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        基于網(wǎng)絡藥理學和實驗驗證研究高良姜素乳膏抗白癜風的作用機制

        2023-12-01 14:44:40祖力皮卡爾吾斯曼張數(shù)數(shù)李治建霍仕霞
        中國醫(yī)藥導報 2023年30期
        關鍵詞:黑素細胞白癜風乳膏

        祖力皮卡爾·吾斯曼 張數(shù)數(shù) 閆 明 李治建 霍仕霞

        1.新疆醫(yī)科大學藥學院,新疆烏魯木齊 830011;2.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾藥物研究所,新疆烏魯木齊 830049;3.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院,新疆烏魯木齊 830049

        白癜風是一種常見的黑素細胞缺失導致皮膚出現(xiàn)色素脫失斑的色素障礙性皮膚病,患病率為0.5%~2.0%,其病因尚未確定[1]。目前臨床上治療白癜風的方法有手術、光療[2]、外用激素[3]、口服免疫抑制劑[4]及抗氧化劑[5]等,雖然有一定的效果,但也有一定的副作用。高良姜素(Galangin,GA)是從高良姜的根部提取的一種天然黃酮(3,5,7-三羥基黃酮),具有抗腫瘤[6]、抗氧化[7]和抗感染[8]活性。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),GA具有促進黑色素合成的作用[9]。本研究運用網(wǎng)絡藥理學[10-11]及分子對接等分析方法,對GA 乳膏抗白癜風作用機制進行研究,以期為白癜風治療藥物的開發(fā)及臨床應用提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 網(wǎng)絡藥理學

        1.1.1 作用靶點的篩選 運用Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫,獲取其吸收、分布、代謝、排泄和毒性水平,并結合中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺的中藥動學參數(shù)篩選標準對GA 靶點進行篩選。

        1.1.2 構建白癜風疾病靶點數(shù)據(jù)庫 利用TTD、OMIM、DrugBank 數(shù)據(jù)庫,以“vitiligo”為關鍵詞,檢索與白癜風相關的基因,構建白癜風疾病靶點數(shù)據(jù)庫。

        1.1.3 蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡構建 用R 語言進行維恩圖映射交集處理藥物和疾病靶點,將藥物和疾病靶點輸入String平臺(https://cn.string-db.org/),通過Cytoscape 3.7.1 尋找核心靶點,構建藥物-疾病靶點PPI 網(wǎng)絡。

        1.1.4 基因富集分析 為了闡明GA 治療白癜風的作用,將得到的核心靶標進行GO 富集分析和KEGG 信號通路富集分析。

        1.1.5 分子對接 借助ZINC 數(shù)據(jù)庫(http://zinc.docking.org/)下載GA 的3D 結構,作為對接配體。采用Auto Tools 對核心靶點晶體結構蛋白進行預處理,作為分子對接的受體。以配體和受體使用Autodock Vina 1.2進行對接,最后取優(yōu)勢構象進行分析,對接結果中Vina 分值≤-4.5,說明關鍵靶點與化合物的結合能力較好[12]。

        1.2 動物實驗材料

        1.2.1 實驗動物 選取60 只4 周齡SPF 級雄性C57 BL/6 小鼠,體重(21±3)g,購自湖南精達實驗動物有限公司。實驗動物生產(chǎn)許可證編號:SCXK(湘)2019-0004。本實驗經(jīng)新疆醫(yī)科大學動物倫理委員會批準(IACUC-20211118-03),動物接收后飼養(yǎng)在屏障系統(tǒng)內,適應性喂養(yǎng)1 周,每籠5 只,自由進食、進水。

        1.2.2 主要試劑與儀器1%GA 乳膏(20190910),規(guī)格為20 g/支,淡黃色膏體,由新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾藥物研究所提供。1%8-甲氧補骨脂素(8-methoxypsoralen,8-MOP)(重慶華邦制藥股份有限公司,M861678);10%H2O2溶液(河南標準物質研發(fā)中心,MY15480)。酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒購自上海酶聯(lián)生物技術有限公司,包括內皮素-1(endothelin-1,ET-1)(210620),白細胞介素-18(interleukin-18,IL-18)(210715),腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)(210723)。BCA 蛋白定量試劑盒(WB0028)、TBST(WB0043)均購自天德瑞生物科技有限公司。Trizol(美國Thermo,15596026);ET-1 一抗(美國Abcam,ab2786);TNF-α一抗(北京博奧森生物技術有限公司,bs-2081);二抗HPR goat anti-mouse IgG(美國Sigma,SA00001-1);mRNA 逆轉錄試劑盒(北京康為世紀有限公司,CW 2569)。引物均由上海生工公司合成。ET-1 引物序列:正向引物為5’-GAAGTTGACGCACAACCGAG-3’,反向引物為5’-CTCTGCCCGTCTGAACAAGA-3’;IL-18引物序列:正向引物為5’-TCAGCTGGGAAAACTCAGGA-3’,反向引物為5’-AGCTAATGTGACGCACTGGG-3’;TNF-α 引物序列:正向引物為5’-AGCACAGAAAGCATGATCCG-3’,反向引物為5’-CACCCCGAAGTTCAGTAGACA-3’。實時熒光定量PCR 儀(美國Thermo,PIKOREAL96);臺式低速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司,L-420)。

        1.2.3 藥物的制備 制備低(1%)、中(2%)、高(4%)劑量GA 乳膏,在原有乳膏的基礎上提高GA 含量,稱取各輔料,將所需的油相及水相分別放入不同的燒杯,在85℃的水浴中融化并均勻化。將油相慢慢倒入水相中,以600 r/min 的速度攪拌5 min,冷卻至室溫,濃縮后得到不同劑量的GA 乳膏。

        1.3 動物實驗方法

        1.3.1 動物分組及干預 選取10 只小鼠設為正常對照組,其余50 只將背部2 cm×2 cm 區(qū)域剃毛,剃毛1次/3 d。剃毛區(qū)域均勻涂抹10%H2O2構建白癜風動物模型[13],以造模區(qū)域毛發(fā)顏色變化及皮膚白斑情況確認造模成功[14]。造模成功后按隨機數(shù)字表法將其分為模型組、陽性藥組及GA 乳膏低、中、高劑量組,每組10 只。GA 乳膏各劑量組在造模區(qū)進行涂抹給藥,1 g/次,1 次/d;陽性藥組灌胃8-MOP4.25 mg/kg,2 次/d,間隔時間為6 h,連續(xù)給藥30 d。模型組及正常對照組不進行干預。

        1.3.2 血液和皮膚樣本的制備 實驗結束后,采集血樣,靜置1 h 后在4℃的條件下分離血清,用手術刀在小鼠造模區(qū)域皮膚進行1.5 cm×1.5 cm 的切取,將皮膚組織樣本部分放在4%多聚甲醛中,部分儲存在-80℃冰箱中。

        1.3.3 組織病理學檢查 取小鼠造模部位的皮膚,用石蠟塊包裹,并切成3~5 μm 的切片,用蘇木精-伊紅染色。

        1.3.4 血清ET-1、TNF-α 及IL-18 檢測 用酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒檢測血清中的ET-1、TNF-α 及IL-18。

        1.3.5 Western blot 分析 使用BCA 蛋白測定試劑盒測定皮膚組織中的蛋白濃度,將組織樣品(50 μg)煮沸5 min,裝入10%的聚丙烯酰胺凝膠,然后轉移到PVDF 膜上。用三緩沖鹽水加TBST 緩沖液和3%的牛血清白蛋白在室溫下將膜封鎖1 h。將膜與一抗(稀釋度1∶500)在4℃下孵育過夜,用TBST(3~5 次)沖洗5 min,然后與二抗(稀釋度1∶1 000)在室溫下孵育1 h,用TBST(3~5 次)沖洗5 min。采用增強型化學發(fā)光法檢測印跡,使用圖像分析軟件對照β-actin 蛋白確定蛋白條帶的密度。

        1.3.6 RT-qPCR 分析 依試劑盒說明書制備PCR 體系:反轉錄產(chǎn)物2 μl,Primer A(10 μmol/L)1 μl,Primer B(10 μmol/L)1 μl,ddH2O 11 μl,2X SYBGREEN PCR Master Mix 15 μl,共30 μl。將制備完成的PCR 反應管放入實時熒光定量PCR 儀內,在95℃預變性15 s,然后以95℃15 s,60℃30 s,70℃15 s 循環(huán)40 次進行PCR 反應,以2-ΔΔCt法計算mRNA 表達量。

        1.4 統(tǒng)計學方法

        采用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料采用均數(shù)±標準差()表示,比較采用t 檢驗;多組計量資料比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結果

        2.1 GA 作用靶點篩選

        SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫分別輸入GA 的mol2結構式獲取蛋白作用靶點,經(jīng)蛋白質數(shù)據(jù)庫Uniprot校驗后根據(jù)z’score>0 得到最終符合條件的17 個基因靶點:NOS2、ET1、ARNT、PTGS2、DPP6、TNF、BCL2、CDk4、CDk1、CYP1A1、IL18、GSTP1、ARNT、NLRP3、IL1β、Casp1、TYR。

        2.2 白癜風候選靶點

        以“vitiligo”為關鍵詞,應用數(shù)據(jù)庫查相關疾病靶點。經(jīng)整理合并后共得到459 個靶點,映射交集處理結果顯示,獲得GA-白癜風交集靶基因有10 個。見圖1。

        圖1 GA-白癜風交集靶基因維恩圖

        2.3 PPI 網(wǎng)絡構建

        GA 治療白癜風靶點及其功能的PPI 網(wǎng)絡圖共有10 個節(jié)點,25 條邊,平均節(jié)點自由度為5,酪氨酸酶、NOD 樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3、誘導性一氧化氮合酶、TNF、IL-1β、IL-18 等為核心靶點。見圖2。

        圖2 GA 治療白癜風靶點的蛋白質-蛋白質相互作用網(wǎng)絡

        2.4 GO 功能富集分析及KEGG 通路分析

        藥物疾病交集核心靶點進行GO 富集分析及KEGG 通路富集分析,前10 的途徑見圖3,對富集得到的通路結果見圖4。結果顯示,GA 中有效成分可能通過核因子κB、NOD 樣受體及HIF-1 通路等發(fā)揮治療白癜風的作用。

        圖3 GA 治療白癜風核心靶點GO 富集分析

        圖4 GA 治療白癜風核心靶點KEGG 通路富集分析

        2.5 GA 抗白癜風關鍵靶點分子對接

        將篩的3 個關鍵靶點的空間結構與GA 的分子結構進行分子對接,結果顯示,GA 與ET-1、TNF-α 和IL-18的對接結合能分別為-4.6、-8.2 和-7.2 kcal/mol。見圖5。

        圖5 GA 與作用于白癜風關鍵靶點的分子對接

        2.6 六組皮膚組織染色

        正常對照組皮膚無明顯異常。模型組皮膚與正常對照組比較,表皮棘層皺襞變厚,毛囊破損及角質層明顯增生。GA 乳膏各劑量組表皮雖有輕微棘層皺襞,與模型組比較明顯改善。見圖6。

        圖6 六組皮膚組織蘇木精-伊紅染色(100×)

        2.7 六組血清ET-1、TNF-α 及IL-18 水平比較

        模型組血清ET-1、IL-18、TNF-α 水平高于正常對照組,GA 乳膏低、中、高劑量組血清ET-1、IL-18、TNF-α 水平低于模型組(P<0.05)。見圖7。

        圖7 六組血清ET-1、TNF-α 及IL-18 水平比較(n=10)

        2.8 六組皮膚組織中ET-1 和TNF-α 蛋白表達比較

        模型組皮膚組織中ET-1、TNF-α 蛋白表達高于正常對照組(P<0.05)。GA 乳膏高劑量組皮膚組織ET-1蛋白表達低于模型組,GA 乳膏中、高劑量組皮膚組織TNF-α 蛋白表達低于模型組(P<0.05)。GA 乳膏中、高劑量組皮膚組織TNF-α 蛋白表達低于GA乳膏低劑量組,GA 乳膏高劑量組皮膚組織ET-1 蛋白表達低于GA 乳膏低劑量組(P<0.05)。見圖8。

        圖8 六組皮膚組織中ET-1 和TNF-α 蛋白表達比較(n=10)

        2.9 六組皮膚組織中ET-1、TNF-α 及IL-18 mRNA表達比較

        模型組皮膚組織中ET-1、IL-18、TNF-α mRNA表達高于正常對照組,GA 乳膏低、中、高劑量組皮膚組織ET-1、TNF-α mRNA 表達低于模型組,GA 乳膏中、高劑量組皮膚組織IL-18 mRNA 表達低于模型組和GA 乳膏低劑量組(P<0.05)。見圖9。

        圖9 六組皮膚組織中ET-1、TNF-α 及IL-18 mRNA 表達比較(n=10)

        3 討論

        白癜風是一種自身免疫介導的炎癥性皮膚病,全身任何部位的皮膚均可發(fā)生,但好發(fā)于易受摩擦、陽光暴曬的暴露部位及褶皺部位[15-16]。白癜風發(fā)病的關鍵是黑素細胞合成黑素功能的減退和缺失[17]。本研究運用網(wǎng)絡藥理學的方法,探討了GA 及其作用靶點的相關性,GA 中存在1 個活性成分與多個核心靶標作用的現(xiàn)象,體現(xiàn)了中藥多成分與多靶標之間共同作用的機制,得出ET-1、TNF-α 及IL-18 是GA 治療白癜風的關鍵靶點。

        黑素細胞旁分泌網(wǎng)絡與黑素細胞功能減退密切相關[18],黑素細胞旁分泌網(wǎng)絡是一個復雜的系統(tǒng)[19],對其功能具有重要調節(jié)作用[20]。ET-1 已被證實在白癜風的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要的角色[21]。本研究結果顯示,GA 乳膏治療可顯著降低白癜風模型動物血清和皮膚組織中ET-1 的表達水平。

        TNF-α 是一種由活化的單核巨噬細胞釋放的炎癥因子,可對黑素細胞產(chǎn)生細胞毒性作用,進而抑制黑素細胞色素生成[22]。白癜風患者TNF-α 水平高于正常人,TNF-α 高表達可誘導角質形成細胞凋亡,誘發(fā)白癜風[23]。本研究結果顯示,GA 乳膏治療可顯著降低白癜風模型動物血清和皮膚組織中TNF-α 蛋白及其mRNA的表達水平,發(fā)揮顯著的抗黑素細胞凋亡的作用。

        IL-18 水平的升高可促進和誘導γ 干擾素及CD8+T 細胞活性而參與白癜風的炎癥反應及發(fā)病過程[24]。ET-1 通過p38 MAPK 通路依賴性機制誘導IL-18 的表達[25]。本研究結果提示,GA 乳膏可顯著降低白癜風模型動物血清IL-18 水平及其mRNA 在皮膚組織中的表達水平。

        綜上,本研究基于網(wǎng)絡藥理學,通過關聯(lián)網(wǎng)絡構建及分析,初步闡釋了GA 治療白癜風的作用機制。實驗研究結果顯示,GA 乳膏很可能通過增加黑素細胞旁分泌網(wǎng)絡ET-1 及炎癥因子TNF-α、IL-18 表達發(fā)揮作用,為后續(xù)研究白癜風的作用機制提供了研究基礎。

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