王平，汪洋，鞏雪敏，薛艷

湖北省婦幼保健院成人內(nèi)科，武漢430070

糖尿病腎病為常見的糖尿病并發(fā)癥，治療主要是控制血糖、血壓及血脂，但治療效果不佳［1-2］。在糖尿病腎病發(fā)病進程中，足細胞損傷起重要的推動作用［3］。足細胞損傷包括足突融合、足細胞活力降低、異常遷移及上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）激活等，足細胞病理改變是糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，也是藥物治療的重要靶點［4-5］。丙泊酚是一種可控性好、效果佳的靜脈全身麻醉藥物，也可用于機械通氣狀態(tài)下的鎮(zhèn)靜治療及持續(xù)重癥癲癇患者的麻醉。研究表明，丙泊酚有抗炎癥損傷作用，還可增強高糖環(huán)境下心肌細胞活力［6-7］，丙泊酚誘導還能有效改善糖尿病患者的高凝狀態(tài)，降低血清炎癥因子水平，保護細胞免疫功能［8-9］，但丙泊酚對高糖環(huán)境下糖尿病腎病足細胞的作用及其相關(guān)機制尚不清楚。核因子κB（NF-κB）與多種疾病進展密切相關(guān)。NF-κB受體激活劑可以通過促進腎小球氧化應激和促炎細胞因子的產(chǎn)生從而誘導糖尿病腎病發(fā)病［10］。有研究表明，丙泊酚可通過抑制NF-κB信號通路從而減輕腸上皮細胞炎癥損傷［11］。2022年2月—2023年2月，本研究觀察了丙泊酚對高糖誘導的足細胞損傷的干預作用，并基于NF-κB信號通路探討相關(guān)機制，為糖尿病腎病的體外研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要實驗材料 人腎小球足細胞（HGPC）接種于DMEM-F12培養(yǎng)基（含10% FBS及1%的青霉素—鏈霉素），于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每隔2 ～ 3 d更換培養(yǎng)液，待貼壁細胞密度達80%時傳代，取第4代對數(shù)期細胞用于實驗，分組前以無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。丙泊酚、D-葡萄糖、NF-κB信號通路抑制劑BAY 11-7082購自上海源葉生物科技有限公司，NF-κB信號通路激活劑Prostratin購自阿拉丁公司，胎牛血清（FBS）、DMEM-F12購自美國Gibco公司，5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷（EdU）增殖測定試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司，CCK-8試劑盒購自上海翌圣生物科技有限公司，腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-6、IL-1β ELISA試劑盒購自泉州市睿信生物科技有限公司，RIPA裂解液購自美國ABW公司，鼠抗人NF-κB p65、p-NF-κB p65、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、β-actin及堿性磷酸酶標記的山羊抗鼠IgG（二抗）購自美國CST公司。細胞培養(yǎng)箱（RYX-150型）購自天津泰斯特儀器有限公司，酶標儀（Multiskan FC型）購自美國Thermo公司，倒置熒光顯微鏡（MF52-N型）購自廣州市明美光電技術(shù)有限公司，凝膠成像系統(tǒng)（Champ Gd5000型）購自北京森西賽智科技有限公司。

1.2 丙泊酚作用濃度篩選及細胞分組處理 取第4代對數(shù)期HGPC細胞，調(diào)整密度為2×105/mL，接種到96孔板。將HGPC細胞分為正常糖組（加入5 mmol/L D-葡萄糖）、高糖組（加入30 mmol/L D-葡萄糖）及丙泊酚組（加入30 mmol/L D-葡萄糖+25、50、100 μmol/L丙泊酚），干預24 h后加入CCK-8溶液10 μL孵育2 h，使用酶標儀測定450 nm波長處的光密度（OD）值，計算細胞活力［（OD高糖組或?qū)嶒灲M-OD空白組）/（OD正常糖組-OD空白組）×100%］。正常糖組、高糖組及25、50、100 μmol/L丙泊酚組細胞活力分別為100.00% ±1.91%、30.52% ± 1.93%、40.80% ± 2.35%、65.65% ± 1.91%、83.01% ± 2.88%，高糖組細胞活力低于正常糖組，50、100 μmol/L丙泊酚組細胞活力高于高糖組，選取細胞活力最佳的100 μmol/L 丙泊酚進行后續(xù)實驗。而后取對數(shù)期生長的細胞分為正常糖組、高糖組、丙泊酚組、抑制劑組、丙泊酚+抑制劑組及丙泊酚+激活劑組，正常糖組給予5 mmol/L D-葡萄糖處理；其余組給予30 mmol/L D-葡萄糖處理，丙泊酚組在此基礎(chǔ)上給予100 μmol/L丙泊酚，抑制劑組給予1 μmol/L BAY 11-7082，丙泊酚+抑制劑組給予100 μmol/L丙泊酚和1 μmol/L BAY 11-7082，丙泊酚+激活劑組給予100 μmol/L丙泊酚和1 μmol/L Prostratin。每組設置3個重復。干預24 h后進行后續(xù)指標測定。

1.3 細胞形態(tài)觀察 取各組干預24 h的細胞，倒置顯微鏡觀察HGPC細胞形態(tài)。

1.4 細胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β檢測 采用ELISA法檢測細胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β，按試劑盒說明書操作。

有鑒于此，在小學數(shù)學教學過程中滲透德育的時候，教師要對課堂教學進行充分的預設，預設課堂教學中的各種困境與生成。并以此為基礎(chǔ)，找準德育滲透的切入點，“見縫插針”式地滲透德育。

1.6 細胞遷移能力檢測 取各組干預24 h的細胞，胰蛋白酶消化，離心，無血清培養(yǎng)基對細胞重懸，制成懸液，調(diào)整濃度為1×105/mL。將Transwell小室放入24孔板中，取200 μL細胞懸液加入Transwell上室，下室加入600 μL培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出下室，棄上清，PBS洗滌3次，加入4%甲醇進行固定，晾干，0.1%結(jié)晶紫染色，10 min后，PBS洗滌3次，將Transwell小室置于顯微鏡上，每孔隨機選5個不同區(qū)域，在顯微鏡下觀察拍照，Image J圖像分析軟件計算遷移細胞數(shù)。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS23.0軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時，兩兩比較采用Dunnett′s t檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

文創(chuàng)產(chǎn)品即文化創(chuàng)意產(chǎn)品，簡單地說它就是源于文化主題并經(jīng)由創(chuàng)意轉(zhuǎn)化的具有市場價值的產(chǎn)品，以往對城市文創(chuàng)產(chǎn)品的研究較少。城市結(jié)合自身文化資源的文化特征與文化符號，可以創(chuàng)造性地設計開發(fā)出一系列城市文創(chuàng)產(chǎn)品，在將產(chǎn)品銷售給顧客的同時推動當?shù)匚幕目焖倨占啊榱烁玫剡M行城市文創(chuàng)產(chǎn)品營銷，需要注意以下一些事項。

1.7 細胞中EMT及NF-κB信號通路相關(guān)蛋白檢測 取各組干預24 h的細胞，加入細胞裂解液，置冰上30 min，之后離心取上清，按照每孔20 μg蛋白樣品量上樣。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，200 mA恒流轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入稀釋后的一抗NF-κB p65（1∶2 000）、p-NF-κB p65（1∶1 000）、E-cadherin（1∶5 000）、Vimentin（1∶20 000）、N-cadherin（1∶5 000）、β-actin（1∶5 000），4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次。加入堿性磷酸酶標記山羊抗鼠IgG二抗稀釋液，孵育2 h，棄液，TBST洗滌3次。凝膠成像系統(tǒng)中拍照記錄，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白相對表達量。

1.5 細胞增殖率測算 取各組干預24 h的細胞，EdU染色，去除細胞培養(yǎng)液，加入4%多聚甲醛，15 min后牛血清白蛋白（BSA）洗滌，用0.3%聚乙二醇辛基苯基醚去除BSA，靜置10 min，洗滌3次；每孔加Click反應液200 μL，室溫避光孵育30 min，洗滌3次；加入Hoechst染液，孵育10 min，用3% BSA洗滌3次；裝片，隨機選取3個視野，顯微鏡下拍照，用Image J軟件處理圖片，分析并計算細胞增殖率。細胞增殖率=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

2 結(jié)果

糖尿病腎病起病較為隱匿，易發(fā)展成為終末期腎病，嚴重危害患者健康。隨著對糖尿病腎病的研究不斷深入，足細胞生物功能障礙被認為是推動糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的重要原因之一。足細胞是一種高度特化的細胞，功能多樣，其受到外部刺激發(fā)生損傷后出現(xiàn)活力降低、異常遷移及EMT等現(xiàn)象，最終導致疾病的發(fā)生［12］。因此，研究足細胞生物學功能可為臨床治療糖尿病腎病提供一定的理論依據(jù)。

2.2 各組細胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較 見表1。

表1 各組細胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較（）

表1 各組細胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較（）

注：與正常糖組相比，*P＜0.05；與高糖組相比，#P＜0.05；與丙泊酚組相比，&P＜0.05。

組別正常糖組高糖組丙泊酚組抑制劑組丙泊酚+抑制劑組丙泊酚+激活劑組TNF-α 2.43 ± 0.48 9.23 ± 0.11*5.23 ± 0.10#5.01 ± 0.03#3.23 ± 0.10&7.95 ± 0.06&TNF-α 2.43 ± 0.48 9.23 ± 0.11*5.23 ± 0.10#5.01 ± 0.03#3.23 ± 0.10&7.95 ± 0.06&IL-6 4.13 ± 0.15 12.63 ± 0.31*7.62 ± 0.32#7.43 ± 0.22#5.25 ± 0.14&10.74 ± 0.41&IL-1β 3.24 ± 0.13 10.97 ± 0.19*6.27 ± 0.12#6.25 ± 0.08#3.98 ± 0.09&9.53 ± 0.21&

丙泊酚是一種臨床常用麻醉藥，可減輕細胞炎癥，增強細胞活力。研究表明，丙泊酚聯(lián)合阿托伐他汀能夠抑制核苷酸寡聚結(jié)構(gòu)域樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3炎癥小體，減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷［13］；對無抽搐電休克治療的老年精神分裂患者使用丙泊酚復合依托咪酯進行全麻誘導安全有效，能延長腦癲癇運動發(fā)作時間，減少對認知功能的影響和不良反應的發(fā)生［14］。吳雙等［15］研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可增強缺氧復氧條件下腸上皮細胞活力。LIU等［16］研究發(fā)現(xiàn)，異丙酚可能通過上調(diào)肺組織SIRT1蛋白表達，通過抑制焦亡來減輕急性肺損傷。另有研究表明，丙泊酚可減輕糖尿病大鼠腎缺血再灌注損傷［17］，還可通過抑制Wnt信號誘導的EMT降低乳腺癌細胞的侵襲遷移能力［18］。

2.4 各組遷移細胞數(shù)比較 正常糖組、高糖組、丙泊酚組、抑制劑組、丙泊酚+抑制劑組、丙泊酚+激活劑組遷移細胞數(shù)分別為100.33 ± 2.52、447.67 ±5.03、262.33 ± 3.51、250.67 ± 12.74、137.33 ±5.69、351.67 ± 2.89。高糖組遷移細胞數(shù)高于正常糖組，丙泊酚組、抑制劑組遷移細胞數(shù)低于高糖組（P均＜0.05）；與丙泊酚組比較，丙泊酚+抑制劑組遷移細胞數(shù)降低，丙泊酚+激活劑組細胞遷移細胞數(shù)升高（P均＜0.05）。見OSID碼圖3。

2.5 各組細胞中EMT及NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達比較 高糖組E-cadherin蛋白表達低于正常糖組，N-cadherin、Vimentin、p-NF-κB p65蛋白表達高于正常糖組（P均＜0.05）；丙泊酚組和抑制劑組E-cadherin蛋白表達高于高糖組，N-cadherin、Vimentin、p-NF-κB p65蛋白表達低于高糖組（P均＜0.05）；與丙泊酚組相比，丙泊酚+抑制劑組E-cadherin蛋白表達升高，N-cadherin、Vimentin、p-NF-κB p65蛋白表達降低，丙泊酚+激活劑組E-cadherin蛋白表達減少，N-cadherin、Vimentin、p-NF-κB p65蛋白表達升高（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組細胞中EMT及NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達比較（）

表2 各組細胞中EMT及NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達比較（）

注：與正常糖組相比，*P＜0.05；與高糖組相比，#P＜0.05；與丙泊酚組相比，&P＜0.05。

組別正常糖組高糖組丙泊酚組抑制劑組丙泊酚+抑制劑組丙泊酚+激活劑組p-NF-κB p65 0.23 ± 0.02 0.65 ± 0.03*0.35 ± 0.03#0.33 ± 0.02#0.19 ± 0.03&0.58 ± 0.02&E-cadherin 0.77 ± 0.02 0.21 ± 0.02*0.45 ± 0.02#0.43 ± 0.02#0.65 ± 0.02&0.26 ± 0.02&N-cadherin 0.21 ± 0.02 0.75 ± 0.02*0.35 ± 0.02#0.33 ± 0.02#0.13 ± 0.02&0.54 ± 0.01&Vimentin 0.22 ± 0.01 0.84 ± 0.02*0.46 ± 0.01#0.41 ± 0.02#0.17 ± 0.02&0.65 ± 0.01&NF-κB p65 0.73 ± 0.02 0.75 ± 0.04*0.77 ± 0.02#0.75 ± 0.02#0.73 ± 0.02&0.77 ± 0.02&

3 討論

2.1 各組細胞形態(tài)比較 干預24 h后，正常糖組細胞胞體呈透明狀，樹突狀，相鄰突起相互交叉連接；高糖組細胞足突間交叉連接減少，胞體縮小，細胞間隔增大；丙泊酚組和抑制劑組足細胞足突較高糖組增多，胞體變大，細胞間隔縮??；丙泊酚+抑制劑組足細胞足突較丙泊酚組增多，胞體變大，細胞間隔進一步縮??；丙泊酚+激活劑組足細胞足突較丙泊酚組足突減少，胞體變小，細胞間隔進一步增加。見OSID碼圖1。

2.3 各組細胞增殖率比較 正常糖組、高糖組、丙泊酚組、抑制劑組、丙泊酚+抑制劑組、丙泊酚+激活劑組細胞增殖率分別為54.48% ± 0.68%、9.19% ±0.29%、32.2% ± 0.89%、31.14% ± 0.83%、48.7% ±0.65%、19.39% ± 0.62%。高糖組細胞增殖率低于正常糖組，丙泊酚組、抑制劑組細胞增殖率高于高糖組（P均＜0.05）；與丙泊酚組比較，丙泊酚+抑制劑組細胞增殖率升高，丙泊酚+激活劑組細胞增殖率降低（P均＜0.05）。見OSID碼圖2。

兔抗人Glut-1多克隆抗體、鼠抗人HIF-1α單抗、兔抗人p-Akt多克隆抗體及兔抗人PI3K-p85亞單位多克隆抗體(均由上海賽默飛世爾公司生產(chǎn))。

觀察組經(jīng)護理干預后無痛、輕度疼痛例數(shù)明顯多于對照組,中、重度疼痛例數(shù)明顯少于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)

目前，關(guān)于丙泊酚在糖尿病腎病中的作用鮮有報道。本研究通過高糖刺激足細胞建立體外糖尿病腎病模型，觀察丙泊酚對足細胞損傷的干預作用。本研究結(jié)果顯示，與正常糖組比較，高糖組細胞足突間交叉連接減少，胞體縮小，細胞間隔增大，細胞TNF-α、IL-6、IL-1β、EMT相關(guān)蛋白表達及遷移細胞數(shù)增加，細胞增殖率降低；與高糖組比較，丙泊酚組和抑制劑組足細胞足突較高糖組增多，胞體變大，細胞間隔縮小，細胞TNF-α、IL-6、IL-1β、EMT相關(guān)蛋白表達及遷移細胞數(shù)減少，細胞增殖率升高。這提示丙泊酚可維持高糖刺激的足細胞形態(tài)，促進細胞增殖，抑制細胞炎癥、遷移及EMT。

NF-κB信號通路是由NF-κB、NF-κB受體及免疫調(diào)節(jié)蛋白等組成的高度保守的信號轉(zhuǎn)導通路，參與細胞炎癥反應、增殖及遷移等多種生物學進程［19］。研究發(fā)現(xiàn)，G蛋白偶聯(lián)受體C5B蛋白可通過抑制NF-κB信號通路，減輕腎小球炎癥反應，促進細胞增殖［20］；小檗堿可能通過AKT/NF-κB信號通路減輕高糖誘導的足細胞損傷、抑制足細胞凋亡、減弱足細胞遷移能力［21］。另有研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可通過阻斷NF-κB信號通路抑制內(nèi)毒素誘導的大鼠肺泡巨噬細胞活力及炎癥因子釋放［22］。但丙泊酚是否可通過NF-κB信號通路影響糖尿病腎病足細胞的功能尚未可知。本研究結(jié)果顯示，與正常糖組比較，高糖組細胞p-NF-κB p65蛋白表達升高；與高糖組比較，丙泊酚組和抑制劑組p-NF-κB p65蛋白表達降低；與丙泊酚組比較，丙泊酚+抑制劑組足細胞足突增多，胞體變大，細胞間隔縮小，細胞TNF-α、IL-6、IL-1β、N-cadherin、Vimentin、p-NF-κB p65蛋白表達及遷移細胞數(shù)降低，E-cadherin表達及細胞增殖率升高，丙泊酚＋激活劑組與丙泊酚+抑制劑組趨勢相反。這提示丙泊酚可能是通過阻斷NF-κB信號通路，維持高糖刺激下足細胞形態(tài)，促進細胞增殖，抑制細胞炎癥、遷移及EMT。

在材料、生物、環(huán)境等科學領(lǐng)域，構(gòu)效關(guān)系研究在宏觀、介觀及微觀層面展開，本文討論的是分子尺度的化合物構(gòu)效關(guān)系。

綜上，丙泊酚可維持高糖誘導的足細胞正常形態(tài)，減輕炎癥反應，促進細胞增殖，抑制細胞遷移和EMT，這些作用可能與抑制NF-κB信號轉(zhuǎn)導通路有關(guān)。下一步可深入探究丙泊酚干預糖尿病腎病足細胞損傷的其他作用機制，為丙泊酚的臨床應用提供數(shù)據(jù)支撐。但本研究為臨床前研究，尚未進行動物實驗驗證，且丙泊酚作為麻醉劑和鎮(zhèn)定劑，在治療糖尿病腎病的同時可能會由于過量使用而導致心臟或呼吸抑制等問題，其適用劑量仍需要進一步探索。