劉子菁，從靜文，程 卓，牟 琳，吳汐柔，王子豪，楊俊顏，信小兵 （新疆第二醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，新疆 克拉瑪依 834000）

鐵皮石斛為蘭科植物鐵皮石斛Dendrobiumoffici-naleKimura et Migo的干燥莖，主要分布在我國(guó)安徽、四川、浙江、云南、江西等地。該藥主要含有多糖、生物堿、氨基酸和微量元素等化學(xué)成分，具有抗腫瘤、抗衰老、抗急性肺損傷（acute lung injury，ALI）、擴(kuò)張血管和抗血小板凝集等多種藥理作用[1]。目前，國(guó)內(nèi)外多糖的提取方法很多，主要包括浸漬法、回流法、超聲法、微波法、酶解法、閃式提取法、凍融提取法等，但單一提取法存在提取率低、工藝復(fù)雜、提取物雜質(zhì)多等弊端[2]。

ALI是一種由各種肺內(nèi)（吸入、注射、感染及創(chuàng)傷等）或肺外（休克、膿毒癥等）致病因素導(dǎo)致肺泡結(jié)構(gòu)受損而引發(fā)肺部彌散性炎癥和水腫反應(yīng)的呼吸系統(tǒng)疾病。目前，臨床尚無(wú)治療ALI 的特效藥物，故其病死率維持在較高水平，整體病死率高達(dá)40%[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，ALI的病理學(xué)機(jī)制主要與肺組織局部過(guò)度的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān)[3―4]。多糖作為鐵皮石斛的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化作用，且毒性極低[5―6]?；诖?，本研究以鐵皮石斛為原料，采用超聲輔助熱水浸漬法提取鐵皮石斛多糖，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，并考察鐵皮石斛多糖對(duì)小鼠ALI 的影響，為鐵皮石斛多糖的提取及藥效研究提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括UV1802G型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（天津冠澤科技有限公司）、FW135 型粉碎機(jī)（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）、LEICARM2245 型石蠟切片機(jī)（常州市雅博電子設(shè)備有限公司）、Axio-ImagerA2型蔡司正置熒光顯微鏡（北京博瑞斯科技有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

鐵皮石斛藥材購(gòu)自南寧市藥材市場(chǎng)，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院譚勇教授鑒定為蘭科植物鐵皮石斛D.officinaleKimura et Migo 的干燥莖；醋酸潑尼松片（批號(hào)20220313，規(guī)格5 mg）購(gòu)自上海金不換蘭考制藥有限公司；濃硫酸（批號(hào)20190301）購(gòu)自新疆德瑞生物有限公司；苯酚（分析純）購(gòu)自天津市風(fēng)船化學(xué)世紀(jì)科技有限公司；D（+）-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)110833-201906，純度≥98%）和脂多糖對(duì)照品（批號(hào)20220208，純度≥98%）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（批號(hào)20190608）、Masson 染色試劑盒（批號(hào)20180302）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明小鼠90 只，雄性，SPF 級(jí)，體重20～22 g，購(gòu)自河南斯克貝斯生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（豫）2020-0005。本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，倫理審批號(hào)為IACUC-20220728-10。

2 方法與結(jié)果

2.1 鐵皮石斛多糖的提取

稱取鐵皮石斛藥材5 g，水洗后置于60 ℃烘箱中烘干至恒重，粉碎，過(guò)40 目篩；粗粉加入10 倍量水，于70 ℃下以700 W 功率超聲浸提，抽濾，濾液濃縮至原液的1/3，再加入3 倍量的無(wú)水乙醇，于4 ℃下靜置12 h 后濾過(guò)，收集沉淀，置于50 ℃烘箱中烘干，得多糖粉末并按下式計(jì)算鐵皮石斛多糖得率：多糖得率（%）＝多糖粉末質(zhì)量/鐵皮石斛質(zhì)量×100%。

2.2 鐵皮石斛多糖含量和提取率測(cè)定

2.2.1 多糖含量

采用苯酚-硫酸法進(jìn)行測(cè)定[7]。精確稱取D（+）-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品50 mg，加水定容至50 mL 容量瓶中，得1 mg/mL 的無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別準(zhǔn)確量取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL 于試管中，加水定容至2 mL。吸取5%苯酚溶液1 mL，分別加到6只試管中，搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻，靜置5 min，于沸水中加熱15 min，取出冷卻至室溫。采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)于490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A）值。以無(wú)水葡萄糖質(zhì)量濃度（c）為橫坐標(biāo)、吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A＝14.707c+0.028 7（R2＝0.999 2）。方法學(xué)考察符合2020年版《中國(guó)藥典》（四部）的相關(guān)要求。

2.2.2 多糖提取率

精確稱取鐵皮石斛多糖粉末2.0 g，加水定容至100 mL 容量瓶中，搖勻，準(zhǔn)確量取該多糖待檢測(cè)溶液1.0 mL，加水定容至2 mL，加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻，靜置5 min，于沸水中加熱15 min，取出冷卻至室溫。采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定A值，代入“2.2.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算多糖質(zhì)量濃度，并按下式計(jì)算鐵皮石斛多糖提取率：多糖提取率＝提取液中多糖質(zhì)量濃度×提取體積/鐵皮石斛多糖粉末質(zhì)量×100%。

2.3 鐵皮石斛多糖提取工藝優(yōu)化

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，料液比、提取時(shí)間、提取溫度均能顯著影響鐵皮石斛多糖的提取率，因此本研究選擇料液比、提取時(shí)間、提取溫度為因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。分別稱取鐵皮石斛藥材0.2 g，共5 份，按“2.1”項(xiàng)下方法操作。其中，料液比單因素實(shí)驗(yàn)條件如下：以700 W功率超聲15 min，提取溫度為70 ℃，提取2 次，提取時(shí)間為2 h，設(shè)置料液比（g/mL，下同）分別為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40；提取時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn)條件如下：以700 W功率超聲15 min，提取溫度為70 ℃，提取2 次，料液比為1∶30，設(shè)置提取時(shí)間分別為1、2、3、4、5 h；提取溫度單因素實(shí)驗(yàn)條件如下：以700 W 功率超聲15 min，提取時(shí)間為2 h，提取2次，料液比為1∶30，設(shè)置提取溫度分別為50、60、70、80、90 ℃?？疾旄饕蛩貙?duì)鐵皮石斛多糖提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 料液比、提取時(shí)間、提取溫度對(duì)鐵皮石斛多糖提取率的影響

由圖1A 可以看出，鐵皮石斛多糖提取率隨料液比的改變呈現(xiàn)波浪形變化，當(dāng)料液比為1∶30時(shí)，鐵皮石斛多糖提取率達(dá)到最大值；由圖1B可以看出，鐵皮石斛多糖提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)先升高后降低，當(dāng)提取時(shí)間為2 h時(shí)，鐵皮石斛提取率達(dá)到最大值；由圖1C可以看出，鐵皮石斛多糖提取率隨提取溫度的升高先升高后降低，當(dāng)提取溫度為60 ℃時(shí)，鐵皮石斛多糖提取率達(dá)到最大值。

2.3.2 Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以提取溫度（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）為考察因素，鐵皮石斛多糖提取率（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3 因素3水平的提取工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1，設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平

表2 Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

應(yīng)用Design-Expert 12 軟件對(duì)表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到回歸方程為Y＝34.00+0.53A－0.63B－2.90C－1.25AB+3.81AC+2.13BC－3.78A2+2.28B2－2.78C2。對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3顯示，該模型的F值為20.66，P＜0.01，表明該回歸方程的擬合度較好；失擬項(xiàng)P＞0.05，表明該模型成立；模型的相關(guān)系數(shù)R2為0.963 7，表明96.37%的多糖提取率變化可用該模型解釋；此外，各因素響應(yīng)值的影響大小排序?yàn)镃（提取時(shí)間）＞B（料液比）＞A（提取溫度）。

表3 Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)回歸方程的方差分析結(jié)果

運(yùn)用Design-Export 12 軟件繪制各因素交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖（圖2）。響應(yīng)面圖的陡峭程度以及等高線圖的形狀可以直觀反映出各影響因素之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值影響的強(qiáng)弱：響應(yīng)面圖越陡峭，說(shuō)明兩因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響越顯著，響應(yīng)面圖越平緩則兩因素交互作用的影響越不顯著；等高線呈橢圓形或馬鞍形，表示兩因素交互作用的影響顯著，若呈圓形則表示兩因素交互作用的影響不顯著。

圖2 各因素交互作用對(duì)鐵皮石斛多糖提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

由圖2 可以看出，提取溫度和提取時(shí)間兩因素之間的響應(yīng)面陡峭，等高線趨于橢圓，說(shuō)明兩因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響顯著；但提取溫度和料液比以及料液比和提取時(shí)間的響應(yīng)面坡度變化不明顯，等高線不呈橢圓形，說(shuō)明兩因素交互作用的影響不顯著，與回歸模型分析結(jié)果一致。

通過(guò)Design-Expert 12 軟件求解回歸方程，得到最優(yōu)提取工藝因素為料液比1∶25，提取時(shí)間1.087 h，提取溫度57.76 ℃，鐵皮石斛多糖提取率的預(yù)測(cè)值為38.63%?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)的可操作性，本研究將最優(yōu)提取工藝修正為料液比1∶25，提取時(shí)間1 h，提取溫度58 ℃。對(duì)此優(yōu)化條件進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，鐵皮石斛多糖提取率的平均實(shí)測(cè)值為37.75%（RSD＝1.12%），與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為2.28%，表明所得工藝可行。

2.4 鐵皮石斛多糖對(duì)小鼠ALI的影響

2.4.1 分組、給藥、造模與取樣

將昆明小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（醋酸潑尼松）和鐵皮石斛多糖低、中、高劑量組，每組15只。鐵皮石斛多糖低、中、高劑量組小鼠的給藥劑量根據(jù)本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別設(shè)置為50、100、200 mg/kg（以鐵皮石斛多糖粉末質(zhì)量計(jì)），陽(yáng)性對(duì)照組小鼠的給藥劑量根據(jù)參考文獻(xiàn)設(shè)置為5 mg/kg[8―9]，空白對(duì)照組和模型組小鼠給予等體積生理鹽水，每天灌胃1次，連續(xù)7 d。末次給藥1 h后，除空白對(duì)照組小鼠于氣管內(nèi)滴注等體積生理鹽水外，其余各組小鼠均于氣管內(nèi)滴注脂多糖10 mg/kg以復(fù)制ALI模型。24 h后，處死各組小鼠，取其肺臟，備用。

2.4.2 鐵皮石斛多糖對(duì)ALI模型小鼠肺濕/干重比的影響

取各組小鼠右肺下葉，用預(yù)冷的生理鹽水洗凈表面血漬，用濾紙吸干稱重（濕重）后，放入70 ℃烘箱中烘烤72 h，再次稱重（干重）并計(jì)算肺濕/干重比：肺濕/干重比＝肺濕重/肺干重。

2.4.3 鐵皮石斛多糖對(duì)ALI 模型小鼠肺組織病理形態(tài)的影響

取各組小鼠右肺組織，放入4%中性福爾馬林中固定24 h，再經(jīng)梯度乙醇脫水、石蠟包埋后切片，分別進(jìn)行HE和Masson染色，觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)改變。

2.4.4 數(shù)據(jù)處理

2.4.5 結(jié)果

與空白對(duì)照組（8.38±1.25）比較，模型組小鼠肺濕/干重比（16.90±2.19）顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組（9.83±1.29）和鐵皮石斛多糖低、中、高劑量組（14.85±2.08、11.80±1.82、10.43±1.14）小鼠肺濕/干重比均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

空白對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整清晰，無(wú)水腫現(xiàn)象，肺泡間隔未見(jiàn)增厚；與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，肺泡間隔明顯增寬，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及成纖維細(xì)胞增生；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和鐵皮石斛多糖低、中、高劑量組小鼠肺損傷情況均有不同程度緩解，其中陽(yáng)性對(duì)照組和鐵皮石斛多糖高劑量組緩解效果更好。結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 各組小鼠肺組織的HE染色顯微圖（標(biāo)尺＝50 μm）

圖4 各組小鼠肺組織的Masson 染色顯微圖（標(biāo)尺＝50 μm）

3 討論

Box-Behnken響應(yīng)面法可研究多個(gè)影響因素之間的交互作用，并可結(jié)合回歸分析對(duì)工藝條件進(jìn)行合理優(yōu)化。傳統(tǒng)的正交實(shí)驗(yàn)僅能處理離散的水平值，無(wú)法獲得整個(gè)區(qū)域中設(shè)定影響因素的最優(yōu)組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值，而B(niǎo)ox-Behnken 響應(yīng)面法可以克服上述缺陷。該法通過(guò)理論分析和模擬驗(yàn)證，評(píng)價(jià)提取工藝的影響因素，進(jìn)而優(yōu)化提取工藝參數(shù)。本研究通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化得鐵皮石斛多糖的最優(yōu)提取工藝為：料液比1∶25，提取時(shí)間1 h，提取溫度58 ℃。該工藝所得鐵皮石斛多糖的平均提取率為37.75%（n＝3），與預(yù)測(cè)值（38.63%）接近。

ALI是各種直接和間接致傷因素導(dǎo)致的肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，造成肺水腫，從而引發(fā)急性低氧呼吸功能不全的臨床綜合征[10]。脂多糖是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，是一種內(nèi)毒素，可以刺激炎癥因子和炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，引發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)。本研究采用氣管滴注脂多糖的方式誘導(dǎo)建立小鼠ALI模型，探討鐵皮石斛多糖對(duì)小鼠ALI的影響。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠肺濕/干重比顯著升高，肺組織可見(jiàn)肺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損、肺泡間隔明顯增寬、大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及成纖維細(xì)胞增生等ALI 病理特征，表明ALI模型復(fù)制成功。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和鐵皮石斛多糖低、中、高劑量組小鼠肺濕/干重比均顯著降低，上述病理改變均有所緩解，可見(jiàn)鐵皮石斛多糖對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠ALI有改善作用。

綜上所述，本研究?jī)?yōu)化的鐵皮石斛多糖提取工藝可行，且所得多糖對(duì)小鼠ALI有一定的改善作用。