張小田，周國(guó)平

1 南京醫(yī)科大學(xué)附屬逸夫醫(yī)院兒科，南京211112；2 南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科

局灶節(jié)段性腎小球硬化（FSGS）是腎病綜合征的常見病理類型，占兒童腎病綜合征的20%，是最常見的導(dǎo)致終末期腎病的原發(fā)性腎小球疾病［1］。目前FSGS檢出率迅速上升［2］。研究表明，F(xiàn)SGS是導(dǎo)致腎功能衰竭的主要原因［3］，腎移植后的復(fù)發(fā)率高達(dá)40%。原發(fā)性FSGS的發(fā)病機(jī)制仍不明確，而且能夠使嚴(yán)重腎病綜合征和快速進(jìn)展患者受益的治療手段比較有限［4］。研究認(rèn)為，除了遺傳因素、病毒相關(guān)疾病和藥物因素，多種足細(xì)胞骨架蛋白損傷也可能導(dǎo)致FSGS，如NPHS1、NPHS2、ACTN4、TRPC6及INF2等［5］。30% ～ 80%的原發(fā)性FSGS患者腎移植后疾病會(huì)復(fù)發(fā)［6］，但基因治療的FSGS患者復(fù)發(fā)率低，且遺傳性FSGS患者基因治療后可縮短免疫抑制療程并減輕不良反應(yīng)［7］。NPHS2位于染色體1q25.2，編碼一種在調(diào)節(jié)腎小球通透性中發(fā)揮作用的蛋白質(zhì)。該基因突變會(huì)導(dǎo)致類固醇耐受性腎病綜合征。激活蛋白2（AP-2）轉(zhuǎn)錄因子于1987年首次從HeLa細(xì)胞中純化出來，轉(zhuǎn)錄因子AP-2α（TFAP2A）是腎臟發(fā)育過程中腎單位分化的新型分子［8］，TFAP2A表達(dá)抑制可促進(jìn)細(xì)胞凋亡［9］，抑制TFAP2A活性可調(diào)節(jié)腎單位節(jié)段發(fā)育［10］，TFAP2A在遠(yuǎn)曲小管分化中也起關(guān)鍵作用［11］，但目前TFAP2A調(diào)控足細(xì)胞相關(guān)基因的報(bào)道較少。2020年5月—2021年12月，本研究觀察了TFAP2A對(duì)腎小球硬化相關(guān)基因NPHS2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，為基因治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要實(shí)驗(yàn)材料 人胚腎293T細(xì)胞（HEK-293T）、螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-Basic、內(nèi)參照?qǐng)?bào)告基因質(zhì)粒pRL-TK、TFAP2A過表達(dá)質(zhì)粒、pENTER均為本實(shí)驗(yàn)室保存；載有NPHS2啟動(dòng)子-519 bp ～ +20 bp的pGL3-Basic購(gòu)自上海捷瑞工程有限公司；感受態(tài)大腸桿菌DH5α購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bimake公司；LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Thermo-Scientific公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；青—鏈霉素雙抗購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；總蛋白提取試劑盒購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)股份有限公司；GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；Total RNA Kit Ⅰ購(gòu)于ABI美國(guó)公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于TaKaRa公司；TFAP2A抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，NPHS2抗體購(gòu)自Proteintech公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。TFAP2A siRNA（上游序列5′-CCUGCUCACAUCACUAGUATT-3′，下游序列5′-UACUAGUGAUGUGAGCAGGTT-3′）、control siRNA（序列5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′）及空白對(duì)照（序列5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′）由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成及純化；基因引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2 腎臟疾病與正常腎組織中NPHS2、TFAP2A表達(dá)差異分析 基于GEO數(shù)據(jù)庫(kù)及GEO Profiles數(shù)據(jù)集，分析腎透明細(xì)胞癌組織與正常腎組織中NPHS2、TFAP2A的表達(dá)差異。GEO Profiles數(shù)據(jù)集調(diào)取腎透明細(xì)胞癌組織NPHS2、TFAP2A的表達(dá)量，GraphPad prism6.0統(tǒng)計(jì)軟件分析NPHS2、TFAP2A表達(dá)量改變。

1.3 含NPHS2基因5′側(cè)翼區(qū)域重組報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)尋找NPHS2基因啟動(dòng)子序列，擴(kuò)增-519 bp ～ +20 bp區(qū)域片段，載體質(zhì)粒與擴(kuò)增片段重組純化，切膠回收。重組質(zhì)粒為經(jīng)MluⅠ及XhoⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切消化的產(chǎn)物，在1%瓊脂糖凝膠電泳時(shí)出現(xiàn)兩條特異性條帶，大小分別約4.8、500 bp。

1.4 TFAP2A結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過在線生物信息學(xué)軟件NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查找NPHS2基因啟動(dòng)子序列，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)定義為+1，尋找NPHS2轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游的啟動(dòng)子區(qū)，JASPAR軟件預(yù)測(cè)NPHS2基因-519 bp ～ +20 bp啟動(dòng)子區(qū)的TFAP2A轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

1.5 TFAP2A對(duì)NPHS2啟動(dòng)子水平的調(diào)控作用觀察 將HEK-293T細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2 ～ 3 d傳代1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，當(dāng)細(xì)胞增長(zhǎng)達(dá)70% ～ 80%融合度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。驗(yàn)證pGL3-519 bp ～ +20 bp啟動(dòng)子活性實(shí)驗(yàn)中，pGL3-519 bp/+20 bp及對(duì)照pGL3-Basic質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后測(cè)定螢光素酶的活性。干擾實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照siRNA組細(xì)胞轉(zhuǎn)染control siRNA，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染TFAP2A siRNA（濃度分別為5、10、15 pmol/μL）。過表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照siRNA組細(xì)胞轉(zhuǎn)染pENTER，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染TFAP2A過表達(dá)質(zhì)粒（質(zhì)量濃度分別為50、100、300 ng/mL）。按LipofectamineTM3000使用說明書操作。轉(zhuǎn)染24 h后按照雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行螢光素酶活性分析。

1.6 TFAP2A對(duì)NPHS2 mRNA及蛋白的調(diào)控作用觀察 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK-293T細(xì)胞接種于12孔板，培養(yǎng)24 h，待70% ～ 80%融合度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞分為對(duì)照組、干擾組及過表達(dá)組，分別轉(zhuǎn)染control siRNA、TFAP2A siRNA及TFAP2A過表達(dá)質(zhì)粒，按LipofectamineTM3000使用說明書操作。

1.6.1 TFAP2A、NPHS2 mRNA檢測(cè) 培養(yǎng)24 h后提取細(xì)胞總RNA，放置冰上，測(cè)RNA濃度，-80 ℃保存。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TFAP2A、NPHS2 mRNA。TFAP2A基因上游引物序列為5′-ATTGACCTACAGTGCCCAGC-3′，下游引物序列為5′-TCCATGAAAATGCTTTGGAA-3′；NPHS2基因上游引物序列為5′-ACCTTTTCATGAGGTTGCCTTGG-3′，下游引物序列為5′-TTCTGCAGCAATCATCCGCA-3′；內(nèi)參GAPDH基因上游引物序列為5′-ATGACATCAAGAAGGTGGTG-3′，下游引物序列為5′-CATACCAGGAAATGAGCTTG-3′。反應(yīng)條件為95 °C預(yù)變性10 min，95 °C 15 s，60 °C 30 min，72 ℃ 30 s，共40次循環(huán)；95 °C 15 s，60 °C 1 min，95 °C 15 s。以2-ΔΔCt表示目的基因相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，求均值。

1.6.2 NPHS2蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。培養(yǎng)48 h抽提各組總蛋白，加入5×loading buffer，震蕩離心，電泳分離，快速轉(zhuǎn)膜。5%奶粉封閉2 h，取出膜，加入一抗，4 ℃搖床過夜。取出PVDF膜迅速置入TBST中，37 ℃搖床30 min，每10 min換TBST，共洗滌3次。加入適量辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG后封膜，37 ℃搖床2 h。將PVDF膜取出迅速置入TBST中，37 ℃搖床30 min，每10 min換TBST，共洗滌3次。用濾紙吸干后置于塑料膜上，加入曝光液，曝光。Image Lab軟件分析蛋白表達(dá)量數(shù)據(jù)，GraphPad prism6.0軟件分析蛋白相對(duì)定量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad prism6.0軟件。計(jì)量資料以表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因表達(dá)改變 聚類分析圖中，紅色代表高表達(dá)基因，綠色代表低表達(dá)基因；基因表達(dá)火山圖紅色表示表達(dá)量上升，藍(lán)色表示表達(dá)量下降。腎透明細(xì)胞癌組織與正常組織相比NPHS29（分別為1 270 ± 530.9、5 650 ± 761.8）、TFAP2A（分別為6.93 ± 0.17、7.56 ± 0.11）相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平降低。詳見OSID碼圖1。

圖1 TFAP2A轉(zhuǎn)錄因子在NPHS2基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-519 bp ～ +20 bp區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)

2.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建及TFAP2A結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)情況 重組質(zhì)粒經(jīng)MluI及XhoI限制性內(nèi)切酶雙酶切，在1%瓊脂糖凝膠電泳時(shí)出現(xiàn)兩條特異性條帶，大小分別為4.8、500 bp，提示片段已成功插入載體，含NPHS2基因5′側(cè)翼區(qū)域的重組報(bào)告質(zhì)粒構(gòu)建成功。NPHS2基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-519 bp ～ +20 bp區(qū)域包含兩個(gè)了TFAP2A轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，第一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)位于-301 bp ～ -309 bp，第二個(gè)結(jié)合位點(diǎn)位于-422 bp ～ -432 bp。見圖1。

2.3 TFAP2A對(duì)NPHS2啟動(dòng)子水平的調(diào)控作用對(duì)照siRNA組及轉(zhuǎn)染5、10、15 pmol/μL TFAP2A siRNA的實(shí)驗(yàn)組熒光素酶活性分別為1.00 ± 0.23、6.78 ± 0.83、7.55 ± 0.68、6.63 ± 1.29；對(duì)照siRNA組及轉(zhuǎn)染50、100、300 ng/mL TFAP2A過表達(dá)質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組熒光素酶活性分別為1.00 ± 0.16、0.94 ±0.14、1.05 ± 0.12、0.53 ± 0.03。與對(duì)照siRNA組相比，轉(zhuǎn)染5、10、15 pmol/μL TFAP2A siRNA的細(xì)胞NPHS2啟動(dòng)子熒光素酶活性均增強(qiáng)，轉(zhuǎn)染300 ng/mL TFAP2A過表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞NPHS2啟動(dòng)子熒光素酶活性降低（P均＜0.05）。

2.4 TFAP2A對(duì)NPHS2 mRNA及蛋白表達(dá)的調(diào)控作用 干擾組TFAP2A mRNA表達(dá)低于對(duì)照組，NPHS2 mRNA及蛋白表達(dá)高于對(duì)照組；過表達(dá)組TFAP2A mRNA表達(dá)高于對(duì)照組，NPHS2 mRNA及蛋白表達(dá)低于對(duì)照組（P均＜0.05）。見表1 ～ 2。

表1 干擾組與對(duì)照組TFAP2A mRNA、NPHS2 mRNA、NPHS2蛋白表達(dá)比較（）

表1 干擾組與對(duì)照組TFAP2A mRNA、NPHS2 mRNA、NPHS2蛋白表達(dá)比較（）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05。

組別干擾組對(duì)照組NPHS2蛋白2.02 ± 0.20*1.00 ± 0.18 TFAP2A mRNA 0.52 ± 0.11*1.00 ± 0.06 NPHS2 mRNA 2.87 ± 0.43*1.01 ± 0.11

表2 過表達(dá)組與對(duì)照組TFAP2A mRNA、NPHS2 mRNA、NPHS2蛋白表達(dá)比較（）

表2 過表達(dá)組與對(duì)照組TFAP2A mRNA、NPHS2 mRNA、NPHS2蛋白表達(dá)比較（）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05。

組別過表達(dá)組對(duì)照組0.33 ± 0.08*1.00 ± 0.01 2.40 ± 0.24*1.00 ± 0.06 0.58 ± 0.04*1.01 ± 0.11 NPHS2蛋白TFAP2A mRNANPHS2 mRNA

3 討論

引起FSGS的原因包括遺傳因素、病毒相關(guān)性疾病和藥物等，但關(guān)于原發(fā)性FSGS發(fā)病機(jī)制充分有力的研究仍然很少，基因編輯及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究甚少，有待進(jìn)一步研究。TFAP2A是AP-2轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一。AP-2蛋白可以正向或負(fù)向調(diào)節(jié)參與生理病理過程的許多關(guān)鍵基因的啟動(dòng)子活性，在腎臟發(fā)育生物學(xué)功能方面起重要作用。AP-2轉(zhuǎn)錄因子目前正在腎臟發(fā)育中得到廣泛研究，并且它們可能對(duì)某些腎臟疾病具有診斷價(jià)值，還可能與病因有關(guān)，因此有可能作為腎臟疾病治療的新靶點(diǎn)。

啟動(dòng)子是轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的DNA區(qū)域，其中整合了轉(zhuǎn)錄調(diào)控信號(hào)以觸發(fā)大分子組裝體的形成并確定轉(zhuǎn)錄起始。在啟動(dòng)子周圍，DNA序列、染色質(zhì)重構(gòu)、啟動(dòng)前復(fù)合物、介質(zhì)復(fù)合物、組蛋白變體、核小體占據(jù)和翻譯后組蛋白修飾是已知獨(dú)立和協(xié)同運(yùn)作的調(diào)節(jié)元件。DNA結(jié)合蛋白（如轉(zhuǎn)錄因子）在維持增強(qiáng)子—啟動(dòng)子接觸方面具有重要作用［12］。復(fù)雜生物體的發(fā)育很大程度上取決于基因組DNA包含的遺傳信息［10］。受調(diào)控的基因表達(dá)對(duì)于所有真核細(xì)胞和生物體的完整性至關(guān)重要，在細(xì)胞分化和代謝中的核心作用被破壞會(huì)導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生。在真核生物中，染色質(zhì)的可及性、基因定位和mRNA轉(zhuǎn)錄物生成是由復(fù)雜的分子機(jī)制控制的?？刂妻D(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)信號(hào)可以在基因（編碼）、啟動(dòng)子（接近/鄰近編碼）和增強(qiáng)子（遠(yuǎn)端）區(qū)域內(nèi)單獨(dú)或組合出現(xiàn)［13］。增強(qiáng)子、啟動(dòng)子和CCCTC結(jié)合因子位點(diǎn)之間存在高度點(diǎn)狀接觸，轉(zhuǎn)錄因子在維持增強(qiáng)子和啟動(dòng)子之間的接觸方面發(fā)揮了重要作用［14］。

本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，TFAP2A、NPHS2在腎透明細(xì)胞癌組織中表達(dá)量有改變，且兩者之間存在相關(guān)性，為進(jìn)一步研究?jī)烧叩恼{(diào)控關(guān)系提供了理論依據(jù)。本研究構(gòu)建了NPHS2啟動(dòng)子熒光素酶基因報(bào)告重組質(zhì)粒，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、熒光素酶活性檢測(cè)，證實(shí)pGL3-519 bp ～ +20 bp具有啟動(dòng)子活性。通過JASPAR軟件預(yù)測(cè)NPHS2啟動(dòng)子區(qū)含有2個(gè)TFAP2A轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，第一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)位于-301 bp ～ -309 bp，第二個(gè)結(jié)合位點(diǎn)位于-422 bp～ -432 bp。本研究觀察了TFAP2A對(duì)NPHS2在啟動(dòng)子和基因蛋白表達(dá)水平的調(diào)控作用，結(jié)果顯示，與對(duì)照siRNA組相比，轉(zhuǎn)染5、10、15 pmol/μL TFAP2A siRNA的細(xì)胞NPHS2啟動(dòng)子熒光素酶活性均增強(qiáng)，轉(zhuǎn)染300 ng/mL TFAP2A過表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞NPHS2啟動(dòng)子熒光素酶活性降低，表明在TFAP2A對(duì)NPHS2基因啟動(dòng)子水平具有調(diào)控作用；干擾組TFAP2A mRNA表達(dá)低于對(duì)照組，NPHS2 mRNA及蛋白表達(dá)高于對(duì)照組；過表達(dá)組TFAP2A mRNA表達(dá)高于對(duì)照組，NPHS2 mRNA及蛋白表達(dá)低于對(duì)照組，提示TFAP2A可下調(diào)NPHS2 mRNA及NPHS2蛋白的表達(dá)，與相關(guān)研究結(jié)果一致［15-16］。

本研究證明轉(zhuǎn)錄因子TFAP2A可以調(diào)控足細(xì)胞相關(guān)基因NPHS2表達(dá)，增加了調(diào)控足細(xì)胞重要基因的轉(zhuǎn)錄因子成員。也有文獻(xiàn)報(bào)道其他轉(zhuǎn)錄因子也可以調(diào)控足細(xì)胞相關(guān)基因，如FOXO3a積累和激活可加速氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。NPHS2啟動(dòng)子區(qū)的確定有利于有關(guān)疾病的基因治療。大部分基因突變或變異位點(diǎn)位于非編碼區(qū)，全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)的突變可能在致病基因的非編碼調(diào)控區(qū)，包括啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)處，也可能在另一條染色體上看似無關(guān)的另一基因區(qū)域。已有文獻(xiàn)報(bào)道，局部注射單導(dǎo)核糖核酸指引的CRISPR相關(guān)蛋白9融合腺嘌呤剪輯編輯器CjABE的腺病毒相關(guān)病毒，可抑制TRET啟動(dòng)子突變的神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)［17］。還有研究表明，CRISPR介導(dǎo)的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子激活可治療由單倍體不足引起的肥胖［18］。

綜上所述，NPHS2啟動(dòng)子-519 bp ～ +20 bp區(qū)域存在潛在的TFAP2A轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，TFAP2A可下調(diào)NPHS2的啟動(dòng)子活性、mRNA及蛋白表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)為揭示NPHS2基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為FSGS治療相關(guān)研究提供了新的思路。