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，二甲雙胍組和BAY 11-7082組細胞遷移率降低（P均＜0.05）；與二甲雙胍組相比，抑制劑組細胞遷移率下降，激活劑組細胞遷移率增高（P均＜0.05）。見圖2。

圖2 各組細胞遷移情況（×4）

2.4 各組細胞EMT相關(guān)蛋白表達比較 模型組E-鈣黏蛋白表達低于對照組，N-鈣黏蛋白、波形蛋白及FN表達高于對照組（P均＜0.05）。二甲雙胍組、BAY 11-7082組E-鈣黏蛋白表達高于模型組，N-鈣黏蛋白、波形蛋白及FN表達低于模型組（P均＜0.05）。與二甲雙胍組相比，抑制劑組E-鈣黏蛋白表達升高，N-鈣黏蛋白、波形蛋白及FN表達降低；激活劑組E-鈣黏蛋白表達下降，N-鈣黏蛋白、波形蛋白及FN表達增加（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組細胞EMT相關(guān)蛋白表達比較（）

表2 各組細胞EMT相關(guān)蛋白表達比較（）

注：與對照組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05，與二甲雙胍組相比，&P＜0.05。

FN 0.30 ± 0.02#0.30 ± 0.03#0.11 ± 0.01&0.50 ± 0.02&0.50 ± 0.04*0.08 ± 0.01組別二甲雙胍組BAY 11-7082組抑制劑組激活劑組模型組對照組E-鈣黏蛋白0.51 ± 0.06#0.50 ± 0.05#0.74 ± 0.09&0.20 ± 0.02&0.20 ± 0.02*0.80 ± 0.05 N-鈣黏蛋白0.30 ± 0.03#0.30 ± 0.03#0.11 ± 0.02&0.70 ± 0.04&0.80 ± 0.03*0.10 ± 0.01波形蛋白0.43 ± 0.04#0.40 ± 0.04#0.30 ± 0.05&0.81 ± 0.04&0.80 ± 0.04*0.20 ± 0.03

2.5 各組細胞NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達比較 模型組p-NF-κB p65蛋白表達高于對照組（P＜0.05）。二甲雙胍組和BAY 11-7082組p-NF-κB蛋白表達低于模型組（P均＜0.05）。抑制劑組p-NF-κB p65蛋白表達低于二甲雙胍組，激活劑組p-NF-κB p65蛋白表達高于二甲雙胍組（P均＜0.05）。見表3。

表3 各組細胞NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達比較（）

表3 各組細胞NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達比較（）

注：與對照組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05，與二甲雙胍組相比，&P＜0.05。

p-NF-κB p65 0.21 ± 0.02#0.20 ± 0.03#0.10 ± 0.02&0.40 ± 0.02&0.42 ± 0.02*0.10 ± 0.01組別二甲雙胍組BAY 11-7082組抑制劑組激活劑組模型組對照組NF-κB p65 0.11 ± 0.02 0.10 ± 0.01#0.11 ± 0.01 0.10 ± 0.02 0.10 ± 0.02 0.10 ± 0.01

3 討論

急性肺損傷作為呼吸系統(tǒng)常見疾病，病理特征多表現(xiàn)為肺泡水腫和肺間質(zhì)損害，可由創(chuàng)傷、燒傷、感染和休克引發(fā)，發(fā)病急、預(yù)后差［9］。因缺乏有效治療方法，急性肺損傷發(fā)病率及病死率較高，受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注［10］。急性肺損傷會導(dǎo)致較為嚴重的并發(fā)癥，因此研發(fā)藥物減輕急性肺損傷對于治療肺臟疾病具有重要意義［11］。二甲雙胍是臨床常用的雙胍類口服降糖藥［12］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，除了具有降糖作用外，二甲雙胍還能有效減輕細胞或組織損傷。盛琦等［13］指出，二甲雙胍可減輕H2O2誘導(dǎo)的細胞損傷。WANG等［14］的研究表明，二甲雙胍能夠減輕脂多糖誘導(dǎo)的急性肺組織損傷。但二甲雙胍的肺保護作用機制尚不明確。

本研究結(jié)果顯示，H2O2處理后A549細胞活力明顯降低，而中高濃度二甲雙胍處理后細胞活力得到恢復(fù)，提示H2O2對細胞活力有抑制作用，而二甲雙胍能夠逆轉(zhuǎn)這一作用。后續(xù)實驗結(jié)果表明，H2O2誘導(dǎo)后細胞生長明顯受到抑制，遷移率、MDA水平上升，SOD水平下降，提示H2O2促進細胞遷移并加劇了氧化損傷。在經(jīng)過二甲雙胍或BAY 11-7082處理后，上述指標變化被顯著扭轉(zhuǎn)，提示二甲雙胍和BAY 11-7082都可以抑制H2O2誘導(dǎo)的A549細胞遷移，具有減輕氧化損傷的作用。肺纖維化后肺泡結(jié)構(gòu)損壞，上皮細胞及巨噬細胞受損，并釋放出大量促纖維化因子，促進Ⅱ型肺泡上皮細胞發(fā)生EMT。研究顯示，急性肺損傷早期E-鈣黏蛋白表達水平降低，波形蛋白表達水平升高［15］。本研究結(jié)果表明，H2O2誘導(dǎo)能夠抑制E-鈣黏蛋白表達，促進N-鈣黏蛋白、波形蛋白及FN蛋白表達，二甲雙胍或BAY 11-7082處理后，E-鈣黏蛋白表達增高，而N-鈣黏蛋白、波形蛋白及FN表達降低，提示二甲雙胍和BAY 11-7082可能是通過上調(diào)E-鈣黏蛋白的表達和下調(diào)N-鈣黏蛋白、波形蛋白、FN的表達，從而抑制H2O2誘導(dǎo)的A549細胞遷移并減輕氧化損傷。

NF-κB信號通路在細胞分化、凋亡、遷移過程中均發(fā)揮重要生物學(xué)功能。研究顯示，NF-κB信號通路在急性肺損傷炎癥過程中也發(fā)揮重要作用［16］。研究證實，下調(diào)NF-κB信號通路蛋白表達能夠通過降低氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)從而減輕急性肺損傷［17］。裴彩霞等［18］研究發(fā)現(xiàn)，桔梗皂苷D能夠作用于NF-κB信號通路從而減輕脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷。另有研究顯示，在脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷中，二甲雙胍能夠發(fā)揮保護作用［19］。CHEN等［20］研究認為，二甲雙胍可能通過抑制NF-κB信號通路來發(fā)揮抗炎作用。本研究檢測了各組細胞中的NF-κB信號通路相關(guān)蛋白，結(jié)果顯示，模型組p-NF-κB p65蛋白表達高于對照組；二甲雙胍組和BAY 11-7082組p-NF-κB蛋白表達低于模型組；抑制劑組p-NF-κB p65蛋白表達低于二甲雙胍組，激活劑組p-NF-κB p65蛋白表達高于二甲雙胍組，提示二甲雙胍和BAY 11-7082可能抑制了NF-κB通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，二甲雙胍可能是通過抑制NF-κB信號通路，上調(diào)E-鈣黏蛋白表達，下調(diào)N-鈣黏蛋白、波形蛋白、FN表達，從而抑制H2O2誘導(dǎo)的A549細胞遷移并減輕氧化損傷。

綜上所述，二甲雙胍可減輕H2O2誘導(dǎo)的人肺泡上皮細胞A549氧化損傷，可能與其抑制NF-κB信號通路、抑制細胞遷移和EMT有關(guān)。但本研究僅對二甲雙胍與NF-κB信號通路的作用進行了觀察，二甲雙胍抑制細胞遷移和EMT是否與其他通路相關(guān)仍有待進一步研究。