邢燁鋒,趙武霞,歐志杰,張?zhí)彀?胡玥

(1.南通市通州區(qū)中醫(yī)院檢驗科,江蘇 南通 226300;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院·中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,江蘇 南京 210023;3.常熟市中醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,江蘇 常熟 215516)

缺血性中風(fēng)約占所有中風(fēng)的80%,是一種高發(fā)病率和高死亡率的腦血管疾病[1]。研究發(fā)現(xiàn),腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞迅速增殖活化,參與腦缺血再灌注損傷的病理過程[2-3],對缺血后損傷發(fā)揮修復(fù)和加劇的雙重作用[4]。P2Y12受體是一種僅限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細(xì)胞代謝的嘌呤受體[5],與神經(jīng)病理和炎癥相關(guān)[6]。此外,激活的GTP-RhoA/ROCK2信號通路和提高的磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)水平促進(jìn)炎癥損傷,在抑制P2Y12受體后可得到改善[6]。清代名醫(yī)王清任《醫(yī)林改錯》中的補(bǔ)陽還五湯在缺血性腦卒中的臨床防治中被廣泛運(yùn)用[7]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn),補(bǔ)陽還五湯可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞抗炎介質(zhì)的分泌,通過減輕炎癥反應(yīng)以減輕腦損傷[8-9]。然而,補(bǔ)陽還五湯對腦缺血再灌注損傷小鼠P2Y12受體介導(dǎo)的RhoA/ROCK信號通路的影響尚未見報道。因此,本研究擬通過構(gòu)建腦缺血再灌注損傷小鼠模型,探討補(bǔ)陽還五湯對小膠質(zhì)細(xì)胞的極化以及P2Y12受體介導(dǎo)的RhoA/ROCK炎癥信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 動物

健康C57BL/6J小鼠(SPF級)60只,雄性,6～8周齡,18～22 g,購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司。實驗動物許可證號:SYXK(蘇)2018-0049。分籠飼養(yǎng)條件:自由進(jìn)食、飲水,12 h光照和12 h黑暗交替循環(huán),溫度23～25 ℃,濕度40%～60%,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實驗。本研究經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)動物保護(hù)與倫理委員會批準(zhǔn)(倫理編號:A21065),動物的飼養(yǎng)條件和實驗程序均嚴(yán)格遵守實驗動物管理委員會和倫理道德委員會規(guī)章制度。

1.2 補(bǔ)陽還五湯溶液制備方法

補(bǔ)陽還五湯由君藥黃芪120 g,臣藥當(dāng)歸6 g以及佐藥赤芍4.5 g,川芎3 g,桃仁3 g,紅花3 g,地龍3 g組成(生產(chǎn)批號:20220201,安徽桐化堂中藥飲片科技有限公司),符合《中華人民共和國藥典》2020版規(guī)定。取上述各味中藥飲片混合加水浸泡1 h,水煎40 min后取藥液,藥渣同法再次煎煮,合并后濃縮為含生藥2 g·mL-1的補(bǔ)陽還五湯水溶液,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 儀器與試劑

純水儀(型號:Milli-Q Academic A10,美國Milipore公司);熒光顯微鏡[型號:IX73,奧林巴斯(中國)有限公司];高速冷凍離心機(jī)(型號:Vlicro CL21R,上海寶賽生物科技有限公司);冷凍切片機(jī)[型號:6250,達(dá)科為(深圳)醫(yī)療設(shè)備有限公司];化學(xué)發(fā)光底物(ECL)成像系統(tǒng)(型號:EI600,南京碧云天生物技術(shù)有限公司);低溫離心機(jī)(型號:CENTRIFUGE 5424R,德國Eppendorf公司);實時熒光定量PCR儀(型號:7500,美國ABI公司);顯影成像儀(型號:Tanon-4600,上海天能公司)。

MRS2395(貨號:M5942,美國Sigma公司);2,3,5-氯化三苯基四氮唑藍(lán)(TTC)染色劑(貨號:T819366,中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司);Triton X-100(貨號:T8200,北京索萊寶科技有限公司);4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(貨號:C1002,南京碧云天生物技術(shù)有限公司);BCA蛋白濃度試劑盒(貨號:P0012,南京碧云天生物技術(shù)有限公司);線栓(貨號:9070001701,瑞沃德生命科技有限公司);Trizol(貨號:15596026,美國Thermo公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號:11119ES60,上海翌圣生物科技有限公司);SYBR染料(貨號:11201ES03,上海翌圣生物科技有限公司);兔抗Iba1(貨號:LKG5732,日本W(wǎng)ako公司);山羊抗CD206(貨號:ab64693)、P2Y12抗體(貨號:ab300140)、Alexa Fluor 488二抗(貨號:ab150077)、Alexa Fluor 594二抗(貨號:ab150116)、RhoA抗體(貨號:ab187027)、CD16/32抗體(貨號:ab215977)、ROCK抗體(貨號:ab134181)、鼠抗P2Y12抗體(貨號:ab184411)購自英國Abcam公司;p38 MAPK抗體(貨號:8690S)、p-p38 MAPK抗體(貨號:4511)購自美國CST公司;羊抗兔二抗IgG(貨號:S0001)、羊抗鼠二抗IgG(貨號:S0002)購自美國Affinity公司。

1.4 MCAO造模、分組與給藥

將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)(Sham)組、模型(MCAO)組、補(bǔ)陽還五湯低劑量(BYHW-L)組、補(bǔ)陽還五湯高劑量(BYHW-H)組、補(bǔ)陽還五湯高劑量+MRS2395(BYHW-H+MRS2395)組,每組6只。參考文獻(xiàn)的實驗方法構(gòu)建MCAO模型[10],Sham組線栓不阻塞大腦中動脈。BYHW-L組、BYHW-H組在缺血24 h后每日分別給予補(bǔ)陽還五湯低、高劑量(6.5、26 g·kg-1)[11]處理,BYHW-H+MRS2395組小鼠除每日灌胃26 g·kg-1補(bǔ)陽還五湯外,將MRS2395溶于5%DMSO中,600 μg·d-1,腹腔注射,從術(shù)后前1 d開始,每日給藥3次,共6 d。Sham組和MCAO組給予等體積生理鹽水灌胃,共7 d。

1.5 神經(jīng)功能評分

分別在術(shù)后清醒第0、24、48、72 h和第7天,參考Zea-Longa神經(jīng)功能缺損評分標(biāo)準(zhǔn)[10],評估小鼠神經(jīng)功能受損程度。評分標(biāo)準(zhǔn):無神經(jīng)功能缺陷,0分;提尾時阻塞側(cè)前爪不能完全伸展,1分;行走時向阻塞側(cè)轉(zhuǎn)圈,2分;行走時向阻塞側(cè)傾倒,3分;意識喪失,不能自主行走現(xiàn)象,4分。評分越高說明神經(jīng)損傷越嚴(yán)重。

1.6 TTC染色

術(shù)后第7天,摘眼球取血后斷頭取腦,將腦組織切成約2 mm厚的冠狀位腦片,置于1%TTC染色液中37 ℃避光孵育染色30 min,每5 min翻動1次使染色均勻,并拍照記錄。經(jīng)染色后有線粒體存活的正常組織呈玫瑰紅色,梗死區(qū)域呈灰白色,且界限分明,易于剝離。用Image Pro Plus軟件分析小鼠腦組織梗死體積和整個腦組織體積。梗死比=梗死體積/整個腦體積×100%。

1.7 免疫熒光雙染色

取小鼠腦組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,用檸檬酸鈉抗原修復(fù)液微波加熱10 min進(jìn)行抗原修復(fù),5%牛血清白蛋白(BSA)封閉后,分別加入M1型小膠質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)記物兔抗Iba1(貨號:LKG5732)/鼠抗CD16/32(1∶200) (貨號:ab215977),M2型小膠質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)記物兔抗Iba1/山羊抗CD206(1∶100) (貨號:ab64693)以及兔抗Iba1/鼠抗P2Y12 (1∶200) (貨號:ab300140),并4 ℃孵育過夜。第2天,加熒光二抗在37 ℃下孵育1 h,并用DAPI避光孵育10 min,封片置于暗盒中4 ℃保存。在熒光顯微鏡下觀察樣品。

1.8 qPCR檢測

使用滅菌器械取各組小鼠腦組織,用Trizol進(jìn)行RNA提取,參考RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書得到組織cDNA,-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用qPCR法進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),然后運(yùn)用2-ΔΔCt法分析目的基因相對表達(dá)量,PCR引物均由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成提供,引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列

1.9 蛋白提取及Western blot分析

取各組小鼠腦組織缺血區(qū)域,-80 ℃保存?zhèn)溆?。磨碎的腦組織加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液裂解,采用BCA測定法定量蛋白濃度,將Loading buffer加入蛋白中,100 ℃變性10 min。經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離蛋白質(zhì)樣品,并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂牛奶封閉后,分別加入鼠抗P2Y12(1∶500) (貨號:ab184411)、RhoA(1∶5 000) (貨號:ab187027)、ROCK(1∶1 000) (貨號:ab134181)、p38 MAPK(1∶1 000) (貨號:8090S)和GAPDH 一抗(1∶1 000) (貨號:ab8245),4 ℃孵育過夜。次日洗膜后,加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h,再次洗膜后顯影成像,使用Image Lab軟件進(jìn)行灰度分析。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)陽還五湯促進(jìn)MCAO模型小鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)

Longa評分越高,神經(jīng)損傷越嚴(yán)重,結(jié)果如表2所示。Sham組小鼠無神經(jīng)功能損傷,第0、24、48、72 h及第7天的神經(jīng)功能評分均為0分;而第7天MCAO組評分顯著升高(P<0.01),提示術(shù)后存在神經(jīng)功能損傷。術(shù)后持續(xù)給藥7 d后,與MCAO組相比,BYHW-H組神經(jīng)功能評分下降(P<0.05),提示高劑量補(bǔ)陽還五湯促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù);與BYHW-H組相比,BYHW-H+MRS2395組并無顯著性差異,但是評分低于BYHW-H組。

表2 各組神經(jīng)功能評分

TTC染色結(jié)果如圖1所示,術(shù)后第7天,取小鼠大腦經(jīng)TTC染色,結(jié)果顯示正常組織呈玫瑰紅色,梗死區(qū)域呈灰白色。與Sham組相比,MCAO組梗死體積明顯較大(P<0.01);與MCAO組相比,BYHW-L、BYHW-H組梗死體積減小(P<0.05,P<0.01);且BYHW-H組與BYHW-H+MRS2395組梗死體積并無顯著性變化。綜上所述,補(bǔ)陽還五湯可促進(jìn)MCAO模型小鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)。

圖1 補(bǔ)陽還五湯對MCAO小鼠腦梗死體積的影響

2.2 補(bǔ)陽還五湯促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞從促炎向抗炎的表型轉(zhuǎn)化

如圖2所示,術(shù)后第7天,小鼠大腦組織免疫熒光染色結(jié)果顯示:與Sham組比較,MCAO組M1型小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物CD16表達(dá)顯著上升(P<0.001);與MCAO組比較,BYHW-L、BYHW+H組CD16表達(dá)水平下降(P<0.05,P<0.01)。結(jié)果表明補(bǔ)陽還五湯抑制M1型小膠質(zhì)細(xì)胞的增加。與BYHW-H組相比,BYHW-H+MRS2395組的CD16表達(dá)水平并無顯著性變化。同時檢測腦組織中M2型小膠質(zhì)細(xì)胞。與Sham組相比,MCAO組小膠質(zhì)細(xì)胞的M2型標(biāo)記物CD206表達(dá)明顯降低(P<0.01);與MCAO組比較,BYHW-L、BYHW+H組CD206表達(dá)水平上升(P<0.05,P<0.01)。結(jié)果表明補(bǔ)陽還五湯促進(jìn)M2型小膠質(zhì)細(xì)胞的增加。與BYHW-H組相比,BYHW-H+MRS2395組的CD206表達(dá)水平無顯著變化。

注:A.小膠質(zhì)細(xì)胞的M1型標(biāo)記物CD16;B.小膠質(zhì)細(xì)胞的M2型標(biāo)記物CD206;與Sham組比較,##P<0.01,###P<0.001;與MCAO組比較,

小鼠MCAO術(shù)后第7天,采用qPCR進(jìn)一步檢測補(bǔ)陽還五湯對小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物mRNA表達(dá)的影響。如圖3所示,與Sham組相比,MCAO組小鼠腦組織中M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物CD206 mRNA和IL-10 mRNA表達(dá)增加(P<0.01,P<0.05),Arg-1 mRNA表達(dá)顯著減少(P<0.001);與MCAO組比,BYHW-L、BYHW-H組CD206 mRNA、IL-10 mRNA(P<0.05,P<0.01)和Arg-1 mRNA(P<0.01)表達(dá)均上升。與BYHW-H組相比,BYHW-H+MRS2395組中3者表達(dá)水平無顯著差異。與Sham組相比,MCAO組TGF-β mRNA表達(dá)明顯上升(P<0.001);TGF-β mRNA的表達(dá)在BYHW-L、BYHW-H組中比在MCAO組中明顯降低(P<0.01),給予MRS2395后TGF-β mRNA表達(dá)與BYHW-H組相似,與其余3組變化趨勢不同,可能與P2Y12受體相關(guān)[12]。另外,與Sham組相比,MCAO組小鼠腦組織中M1型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物CD16 mRNA和CD86 mRNA表達(dá)增加(P<0.01);與MCAO組比,BYHW-L、BYHW-H組CD16 mRNA表達(dá)均顯著下降(P<0.05,P<0.01),同時,BYHW-H組CD86 mRNA表達(dá)顯著下降(P<0.01)。綜上所述,補(bǔ)陽還五湯可能促進(jìn)缺血/再灌注損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化,更深入的機(jī)制需進(jìn)一步探索。

2.3 補(bǔ)陽還五湯對P2Y12介導(dǎo)的RhoA/ROCK通路的影響

為驗證MRS2395對小膠質(zhì)細(xì)胞P2Y12受體的抑制作用,對小鼠大腦組織進(jìn)行免疫熒光雙染色,如圖4顯示,在MCAO模型中,小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的P2Y12顯著上升(P<0.01),并且其表達(dá)可被抑制劑MRS2395顯著抑制(P<0.01),且BYHW-H也對小膠質(zhì)細(xì)胞中P2Y12表達(dá)有顯著的抑制作用(P<0.01)。

注:與Sham組比較;##P<0.01;與MCAO組比較,

MCAO術(shù)后第7天,Western blot檢測小鼠大腦組織蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示,與Sham組相比,MCAO組P2Y12、RhoA、ROCK蛋白表達(dá)及p-p38 MAPK/p38 MAPK比值顯著上升(P<0.001);與MCAO組相比,BYHW-L、BYHW-H組P2Y12、RhoA、ROCK蛋白表達(dá)及p-p38 MAPK/p38 MAPK比值顯著降低(P<0.05,P<0.01)。與BYHW-H組相比,BYHW-H+MRS2395組中各指標(biāo)影響無顯著差異,如圖5。

注:與Sham組比較;###P<0.001;與MCAO組比較,

3 討論

中風(fēng)死亡率很高,其中缺血性中風(fēng)患者占總中風(fēng)人數(shù)的80%以上[1]。由于缺血性中風(fēng)復(fù)雜的病理生理過程和中風(fēng)治療的局限性[13],數(shù)百萬中風(fēng)幸存者面臨罹患偏癱等殘疾的風(fēng)險。補(bǔ)陽還五湯是治療中風(fēng)的經(jīng)典名方,有補(bǔ)氣活血,化瘀通絡(luò)的功效。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明該方可以從減輕炎癥反應(yīng)、修復(fù)神經(jīng)和降低氧化應(yīng)激等多方面防治腦卒中[14],相關(guān)信號通路涉及經(jīng)典的PI3K/AKT通路[15]、AMPK/mTOR通路[16]、Notch信號通路[17]等。

小膠質(zhì)細(xì)胞是正?；蚴軗p大腦必不可少的常駐免疫細(xì)胞,而腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞不受控制或過度激活是有害的[18]。有研究表明,小膠質(zhì)細(xì)胞在刺激下被極化而呈現(xiàn)某種表型,常見的表型有2類,即經(jīng)典激活型M1表型,以及替代激活型M2表型。在腦缺血再灌注損傷等病理狀態(tài)下,M1型小膠質(zhì)細(xì)胞被過度活化,將加速分泌白細(xì)胞介素-β(Interleukin-β,IL-β)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)等炎癥因子,進(jìn)一步擴(kuò)大炎癥反應(yīng),加深神經(jīng)損傷程度;與之相對應(yīng),M2型小膠質(zhì)細(xì)胞為抗炎表型,可抑制炎癥反應(yīng)[19]。本研究中,補(bǔ)陽還五湯干預(yù)7 d后,高劑量和低劑量組均能減少CD16+小膠質(zhì)細(xì)胞,即M1型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量,同時增加CD206+小膠質(zhì)細(xì)胞,即M2型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量。此外,補(bǔ)陽還五湯也可調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物mRNA的表達(dá)。以上結(jié)果表明腦缺血再灌注損傷后,補(bǔ)陽還五湯的干預(yù)可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞M1到M2的表型轉(zhuǎn)化。

P2Y12是腦小膠質(zhì)細(xì)胞中豐富的嘌呤能受體,也是小膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物[20]。在動物實驗中,腦損傷或注射ATP/ADP引發(fā)的P2Y12激活可以調(diào)節(jié)早期小膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng),而P2Y12缺乏或抑制具有神經(jīng)保護(hù)作用。敲除小膠質(zhì)細(xì)胞中的P2Y12或給予P2Y12的抑制劑都顯示出改善腦缺血后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元活性和緩解神經(jīng)元損傷的作用[21]。此外,抑制P2Y12能夠預(yù)防M1型和M2型小膠質(zhì)細(xì)胞向高濃度的ADP區(qū)遷移,可抑制促炎因子的釋放[22]。在MCAO模型中,通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞中依賴于P2Y12的通路可保護(hù)小鼠免受MCAO引起的缺血性損傷和神經(jīng)損傷的影響[23-24]。綜上所述,抑制小膠質(zhì)細(xì)胞P2Y12受體的激活,可減少神經(jīng)元死亡,避免血腦屏障破壞而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

RhoA是小分子G蛋白家族的一員,參與許多細(xì)胞功能,包括細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞運(yùn)動、吞噬作用和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸[25]。RhoA在非活性形式(GDP結(jié)合)和活性形式(GTP結(jié)合)之間循環(huán),其活性形式與下游效應(yīng)分子相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。RhoA最匹配的下游效應(yīng)分子是Rho激酶(ROCK),在各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中觀察到了RhoA/ROCK通路的激活,如中風(fēng)和腦部炎癥[26],抑制RhoA/ROCK信號可以減輕神經(jīng)炎癥和缺血后的神經(jīng)元損傷[27-28]。研究表明,P2Y12參與的小膠質(zhì)細(xì)胞活化中,抑制ROCK后可降低p38 MAPK的磷酸化水平,激活的RhoA/ROCK/p38 MAPK信號通路被P2Y12拮抗劑逆轉(zhuǎn)[6,29],減輕神經(jīng)病理損傷。

本研究中,MCAO可引發(fā)P2Y12介導(dǎo)RhoA/ROCK通路相關(guān)蛋白的高表達(dá),而補(bǔ)陽還五湯的干預(yù)可降低其表達(dá)。MRS2395為P2Y12受體抑制劑,然而在本研究中,BYHW-H+MRS2395組與BYHW-H組相比并無顯著差異,提示特異性拮抗P2Y12受體并不能抑制補(bǔ)陽還五湯的神經(jīng)保護(hù)作用,表明在P2Y12介導(dǎo)的RhoA/ROCK通路之外,補(bǔ)陽還五湯還可通過其他途徑發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,體現(xiàn)了中藥復(fù)方多靶點多途徑作用的特點,但具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步深入探索。