鄭友妹，彭倩，張依，原倩影，高永峰，陳紀濤

廣州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院腫瘤科 廣東高校生物靶向診治與康復重點實驗室，廣州510700

飲食結構的改變對于腫瘤的發(fā)生發(fā)展至關重要［1-2］。生酮飲食是一種由高比例脂肪、極低碳水化合物、適量蛋白質構成的飲食方案，該方案模擬空腹狀態(tài)新陳代謝，誘導酮體產(chǎn)生作為機體能量的主要來源［3］。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞線粒體功能障礙、酮體分解限速酶3-琥珀酰輔酶A轉移酶1（OXCT1）和β-羥基丁酸脫氫酶1（BDH1）基因表達缺失，可引起酮體供能障礙，抑制腫瘤細胞生長［4-5］。在肺腺癌發(fā)生發(fā)展過程中，表皮生長因子受體（EGFR）和Kirsten大鼠肉瘤病毒基因同源物（KRAS）基因突變起到重要的驅動作用［6］。在前期工作中，我們選擇了兩種經(jīng)典突變型肺癌細胞模型，EGFR突變型肺癌細胞株PC9和KRAS基因突變型細胞株A549［7-8］，對這兩株細胞開展酮體β-羥丁酸（β-HB）干預實驗，發(fā)現(xiàn)生酮飲食可抑制A549細胞的增殖和遷移，同時出現(xiàn)了促進PC9細胞增殖和遷移的表型。有學者向非小細胞肺癌細胞株H1299無血清培養(yǎng)基中加入β-HB，發(fā)現(xiàn)該細胞通過OXCT1調控β-HB代謝，促進其自身增殖［9］。查詢公認的HPA數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)OXCT1基因在A549細胞中表達明顯低于PC9細胞。然而，對于A549、PC9細胞酮代謝的具體調控機制目前尚不清楚。2022年7—8月，本研究建立了A549、PC9細胞裸鼠皮下移植瘤模型，觀察生酮飲食對人肺腺癌兩種基因突變型裸鼠移植瘤生長的影響，并探索可能的作用機制，旨在開發(fā)突變型肺癌的新療法和抗腫瘤酮代謝的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞、動物與主要材料 人非小細胞肺癌細胞株A549、PC9購自中國科學院細胞庫。24只雌性SPF級BALB/c-nu裸鼠購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，體質量14 ～ 17 g，鼠齡28 ～ 40 d，飼養(yǎng)于廣州醫(yī)科大學實驗動物中心SPF級屏障設施中。標準化飼料和生酮飲食飼料由上海斯萊克實驗動物有限責任公司加工而成。胎牛血清購自澳洲Gibico公司，DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Corning公司。雅培血糖、血酮體試紙及血糖血酮體儀購自康伴保健器械專營店。人肺癌裸鼠皮下移植瘤轉錄組測序委托北京諾禾致源科技股份有限公司完成。本動物實驗經(jīng)廣州醫(yī)科大學實驗動物中心倫理委員會審核批準。

1.2 細胞培養(yǎng)與裸鼠皮下移植瘤制作 A549、PC9細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細胞均處于對數(shù)生長期、細胞量達到每只裸鼠接種1×106數(shù)量級時，用胰酶將兩種細胞分別消化，使用細胞計數(shù)儀調整細胞密度為5×106/mL。為保持細胞活性，將細胞懸液置于冰上以降低細胞代謝。接種時先混勻，再用1 mL注射器吸取0.2 mL細胞懸液緩慢注射到裸鼠右前肢皮下，按壓30 s緩慢拔出針頭以防懸液漏出。

1.3 動物分組及飲食干預 制作裸鼠移植瘤成功后，瘤體直徑小于2 mm時兩種裸鼠均常規(guī)進食，于瘤體直徑達到2 mm時開始飲食干預。按照喂養(yǎng)方式將每種裸鼠分為標準飲食組（SD組）和生酮飲食組（KD組），每組6只。SD組和KD組分別采用標準飲食（飼料外觀呈顆粒狀，主要營養(yǎng)成分為5.28%脂肪、22.1%蛋白質和52%碳水化合物）和生酮飲食（飼料外觀呈乳糜狀，主要營養(yǎng)成分為69%脂肪、20%蛋白質及3%碳水化合物）。連續(xù)飲食干預30 d。

1.4 裸鼠體質量、血糖、血酮體檢測 每天記錄裸鼠一般情況（包括活動、毛色、飲食等）。接種當天測量一次裸鼠體質量，以后每5 d重復測量。在飲食干預第1、10、20、30天采集尾靜脈血5 μL檢測血糖和血酮體，檢測儀器為雅培超越立妥血糖儀。

1.5 瘤體體積、質量檢測及臟器病理組織觀察飲食干預第30天，頸椎脫臼法處死裸鼠后取材測量瘤重，將腫瘤組織送北京諾禾致源科技股份有限公司完成測序。采用游標卡尺測量腫瘤長短徑、計算腫瘤體積和抑瘤率。抑瘤率=（SD組平均體積-KD組平均體積）/SD平均體積×100%。分別切取裸鼠的腫瘤、心、肝、肺、腎和腦組織，甲醛固定后，石蠟包埋，切片，HE染色，觀察病理組織變化。

1.6 A549、PC9細胞中酮代謝關鍵基因OXCT1和BDH1檢測 通過人類蛋白質圖譜項目（HPA）數(shù)據(jù)庫檢索酮代謝關鍵基因OXCT1、BDH1在RNA Cell line模塊的表達，進一步通過Lung Cancer模塊找出A549、PC9細胞株，比較OXCT1和BDH1在兩種細胞株中的轉錄表達情況。

1.7 KD組與SD組A549、PC9細胞裸鼠移植瘤差異表達基因篩選及分析 在完成基因表達定量分析后，篩選KD組與SD組A549、PC9細胞裸鼠移植瘤的差異表達基因。按照常用經(jīng)驗值，差異基因的篩選標準標準為|log2（FoldChange）|≥1及校正P≤0.05。采用火山圖直觀展示每個比較組合的差異基因分布情況；采用熱圖進行實驗數(shù)據(jù)的質量控制和差異數(shù)據(jù)的具像化展示；采用clusterProfiler軟件對差異基因集進行KEGG通路富集分析，KEGG通路富集以校正P＜0.05作為顯著性富集的閾值。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；重復測量資料比較采用重復測量的方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組荷瘤裸鼠體質量、血糖、血酮體比較 兩組飲食干預不同時點裸鼠體質量差異無統(tǒng)計學意義。KD組血糖水平略低于SD組，差異無統(tǒng)計學意義。第10天開始，兩種荷瘤裸鼠KD組血酮體水平均高于SD組（P均＜0.05）。見表1 ～ 3。

表1 兩組飲食干預不同時點A549、PC9細胞荷瘤裸鼠體質量比較（g，）

表1 兩組飲食干預不同時點A549、PC9細胞荷瘤裸鼠體質量比較（g，）

組別KD組A549細胞PC9細胞SD組A549細胞PC9細胞體質量第0天第6天第12天第18天第24天第30天16.91 ± 1.27 17.49 ± 1.48 18.74 ± 1.80 19.79 ± 2.12 18.95 ± 1.53 20.48 ± 1.70 19.60 ± 1.69 20.99 ± 1.95 19.64 ± 1.81 20.96 ± 2.04 19.86 ± 1.92 21.58 ± 2.65 20.9 ± 1.33 21.82 ± 0.98 18.67 ± 1.17 18.98 ± 1.51 19.20 ± 1.44 19.98 ± 1.28 19.31 ± 1.12 20.11 ± 1.28 21.04 ± 1.26 21.86 ± 1.43 21.04 ± 1.37 21.81 ± 1.12

表2 兩組飲食干預不同時點A549細胞荷瘤裸鼠血糖、血酮體水平比較（mmol/L，）

表2 兩組飲食干預不同時點A549細胞荷瘤裸鼠血糖、血酮體水平比較（mmol/L，）

注：與同時點SD組相比，*P＜0.05。

組別KD組第1天第10天第20天第30天SD組第1天第10天第20天第30天血糖血酮體6.04 ± 0.32 6.30 ± 0.56 4.92 ± 0.96 4.88 ± 0.57 0.80 ± 0.04 1.30 ± 0.23*1.44 ± 0.50*1.18 ± 0.40*0.79 ± 0.05 0.90 ± 0.12 0.7 ± 0.00 0.84 ± 0.15 6.06 ± 0.33 6.58 ± 0.48 5.60 ± 0.37 5.80 ± 0.35

表3 兩組飲食干預不同時點PC9細胞荷瘤裸鼠血糖、血酮體水平比較（mmol/L，）

注：與同時點SD組相比，*P＜0.05。

血酮體血糖5.26 ± 0.13 5.52 ± 0.28 4.54 ± 0.54 4.96 ± 0.72 0.81 ± 0.05 1.00 ± 0.32*1.34 ± 0.38*0.94 ± 0.15*組別KD組第1天第10天第20天第30天SD組第1天第10天第20天第30天0.83 ± 0.04 0.90 ± 0.10 0.66 ± 0.05 0.58 ± 0.13 5.84 ± 0.48 6.00 ± 0.96 5.36 ± 0.61 4.92 ± 0.34

2.2 兩組瘤體大小、重量及臟器病理改變比較 與SD組相比，KD組A549細胞裸鼠移植瘤體積變小、質量變輕，KD組PC9細胞移植瘤體積增大、質量增加（P均＜0.05）。KD組A549、PC9細胞移植瘤的抑瘤率分別為58%、-133%。見圖1、表4。HE結果顯示兩種荷瘤裸鼠各臟器未見明顯病理改變。

圖1 兩組飲食干預第30天A549、PC9細胞荷瘤裸鼠移植瘤外觀

表4 兩組A549、PC9細胞裸鼠移植瘤的腫瘤體積、腫瘤質量、抑瘤率比較（）

表4 兩組A549、PC9細胞裸鼠移植瘤的腫瘤體積、腫瘤質量、抑瘤率比較（）

注：與同種細胞裸鼠移植瘤SD組相比，*P＜0.05。

組別KD組A549細胞PC9細胞SD組A549細胞PC9細胞腫瘤體積（mm3）腫瘤質量（g）抑瘤率（%）232.81 ± 85.79*1632.96 ± 240.85*0.13 ± 0.05*0.94 ± 0.30*58-133 357.52 ± 103.92 761.55 ± 277.82 0.23 ± 0.08 0.33 ± 0.20

2.3 A549、PC9細胞中OXCT1、BDH1基因表達比較 HPA數(shù)據(jù)庫查詢及分析結果顯示，在A549細胞中，BDH1 RNA nTPM為2.3，OXCT1 RNA nTPM為2.3；在PC9細胞中，BDH1 RNA nTPM為16.2，OXCT1 RNA nTPM為19.5。OXCT1、BDH1基因在PC9細胞中的表達高于A549細胞。

2.4 KD組與SD組A549、PC9細胞裸鼠移植瘤的差異表達基因

2.4.1 兩組酮代謝關鍵基因表達比較 KD組A549細胞移植瘤中OXCT1基因（11.79 ± 2.98）表達低于SD組（57.01 ± 16.42），P＜0.05。KD組PC9細胞移植瘤中OXCT1基因（311.00 ± 90.00）表達高于SD組（88.00 ± 11.36），P＜0.05。A549荷瘤裸鼠SD組、KD組腫瘤中BDH1基因表達量分別為44.00 ±3.33、53.33 ± 3.78；PC9荷瘤裸鼠SD組、KD組腫瘤中BDH1基因表達量分別為203.00 ± 9.33、226.33 ±17.56。BDH1基因在KD組和SD組兩種細胞移植瘤中的表達差異無統(tǒng)計學意義。

2.4.2 差異表達基因及聚類分析 SD組和KD組A549細胞移植瘤差異表達基因2 998個，與SD組相比，KD組中有1 600個基因表達下調，1 398個基因表達上調。SD組和KD組PC9細胞移植瘤差異表達基因1 229個，與SD組相比，KD組中有648個基因表達下調，581個基因表達上調。見OSID碼圖1。不同飲食干預條件下，A549、PC9細胞裸鼠移植瘤中基因表達存在明顯差異，且A549和PC9細胞荷瘤裸鼠相比，其腫瘤組織中基因表達也存在差異。見OSID碼圖2。

2.4.3 差異表達基因KEGG信號通路富集分析結果 SD組和KD組A549細胞移植瘤差異表達基因主要富集在細胞周期、ECM受體相互作用、細胞因子受體相互作用、神經(jīng)活性的配體—受體相互作用、腫瘤信號通路、補體與凝血級聯(lián)信號通路、JAKSTAT信號通路、人類T細胞白血病病毒1感染等信號通路。SD組和KD組PC9細胞移植瘤差異表達基因主要富集在細胞周期信號通路、IL-17信號通路、Relaxin信號通路、阿米巴病、蛋白質消化和吸收通路、卵母細胞減數(shù)分裂、p53信號通路、孕酮介導的卵母細胞成熟、AGE-RAGE和NF-κB等信號通路。見表5 ～ 6。

表5 兩組A549細胞移植瘤差異表達基因KEGG信號通路分析結果（校正P值排序前10位）

表6 兩組PC9細胞移植瘤差異表達基因KEGG信號通路分析結果（校正P值排序前10位）

3 討論

2021年NCCN指南V1版肺癌治療方案指出，EGFR突變作為腫瘤發(fā)病重要的驅動因子，30%以上的肺癌患者存在該基因突變；V5版指出KRAS是非小細胞肺癌常見的致癌突變，在中國人群發(fā)生率約為9.8%，僅次于EGFR突變。針對EGFR、KRAS的藥物療效更好，患者容易耐受，可明顯延長患者生存期，這也是肺癌患者治療前盡量做基因突變檢測的原因。但隨著靶向藥的反復使用，除了治療費用昂貴外，患者逐漸出現(xiàn)獲得性耐藥，一定程度上限制了其在臨床上的應用［10-11］。因此，繼續(xù)探索肺癌治療有效手段，有望讓更多患者從中受益。

膳食結構在人類疾病發(fā)生發(fā)展和轉歸中起到很重要的作用［12-13］。生酮飲食最早用于腦部疾?。ㄈ绨d癇）的治療，因療效顯著而被確立為一種食療方案［14］。隨著研究不斷深入，許多學者將生酮飲食與代謝性疾病的治療聯(lián)系在一起［15-16］。腫瘤被認為是一種代謝性疾病，能量代謝重編程使腫瘤獲得迅速的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉移［17-18］。目前研究發(fā)現(xiàn)，酮體在肝臟脂肪酸氧化分解的主要產(chǎn)物β-HB通過與Hcar2（一種G蛋白偶聯(lián)受體）結合并激活Hopx表達，引起細胞周期阻滯來抑制結腸癌細胞的生長［19］。生酮飲食除了對葡萄糖/胰島素信號發(fā)揮抑制作用外，還可以通過降低氧化應激、線粒體代謝和炎癥反應抑制腫瘤的增殖［20］。雖然目前生酮飲食抗腫瘤治療相關研究已經(jīng)取得巨大進展，然而其具體的作用機制尚未完全闡明。

β-HB作為生酮飲食產(chǎn)生的主要脂質代謝產(chǎn)物，常用于體內外腫瘤細胞酮體代謝相關研究［21-22］。前期研究中我們對突變型肺癌細胞株開展β-HB干預實驗，發(fā)現(xiàn)生酮飲食可抑制A549細胞的增殖和遷移，但可促進PC9細胞增殖和遷移的表型（數(shù)據(jù)暫未發(fā)表）。為了進一步探索潛在機制，本研究建立A549、PC9細胞裸鼠移植瘤模型，分別采用生酮飲食和標準飲食干預，結果發(fā)現(xiàn)KD組裸鼠血酮體明顯升高，符合生酮飲食治療動物模型數(shù)據(jù)標準。體質量直接反映動物的整體狀態(tài)，兩組相比無明顯差異，病理檢查顯示飲食干預對裸鼠臟器無明顯病理損害，說明生酮飲食對裸鼠無明顯副作用。腫瘤體積和瘤重測量結果表明，生酮飲食可抑制A549移植瘤生長但促進PC9細胞移植瘤生長，這與體外實驗結果相吻合。此外，我們前期實驗同樣證實生酮飲食能夠抑制A549細胞增殖［23］，這說明該實驗結果可信且具有良好的重復性。

據(jù)文獻報道，向無血清的培養(yǎng)基中加入β-HB能夠促進肺癌H1299細胞的增殖和遷移，進一步研究發(fā)現(xiàn)該細胞中OXCT1表達升高，且可以通過激活NF-κB信號通路來促進非小細胞肺癌的生長和遷移［24］。HPA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，PC9細胞中OXCT1基因表達高于A549細胞，腫瘤組織測序結果進一步印證數(shù)據(jù)庫分析結果。據(jù)此，我們推測生酮飲食干預后，PC9細胞和PC9細胞移植瘤的生長明顯加快，可能與酮體代謝增強相關，具體機制尚未闡明，這也是下一步需要探究的問題。有研究發(fā)現(xiàn)對EGFR突變型非小細胞肺癌靶向治療容易產(chǎn)生獲得性耐藥，降脂藥物和分子靶向藥物聯(lián)合使用不僅可以增強體外治療效果，還可以減緩體內腫瘤的生長［25］，這提示對人EGFR基因突變型肺腺癌可采用與降低血脂的藥物聯(lián)合治療方案。

從差異基因表達和聚類分析結果來看，兩種裸鼠移植瘤基因表達存在明顯差異，且每種荷瘤裸鼠采取不同的飲食干預，同樣明顯影響腫瘤組織中基因的表達。針對差異表達基因進行KEGG信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)，生酮飲食對A549細胞移植瘤的生長抑制作用可能與差異表達基因富集信號通路中細胞周期阻滯和JAK-STAT信號通路激活相關［26］。在PC9細胞移植瘤測序結果中，許多差異表達基因均富集在重要的腫瘤信號通路，例如IL-17、Relaxin、AGE-RAGE和NF-κB等信號通路［27-29］，提示生酮飲食干預促進PC9細胞增殖可能與以上信號通路激活有關，具體的作用機制還需要大量實驗進行驗證。

綜上所述，本研究選擇兩種經(jīng)典基因突變型肺癌細胞株PC9、A549作為研究對象，在前期體外實驗基礎上，通過體內實驗進一步證實生酮飲食干預可導致突變型細胞株出現(xiàn)相反增殖表型。接下來通過對腫瘤組織開展轉錄組測序分析，找到荷瘤裸鼠不同干預條件下腫瘤組織中存在差異表達的酮代謝關鍵酶和活化信號通路。以上研究結果提示生酮飲食對EGFR、KRAS突變型肺癌均有一定調控作用，有望為突變型肺癌的治療提供參考。