洪 忠 強(qiáng), 呂 紅, 王 曉 磊, 周 集 體

( 大連理工大學(xué) 環(huán)境學(xué)院 工業(yè)生態(tài)與環(huán)境工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 遼寧 大連 116024 )

0 引 言

電化學(xué)活性菌(electrochemically active bacteria,EAB)是將電子從細(xì)胞內(nèi)傳輸?shù)桨怆娮邮荏w如金屬離子、礦物質(zhì)、有機(jī)污染物或電極的一類微生物,其電子轉(zhuǎn)移過程稱為胞外電子傳遞[1-2]．目前國內(nèi)外學(xué)者普遍認(rèn)為EAB具有兩種胞外電子傳遞機(jī)制[3]:一種是通過外膜表面c型細(xì)胞色素蛋白[4-5]或延伸的導(dǎo)電菌毛/納米線[6-7]進(jìn)行的直接電子傳遞機(jī)制;另一種是通過電子穿梭體[8-9]進(jìn)行的間接電子傳遞機(jī)制,主要以細(xì)胞自身分泌的各種電子穿梭體[10-11],如黃素類物質(zhì)完成細(xì)胞和不溶性底物之間的電子交換[12-13]．

希瓦氏菌是能夠利用含有Fe(Ⅲ)、Mn(Ⅲ)或Mn(Ⅳ)的礦物質(zhì)作為末端電子受體的EAB之一．有學(xué)者發(fā)現(xiàn)希瓦氏菌株S.oneidensisMR-1中的bfe是一個(gè)可以控制細(xì)胞分泌黃素的黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因,缺失bfe基因會(huì)顯著降低細(xì)胞對(duì)Fe(Ⅲ)氧化物等礦物質(zhì)及石墨電極的還原速率[14]．可見,細(xì)胞分泌的黃素類物質(zhì)在介導(dǎo)還原胞外固態(tài)電子受體過程中起到主要作用[8,14]．研究表明,位于細(xì)胞表面的外膜蛋白MtrC和OmcA可通過還原黃素單核苷酸(FMN)將電子轉(zhuǎn)移到固體Fe(Ⅲ)上[15-16]．這兩個(gè)外膜蛋白也能夠還原氧化石墨烯(GO)[17],從而促進(jìn)胞外電子傳遞．據(jù)報(bào)道,菌株MR-1通過還原GO,提高了對(duì)硝基苯的厭氧生物還原速率[18]．海藻希瓦氏菌還原GO制備的還原氧化石墨烯(rGO)也能夠加速偶氮染料的厭氧生物脫色[19]．然而,在上述反應(yīng)過程中,細(xì)胞分泌的黃素在胞外污染物去除以及固態(tài)電子傳遞體GO存在下的角色還未闡明．

為此,本研究選擇廣泛應(yīng)用的高極性硝基芳香化合物間硝基苯磺酸鈉(3-NBS)作為模式污染物,以Shewanellasp. RQs-106為模式菌株,通過敲除bfe,研究黃素在3-NBS厭氧生物還原過程中的貢獻(xiàn)以及在GO介導(dǎo)的3-NBS還原過程中的作用,從而闡明黃素在高極性硝基芳香化合物胞外還原過程中的作用,為黃素類物質(zhì)在實(shí)際環(huán)境污染物處理中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)．

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 菌株來源

希瓦氏菌株Shewanellasp. RQs-106(簡(jiǎn)稱菌株RQs-106)經(jīng)實(shí)驗(yàn)室篩選并鑒定[20],在GenBank中的登錄號(hào)為MF168410;FAD轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因缺失菌株Δbfe經(jīng)實(shí)驗(yàn)室制備并鑒定[20]．

1.2 試 劑

3-NBS、間氨基苯磺酸鈉(3-ABS)、四乙基溴化銨購自上海麥克林生化科技有限公司,分析純;乙腈為色譜純．

磷酸鹽緩沖液:6.7 g/L K2HPO4·3H2O,2.8 g/L KH2PO4,pH=7.2．

萃取緩沖液(EB):100 mmol/L甲酸銨,100 mmol/L甲酸,25%甲醇．

1.3 培養(yǎng)基

(1)LB培養(yǎng)基

5.0 g/L酵母浸粉,10.0 g/L NaCl,10.0 g/L蛋白胨,pH=7.2．

(2)基礎(chǔ)培養(yǎng)基

6.70 g/L K2HPO4·3H2O,2.80 g/L KH2PO4,0.20 g/L MgCl2·6H2O,1.00 g/L NH4Cl,0.02 g/L CaCl2,pH=7.2．

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

(1)3-NBS厭氧生物還原實(shí)驗(yàn)

在65 mL棕色血清瓶中加入50 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基,丁基膠塞封口后曝N220 min,鉗口鋁蓋密封并于121 ℃下滅菌20 min,待冷卻后移入?yún)捬跸?向體系中分別加入一定濃度乳酸鈉和3-NBS,混勻后加入菌懸液至所需濃度,于30 ℃搖床150 r/min培養(yǎng),定時(shí)取樣,并測(cè)定體系內(nèi)3-NBS、3-ABS和黃素濃度．

研究不同細(xì)胞濃度(0～0.2 g/L)對(duì)3-NBS的生物還原特性,反應(yīng)條件為乳酸鈉濃度40 mmol/L,30 ℃,pH 7.2．

(2)黃素對(duì)3-NBS厭氧生物還原的影響

研究不同濃度3-NBS(0.01～2.0 mmol/L)的生物還原特性及其反應(yīng)過程中黃素濃度變化,反應(yīng)條件為細(xì)胞濃度0.15 g/L,乳酸鈉濃度40 mmol/L,30 ℃,pH 7.2．

研究了菌株RQs-106和菌株Δbfe對(duì)3-NBS的生物還原特性,以及20 mg/L GO對(duì)菌株RQs-106和菌株Δbfe還原3-NBS的影響,反應(yīng)條件為細(xì)胞濃度0.15 g/L,3-NBS濃度0.2 mmol/L,乳酸鈉濃度40 mmol/L,30 ℃,pH 7.2．

1.5 測(cè)定方法

菌體濃度測(cè)定:在600 nm處測(cè)定光密度(OD)(METASH,UV-5500紫外可見分光光度計(jì))．

3-NBS和3-ABS濃度測(cè)定:使用高效液相色譜儀(HPLC,LC-20AT,Shimadzu)測(cè)定,色譜柱型號(hào)為Sapphire-C18(5 μm,4.6 mm×250 mm),柱溫箱溫度為40 ℃;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為260和293 nm;流動(dòng)相為80%超純水(含1 g/L四乙基溴化銨),20%乙腈(色譜純);流動(dòng)相條件為流速1 mL/min,進(jìn)樣量10 μL．

使用假一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型來描述3-NBS的厭氧生物還原過程,假一級(jí)動(dòng)力學(xué)常數(shù)k由下式計(jì)算得出:

ct=c0e-kt

(1)

式中:c0表示初始時(shí)刻3-NBS濃度,mmol/L;ct表示t時(shí)刻3-NBS濃度,mmol/L;t表示反應(yīng)時(shí)間,h;k表示假一級(jí)動(dòng)力學(xué)常數(shù),h-1．

胞內(nèi)外黃素樣品制備與測(cè)定[21]:收集各個(gè)反應(yīng)體系中的樣品1 mL并離心(10 000g, 20 min,4 ℃),上清液過0.22 μm濾膜后用于測(cè)定胞外黃素濃度;菌餅使用磷酸鹽緩沖液清洗并離心(10 000g,20 min,4 ℃),然后加入1 mL EB溶液振蕩均勻,置于80 ℃水浴10 min后,離心(20 000g,20 min,4 ℃)并收集上清液,過0.22 μm濾膜后用于測(cè)定胞內(nèi)黃素濃度．樣品制備完畢后采用高效液相色譜-熒光檢測(cè)器進(jìn)行黃素類物質(zhì)檢測(cè)[21]．

胞內(nèi)蛋白物質(zhì)測(cè)定:Bradford[22]法檢測(cè)細(xì)胞蛋白含量．

GO反應(yīng)前后的表征:使用X射線光電子能譜儀(XPS,ESCALAB 250Xi,Thermo Fisher)分析GO表面的化學(xué)組成成分．將反應(yīng)后的菌液離心(10 000g,20 min,4 ℃),去掉上清液,將沉淀依次經(jīng)2 mol/L氫氧化鈉溶液、1 mol/L鹽酸溶液、乙醇溶液和超純水清洗后,最后將獲得的材料進(jìn)行冷凍干燥處理,研磨后進(jìn)行光電子能譜表征,并與初始GO進(jìn)行比較．

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)胞濃度對(duì)3-NBS生物還原的影響

如圖1所示,隨著細(xì)胞濃度的增高,3-NBS的厭氧生物還原速率明顯增大;當(dāng)細(xì)胞濃度為0.15和0.20 g/L時(shí),菌株RQs-106在48 h內(nèi)對(duì)3-NBS的去除率均在90%以上,去除速率分別為0.025 0和0.019 5 mmol/(h·g),因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞濃度為0.15 g/L．在反應(yīng)過程中,還檢測(cè)到還原產(chǎn)物3-ABS的生成．這表明,菌株RQs-106能夠通過還原3-NBS將其去除．

(a) 3-NBS還原

(b) 3-ABS生成

2.2 3-NBS濃度對(duì)生物還原及分泌胞外黃素的影響

本實(shí)驗(yàn)中3-NBS的厭氧生物還原過程遵循假一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型．如圖2所示,隨著3-NBS濃度的增高,假一級(jí)動(dòng)力學(xué)常數(shù)k逐漸增大．當(dāng)3-NBS濃度為1.00 mmol/L,k達(dá)到最大．在反應(yīng)體系的上清液中檢測(cè)到胞外黃素單核苷酸(FMN)和核黃素(RF)．當(dāng)3-NBS濃度為0 mmol/L,細(xì)胞分泌1.45 μmol/g黃素至胞外．隨著3-NBS濃度的升高,胞外黃素濃度也呈現(xiàn)上升趨勢(shì),并呈正相關(guān)(R2=0.89)．上述結(jié)果表明,3-NBS濃度的增高會(huì)刺激菌株RQs-106分泌更多黃素．研究表明,希瓦氏菌分泌的黃素在生物電解池系統(tǒng)中能夠顯著增強(qiáng)電流的產(chǎn)生,加速胞外電子傳遞速率[8]．其加速機(jī)制包括黃素單核苷酸和核黃素通過與外膜細(xì)胞色素C(c-Cyts)特異性結(jié)合[23]傳遞電子和以游離型黃素作為氧化還原穿梭體的間接電子傳遞過程[12-13]．因此,本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到的這些黃素作為氧化還原介體加強(qiáng)了細(xì)胞與3-NBS之間的胞外電子傳遞過程,從而促進(jìn)了3-NBS還原速率的增大．

圖2 3-NBS濃度對(duì)菌株RQs-106介導(dǎo)的生物

2.3 黃素對(duì)3-NBS生物還原的影響

比較了菌株RQs-106和菌株Δbfe還原3-NBS的能力,結(jié)果如圖3(a)所示．與不加菌株的對(duì)照組相比,這兩種菌株均具有還原3-NBS的能力,其還原3-NBS的動(dòng)力學(xué)常數(shù)分別為0.074 h-1(ka,R2=0.93)和0.033 h-1(kb,R2=0.98)．同時(shí)檢測(cè)了胞內(nèi)外黃素濃度的變化,如圖3(b)所示,這兩種菌株的胞內(nèi)黃素濃度均隨時(shí)間呈下降趨勢(shì),胞外黃素則逐漸增多,并且胞外黃素的增加量遠(yuǎn)高于胞內(nèi)黃素的減少量,表明菌株RQs-106和菌株Δbfe均可以持續(xù)合成并分泌黃素．反應(yīng)48 h后,胞外黃素濃度均達(dá)到最大,分別為2.41和1.86 μmol/g．可以看出,菌株Δbfe比菌株RQs-106胞外黃素分泌量減少了22.8%,這部分黃素對(duì)3-NBS生物還原的貢獻(xiàn)率為55.4%．可見,菌株RQs-106厭氧還原3-NBS的過程是以乳酸鈉為電子供體,將氧化產(chǎn)生的電子通過細(xì)胞外膜直接或者經(jīng)黃素傳遞到胞外電子受體3-NBS,使其被還原為3-ABS．

(a) 還原3-NBS

(b) 分泌黃素

2.4 黃素對(duì)GO介導(dǎo)的3-NBS生物還原的影響

如圖4(a)所示,當(dāng)加入20 mg/L GO時(shí),菌株RQs-106和菌株Δbfe還原3-NBS的假一級(jí)動(dòng)力學(xué)常數(shù)分別為0.122 h-1(kc,R2=0.99)和0.063 h-1(kd,R2=0.99)．與圖3(a)中無GO體系相比,GO介導(dǎo)的3-NBS還原速率分別提高了64.9%和90.9%．對(duì)反應(yīng)體系中的GO進(jìn)行XPS分析(圖5)表明,反應(yīng)42 h后,GO的n(C)/n(O)由反應(yīng)初始的1.76增至1.96．上述結(jié)果表明,GO表面部分含氧基團(tuán)被還原,即GO被還原為rGO．因rGO具有良好的電子傳遞性能,使其能夠增大胞外電子傳遞速率,從而導(dǎo)致3-NBS還原速率增大．在GO存在條件下,bfe基因的缺失也導(dǎo)致了菌株Δbfe還原3-NBS的速率下降．這表明胞外分泌的黃素參與了GO介導(dǎo)的3-NBS還

(a) GO介導(dǎo)3-NBS還原

圖5 GO反應(yīng)前后的XPS圖

原過程．反應(yīng)42 h時(shí),分析了反應(yīng)體系中上清液以及細(xì)胞和GO復(fù)合體中的黃素,結(jié)果如圖4(b)所示．菌株RQs-106體系中,細(xì)胞和GO復(fù)合體中的黃素濃度比菌株Δbfe體系略高,而其胞外游離的黃素濃度為2.12 μmol/g,比菌株Δbfe體系(1.52 μmol/g)高39.5%．這表明僅有少量的黃素吸附在GO上,參與了GO介導(dǎo)的3-NBS還原．

根據(jù)圖3與圖4中不同體系內(nèi)3-NBS的還原速率,以20 mg/L GO介導(dǎo)的菌株RQs-106對(duì)3-NBS的假一級(jí)動(dòng)力學(xué)常數(shù)為100%,經(jīng)表1中的公式計(jì)算可得bfe基因缺失對(duì)不同體系中3-NBS還原的影響．如表1所列,bfe基因缺失會(huì)導(dǎo)致GO介導(dǎo)體系的3-NBS還原速率降低48.4%．其中,黃素對(duì)3-NBS直接還原的貢獻(xiàn)率為33.7%,參與GO介導(dǎo)下的3-NBS還原的貢獻(xiàn)率為14.7%．

表1 GO介導(dǎo)3-NBS厭氧生物還原體系中各部分貢獻(xiàn)

外膜c-Cyts已被證明可作為電子穿梭體的胞外末端還原酶[24],缺失外膜蛋白MtrC和OmcA基因時(shí),菌株MR-1還原3-NBS的速率會(huì)降低,但仍然具有還原能力[25]．這表明菌株MR-1能夠通過其他途徑還原3-NBS．本研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞分泌的黃素參與了3-NBS的厭氧生物還原．有研究表明,菌株MR-1分泌的黃素在細(xì)胞和外部電子受體之間能夠循環(huán)進(jìn)行電子穿梭作用[26]．并且研究發(fā)現(xiàn),在還原固態(tài)電子受體電極和不溶性鐵過程中,胞外黃素的貢獻(xiàn)率為75%～80%[8,14]．可見,細(xì)胞分泌的微量黃素在還原固態(tài)電子受體過程中起到了重要作用．本研究發(fā)現(xiàn)胞外黃素對(duì)溶解態(tài)污染物3-NBS還原的貢獻(xiàn)率超過了50%(圖3),這表明胞外黃素在還原3-NBS過程中也起到重要作用．當(dāng)外加固態(tài)電子傳遞體GO時(shí),由于GO具有一定的吸附性能,黃素通過吸附到GO上來參與GO介導(dǎo)的3-NBS的還原．在這一過程中,黃素將電子傳遞給GO,使GO被還原為rGO．但黃素的貢獻(xiàn)率并不高,推測(cè)可能是因?yàn)楸晃降紾O上的黃素濃度很低,并且不能進(jìn)行循環(huán)使用．在反應(yīng)過程中,可以觀察到細(xì)胞與GO易復(fù)合在一起．可見,GO主要是由細(xì)胞直接還原,從而加速3-NBS的還原．通過檢測(cè)含有20 mg/L GO的反應(yīng)體系中黃素的分布可知,游離態(tài)黃素濃度相對(duì)較高,因此其對(duì)3-NBS直接還原的貢獻(xiàn)也較大．如果提高GO濃度,會(huì)有更多的黃素被吸附在GO上,但另一方面,GO濃度的提高也會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生更大的毒性[27]．因此,可提高GO的吸附性能,使其能夠吸附更多的胞外黃素,同時(shí)也可增強(qiáng)生物還原后的GO的氧化還原性能．

3 結(jié) 論

(1)當(dāng)細(xì)胞濃度為0.15～0.20 g/L時(shí),菌株RQs-106在48 h內(nèi)對(duì)3-NBS的去除率均在90%以上．

(2)3-NBS濃度的增高會(huì)刺激菌株RQs-106分泌更多黃素類物質(zhì),從而促進(jìn)3-NBS還原速率增大．

(3)bfe基因缺失導(dǎo)致GO介導(dǎo)體系的3-NBS還原速率降低48.4%．其中,游離態(tài)黃素對(duì)3-NBS還原的貢獻(xiàn)率為33.7%,參與GO介導(dǎo)下的3-NBS還原的貢獻(xiàn)率為14.7%．

本研究揭示了黃素在胞外高極性硝基芳烴污染物厭氧生物還原過程中的作用,以及在外加固態(tài)電子傳遞體GO條件下的貢獻(xiàn)．為更深入闡明黃素的作用,底物濃度及電子傳遞體濃度的影響還有待研究,以期為細(xì)胞分泌的黃素類物質(zhì)在實(shí)際環(huán)境污染物處理中的充分利用提供理論依據(jù)．