徐希,齊月

遼寧中醫(yī)藥大學(xué),遼寧 沈陽 110847

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)指由糖尿病(diabetes mellitus,DM)引起的高度特異性神經(jīng)血管并發(fā)癥,是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一[1],也是工作年齡人群視力喪失的主要原因[2]。據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟估計,全球糖尿病視網(wǎng)膜病變的患病人數(shù)將從2020年的1.03億增加到2045年的1.6億[3],而中國和印度等發(fā)展中國家的情況將更加嚴(yán)峻,超過三分之一的糖尿病患者表現(xiàn)出不可逆的失明跡象[4]。除了對視力的損傷之外,糖尿病視網(wǎng)膜病變的存在還意味著威脅生命的全身血管并發(fā)癥風(fēng)險增加,包括腎臟、心臟、神經(jīng)等[5]。

臨床上將DR分為兩個階段,非增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變(non-proliferative diabetic retinopathy,NPDR)和增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy,PDR)。NPDR階段常常以微血管動脈瘤、出血、硬性滲出為主要病理改變,但是患者通常不會表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀。隨著病情進(jìn)展,PDR階段以新生血管形成為主要病理改變,出現(xiàn)玻璃體出血及牽拉性視網(wǎng)膜脫落等嚴(yán)重?fù)p害患者視力的臨床表現(xiàn)[6],其發(fā)病機(jī)制尚不明確,可能與代謝紊亂、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、遺傳免疫等因素導(dǎo)致視網(wǎng)膜的神經(jīng)血管結(jié)構(gòu)及功能損傷相關(guān)[7]。目前,DR主要采用激光光凝、玻璃體內(nèi)注射血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)藥物、激素治療及手術(shù)治療。雖然上述療法在一定程度上可改善患者視力,但存在不良反應(yīng)多、治療費(fèi)用高、患者依從性差等問題[8]。因此,為DR患者選擇合適有效的治療方法成為臨床亟待解決的問題。

糖尿病視網(wǎng)膜病變屬中醫(yī)學(xué)“消渴內(nèi)障”“視瞻昏渺”“暴盲”等范疇,其病機(jī)多以消渴病陰虛燥熱為先,病變?nèi)站脫p及肝腎,肝腎之陰虧虛,不能上榮于目所致[9]。枸杞子-菊花藥對具有滋補(bǔ)肝腎、益精明目的功效,廣泛應(yīng)用于中醫(yī)眼科治療糖尿病視網(wǎng)膜病變,其中杞菊地黃丸為中醫(yī)眼科經(jīng)典成藥[10]。同時現(xiàn)代藥理學(xué)也證實(shí),枸杞子-菊花藥對可以通過抗炎、抗氧化治療DR[11]。因此,本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù),以系統(tǒng)生物學(xué)思想為基礎(chǔ),“一藥多靶”和“多成分多靶點(diǎn)”為研究思路構(gòu)建藥物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖,與中醫(yī)學(xué)“整體觀念”與“辨證論治”的指導(dǎo)思想相契合,多維度立體化探究枸杞子-菊花藥對治療DR的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 枸杞子-菊花藥對活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)的獲取利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)檢索枸杞子、菊花的化學(xué)成分,根據(jù)藥代動力學(xué)參數(shù)(absorption、distribution、metabolism、excretion,ADEM)設(shè)置口服生物利用度(oral bioavail-ability,OB)≥30%及類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18篩選出枸杞子、菊花的活性成分。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫預(yù)測枸杞子、菊花活性成分相關(guān)靶點(diǎn),同時刪去未檢索出相關(guān)靶點(diǎn)的活性成分。利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)將所獲靶點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化并獲得基因名。利用Cytoscape3.9.1繪制“藥對-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖,并進(jìn)行拓?fù)浞治龊Y選枸杞子-菊花藥對治療DR的主要活性成分。

1.2 DR相關(guān)靶點(diǎn)的搜集及枸杞子-菊花藥對治療DR的潛在靶點(diǎn)的獲取將檢索詞設(shè)置為“Diabetic Retionpathy”,利用GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(online mendelian inheritance in man,OMIM,https://omim.org/)及藥物靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(therapeutic target database,TTD,http://db.idrblab.net/ttd/)檢索并獲得DR相關(guān)靶點(diǎn),整合所有疾病數(shù)據(jù)庫DR相關(guān)的靶基因并刪除重復(fù)項(xiàng),建立疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫。將篩選出的活性成分相關(guān)靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在線平臺,繪制韋恩圖,交集靶點(diǎn)即為枸杞子-菊花藥對治療DR的潛在靶點(diǎn)。

1.3 蛋白質(zhì)互作(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將枸杞子-菊花藥對治療DR的潛在靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/,Version 11.5),物種限定為“Homo sapiens”,設(shè)置最低要求互作分?jǐn)?shù)0.4并隱藏游離靶點(diǎn),構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,并下載“tsv”格式表格,導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件中繪制PPI網(wǎng)絡(luò),使用“Tools”工具下的“Network Analysis”對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?依據(jù)分析結(jié)果中的度值(Degree),調(diào)節(jié)節(jié)點(diǎn)的位置及大小。根據(jù)CytoNCA插件篩選出中介中心性(betweenness centrality,BC)、接近中心性(closeness centrality,CC)、度中心性(degree centrality,DC)三者均大于中位數(shù)值的靶點(diǎn),并取這些靶點(diǎn)中Degree值排名前30位的靶點(diǎn)為枸杞子-菊花藥對治療DR的核心靶點(diǎn)。

1.4 富集分析將枸杞子-菊花藥對治療DR的核心靶點(diǎn)輸入Metascape在線平臺(http://metascape.org)進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)富集分析及京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信號通路富集分析。Species選擇H.sapiens,設(shè)置最小交疊數(shù)為3,P<0.01,最小富集數(shù)為1.5,預(yù)測核心靶點(diǎn)參與調(diào)控的生物學(xué)過程及相關(guān)信號通路。通過在線繪圖軟件繪制柱狀圖及氣泡圖將部分GO富集結(jié)果及排名前20位的KEGG通路富集結(jié)果可視化。將活性成分、核心靶點(diǎn)、信號通路導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件構(gòu)建“活性成分-作用靶點(diǎn)-信號通路-DR”網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 枸杞子-菊花藥對活性成分及靶點(diǎn)利用TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索枸杞子、菊花的所有化學(xué)成分,以O(shè)B≥30%及DL≥0.18為限定條件,篩選出枸杞子、菊花的活性成分65種,共同成分有槲皮素、β-谷甾醇2種。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫預(yù)測枸杞子、菊花活性成分相關(guān)靶點(diǎn),合并去重并刪除未檢索出相關(guān)靶點(diǎn)的活性成分后,共獲得活性成分52種。部分活性成分信息見表1。通過TCMSP預(yù)測52種活性成分相關(guān)靶點(diǎn),合并并刪除重復(fù)及假陽性后,獲得活性成分相關(guān)靶點(diǎn)247個。將活性成分及靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件構(gòu)建 “藥對-活性成分-作用靶點(diǎn)” 可視化網(wǎng)絡(luò)圖,該網(wǎng)絡(luò)共有317個節(jié)點(diǎn)和907條邊,其中淺粉色節(jié)點(diǎn)代表枸杞子活性成分,綠色節(jié)點(diǎn)代表菊花活性成分,橙色及深粉色節(jié)點(diǎn)代表兩者相同活性成分,黃色節(jié)點(diǎn)代表活性成分相應(yīng)靶點(diǎn)。對該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治龊?篩選出度值排名前10位的活性成分,分別為槲皮素(quercetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、山柰酚(kaempferol)、木犀草素(luteolin)、柚皮素(naringenin)、異鼠李亭(isorhamnetin,)、豆甾醇(Stigmasterol)、阿托品(Atropine)、金合歡素(acacetin)、黃豆黃素(glycitein),提示上述活性成分為枸杞子-菊花藥對治療DR的主要活性成分。見圖1。

圖1 “藥對-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

表1 枸杞子-菊花部分活性成分信息表

2.2 DR相關(guān)靶點(diǎn)將檢索詞設(shè)置為“Diabetic Retionpathy”,通過GeneCards、OMIM及TTD數(shù)據(jù)庫分別檢索得到DR相關(guān)靶點(diǎn)2 165個、229個、30個,合并并刪除重復(fù)項(xiàng)后共獲得疾病靶點(diǎn)2 347個。將247個活性成分相關(guān)靶點(diǎn)與2 347個疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1在線平臺,繪制韋恩圖,得到133個交集靶點(diǎn),即為枸杞子-菊花藥對治療DR的潛在靶點(diǎn)。見圖2。

圖2 枸杞子-菊花藥對活性成分靶點(diǎn)與DR靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)將枸杞子-菊花藥對治療DR的潛在靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫,物種限定為“Homo sapiens”,設(shè)置最低要求互作分?jǐn)?shù)0.4并隱藏游離靶點(diǎn),構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,下載“tsv”格式表格并導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件,構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),該網(wǎng)絡(luò)共有133個節(jié)點(diǎn),269條邊,平均度值為40.4。網(wǎng)絡(luò)圖中節(jié)點(diǎn)越大、顏色越深代表該節(jié)點(diǎn)的Degree值越大。利用Cytoscape 3.9.1中CytoNCA插件篩選出網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)DC、CC、BC值均大于中位數(shù)的靶點(diǎn),取這些靶點(diǎn)中Degree值排名前30位的靶點(diǎn)為枸杞子-菊花藥對治療DR的核心靶點(diǎn),其中包括蛋白激酶Bα(protein kinase Bα,AKT1)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤抗原P53(tumor antigen p53,TP53)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3,CASP3)、絲裂原激活蛋白激酶3(mitogen activated protein kinase 3,MAPK3)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)等。見圖3、圖4及表2。

圖3 潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表2 枸杞子-菊花藥對治療DR核心靶點(diǎn)

2.4 核心靶點(diǎn)GO富集分析將枸杞子-菊花藥對治療DR的30個核心靶點(diǎn)輸入Metascape在線平臺進(jìn)行GO富集分析,得到生物過程(biological process,BP)919個、細(xì)胞組分(cellular component,CC)23個、分子功能(molecular function,MF)47個。生物過程主要包括細(xì)胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)(cellular response to chemical stress)、對氧氣水平下降的反應(yīng)(response to decreased oxygen levels)、對氧氣水平的反應(yīng)(response to oxygen levels)、細(xì)胞遷移的正向調(diào)節(jié)(positive regulation of cell migration)、細(xì)胞運(yùn)動的正向調(diào)節(jié)(positive regulation of cell motility)、細(xì)胞成分運(yùn)動的正向調(diào)節(jié)(positive regulation of cellular component movement)、運(yùn)動的正向調(diào)節(jié)(positive regulation of locomotion)、凋亡信號通路的調(diào)控(regulation of apoptotic signaling pathway)、對缺氧的反應(yīng)(response to hypoxia)、對激素的反應(yīng)(response to hormone)、對氧化應(yīng)激的反應(yīng)(response to oxidative stress)、對無機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)(response to inorganic substance)、腺體發(fā)育(gland development)、小分子代謝過程的正調(diào)控(positive regulation of small molecule metabolic process)、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控(positive regulation of protein phosphorylation)、對脂多糖的反應(yīng)(response to lipopolysaccharide)、細(xì)胞對生長因子刺激的反應(yīng)(cellular response to growth factor stimulus)等;細(xì)胞組分主要涉及質(zhì)膜穴樣內(nèi)陷(caveola)、薄膜筏(membrane raft)、膜微區(qū)(membrane microdomain)、質(zhì)膜膜筏(plasma membrane raft)等;分子功能主要與轉(zhuǎn)錄協(xié)同調(diào)節(jié)因子結(jié)合(transcription coregulator binding)、細(xì)胞因子活性(cytokine activity)、細(xì)胞因子受體結(jié)合(cytokine receptor binding)、受體配體活性(receptor ligand activity)、蛋白酶結(jié)合(protease binding)、蛋白激酶結(jié)合(protein kinase binding)、生長因子受體結(jié)合(growth factor receptor binding)等相關(guān)。結(jié)果表明,枸杞子-菊花藥對通過多種生物過程及分子功能干預(yù)DR發(fā)展進(jìn)程。見圖5。

圖5 枸杞子-菊花核心靶點(diǎn)GO富集分析柱狀圖

2.5 核心靶點(diǎn)KEGG信號通路富集分析將枸杞-菊花藥對治療DR的30個核心靶點(diǎn)輸入Metascape在線平臺進(jìn)行KEGG信號通路富集分析,得到134條信號通路,根據(jù)校正P值篩選出排名前20位的信號通路,其中包括癌癥通路(pathways in cancer)、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetes complications)、白細(xì)胞介素-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化(lipid and atherosclerosis)、人巨細(xì)胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、腫瘤壞死因子信號通路(tumor necrosis factor signaling pathway)、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B signaling pathway)、絲裂原活化蛋白激酶信號通路(mitogen activated protein kinase signaling pathway)、膀胱癌(bladder cancer)、非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease)、乙型肝炎病毒(hepatitis B)、酒精性肝病(alcoholic liver disease)、乳腺癌(breast cancer)、細(xì)胞衰老(cellular senescence)、丙型肝炎(hepatitis C)等,以上結(jié)果表明枸杞子-菊花藥對通過多種信號通路治療DR。見圖6。

圖6 KEGG信號通路富集分析氣泡圖

2.6 “活性成分-作用靶點(diǎn)-信號通路-DR”網(wǎng)絡(luò)將活性成分、核心靶點(diǎn)、信號通路導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件構(gòu)建“活性成分-作用靶點(diǎn)-信號通路-DR”網(wǎng)絡(luò),該網(wǎng)絡(luò)中有207個節(jié)點(diǎn)和782條邊,藍(lán)色圓形節(jié)點(diǎn)代表藥物活性成分,粉色正六邊形節(jié)點(diǎn)代表信號通路,黃色矩形代表成分作用靶點(diǎn),節(jié)點(diǎn)的大小及顏色的深淺代表其對應(yīng)Degree值,節(jié)點(diǎn)越大顏色越深代表該節(jié)點(diǎn)越重要。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)圖可直觀的看出枸杞子、菊花藥對通過槲皮素(A1)、β-谷甾醇(A2)、山柰酚(JH7)、木犀草素(JH9)、柚皮素(JH14)等活性成分作用于PTGS2、RELA、CASP3、AKT1、MAPK3、TP53、IL-6等靶點(diǎn)調(diào)控糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路、PI3K-AKT信號通路、MAPK信號通路等。上述結(jié)果表明,枸杞子-菊花藥對通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路作用于DR。見圖7。

圖7 “活性成分-作用靶點(diǎn)-信號通路-DR”網(wǎng)絡(luò)

3 討論

糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一,現(xiàn)代中醫(yī)將其稱為“消渴內(nèi)障”“消渴目病”,其發(fā)病多因消渴日久,腎陰虧虛,水不涵木,導(dǎo)致肝陰肝血不足,目睛失于濡養(yǎng),亦或是肝陰虧虛,虛火上炎灼傷目絡(luò),熱迫血妄行而致視力急速下降,甚至暴盲[12]。在《秘傳證治要訣及類方》中有“三消久之,精血既虧,或目無所見,或手足偏廢”的記載,進(jìn)一步驗(yàn)證了消渴病所導(dǎo)致的目疾多因肝腎精血不足,不能上承目竅所致[13]?！睹貍餮劭讫埬菊摗匪浴澳I是肝之母,今腎受風(fēng)毒,故令肝虛,肝虛則目中恍惚”,說明消渴以腎虛為先,日久虛火內(nèi)生耗竭腎陰,進(jìn)而損傷子臟,導(dǎo)致肝腎虧虛,并發(fā)消渴目病[14]。針對消渴目病的發(fā)病機(jī)制,遣方施治不僅需要滋補(bǔ)肝腎,同時應(yīng)配伍輕清上浮之品,以達(dá)到標(biāo)本兼施、補(bǔ)而不滯之功效[15]。枸杞子味甘性平,歸肝腎二經(jīng),具有滋養(yǎng)肝腎、益精明目之功效;菊花味甘、苦,性微寒,歸肝肺二經(jīng),有平肝明目,散風(fēng)清熱之功效[16];枸杞子以補(bǔ)為主、菊花以清為要,枸杞子滋腎精、益肝血,補(bǔ)肝腎之陰以明目,菊花疏散風(fēng)熱、清肝明目,兩者相互配伍,既滋腎養(yǎng)肝明目治其本,又清肝瀉熱以治其標(biāo),一補(bǔ)一清,滋水涵木,成為中醫(yī)藥防治糖尿病視網(wǎng)膜病變極佳藥對[17]。

本研究通過構(gòu)建藥對-活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖發(fā)現(xiàn),槲皮素(quercetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、山柰酚(beta-sitosterol)、木犀草素(luteolin)、柚皮素(naringenin)可能是枸杞子-菊花藥對治療DR的核心活性成分。槲皮素屬于類黃酮化合物,具有抗氧化、炎癥、腫瘤、新生血管生成等功效[18]。高遷移率族蛋白(high mobility group box-1 protein,HMGB1)是慢性組織炎癥的重要起始因子。高糖誘導(dǎo)HMGB1過度表達(dá),與Toll樣受體4(toll-like Receptor 4,TLR4)結(jié)合后,導(dǎo)致核因子-κB(the nuclear factor-κB,NF-κB)的活性增加,并誘導(dǎo)下游效應(yīng)物NLRP3炎癥小體的合成,促進(jìn)Caspase-1、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白細(xì)胞介素-18(interleukin-18,IL-18)的成熟,參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)[19]。研究表明,槲皮素可以抑制HMGB1/TLR4/NF-κB/NLRP3炎癥小體/IL-1β/IL-18軸,減少促炎因子的釋放,抑制血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和可溶性細(xì)胞間黏附分子-1(soluble intercellular adhesion molecule-1,sICAM-1)分泌,阻止視網(wǎng)膜新生血管生成,此外,槲皮素還通過誘導(dǎo)血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)上調(diào)視網(wǎng)膜腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)的表達(dá),保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞,改善高糖誘導(dǎo)下視網(wǎng)膜組織學(xué)的改變[20]。

β-谷甾醇是一種植物甾醇,具有降膽固醇、降血糖和抗炎等多種功效[21]。研究發(fā)現(xiàn),β-谷甾醇可改善糖尿病誘導(dǎo)的大鼠的血糖、血清胰島素、脂質(zhì)譜、氧化應(yīng)激標(biāo)志物、抗氧化酶、胰島素受體(insulin receptor,IR)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucose transporter type 4,GLUT4)的改變,從而促進(jìn)GLUT4合成和葡萄糖吸收,來改善血糖控制[22]。

山柰酚是一種低分子量天然黃酮類化合物,可調(diào)節(jié)與凋亡、血管生成、自噬、炎癥等相關(guān)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[23]。視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelium,RPE)損傷是導(dǎo)致DR病程進(jìn)展的重要因素之一,糖脂毒性引起的氧化應(yīng)激為RPE損傷的主要誘因。山柰酚通過參與Bax/Bcl-2和Caspase-3信號通路以及抑制血管內(nèi)皮生長因子基因表達(dá)保護(hù)人RPE細(xì)胞(RPE-19)免受過氧化氫誘導(dǎo)的損傷和凋亡,從而延緩DR病程的進(jìn)展[24]。

木犀草素是一種天然存在的黃酮類化合物,具有抗炎、抗氧化、抗癌等功效[25]。NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白1(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 1,NLRP1)和NLRP3促進(jìn)IL-18和IL-1β的表達(dá),從而激活Caspase-1導(dǎo)致DR中視網(wǎng)膜組織進(jìn)行性損傷[26]。研究發(fā)現(xiàn),木犀草素可以減少NLRP1、還原型輔酶Ⅱ氧化酶-4 (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase type 4,NOX4)、NLRP3蛋白的表達(dá)并調(diào)節(jié)NLRP/NOX4信號通路預(yù)防糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡[27]。柚皮苷是一種天然黃酮苷化合物,其具有較強(qiáng)的抗炎和抗氧化活性[28]。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)信號通路是抵抗氧化應(yīng)激損傷的主要途徑。一旦機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激,Nrf2在細(xì)胞核中與抗氧化響應(yīng)元件(antioxidant response element,ARE)結(jié)合,保持氧化和抗氧化之間的平衡,維持細(xì)胞的正常功能[29]。柚皮素通過激活Nrf2-ARE信號通路,提高大鼠視網(wǎng)膜組織Nrf2、HO-1和NQO1蛋白水平,發(fā)揮對DR大鼠氧化應(yīng)激的保護(hù)作用[30]。

構(gòu)建PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及并進(jìn)行可視化分析發(fā)現(xiàn),AKT1、IL-6、VEGFA、TNF、TP53等可能是枸杞-菊花藥對治療DR的關(guān)鍵靶點(diǎn),進(jìn)一步進(jìn)行KEGG通路富集分析,結(jié)果表明上述關(guān)鍵基因主要富集在糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE、IL-17、HIF-1、TNF、PI3K-AKT等信號通路。晚期糖基化終產(chǎn)物在糖尿病并發(fā)癥的病理生理學(xué)中起重要作用。糖尿病持續(xù)性的高血糖狀態(tài)導(dǎo)致蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸發(fā)生一系列非酶糖基化反應(yīng),該反應(yīng)會導(dǎo)致晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)的產(chǎn)生[31]。所產(chǎn)生的AGEs與其主要細(xì)胞受體RAGE結(jié)合激活下游信號因子,如應(yīng)激活化蛋白激酶/c-Jun N-末端激酶(stress-activated protein kinase/c-Jun N-terminal kinase,SAPK/JNK)和Ras介導(dǎo)的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular regulated kinase 1/2,ERK1/2)和Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活因子(Janus kinases/ signal transducer and activator of transcription,JAK/STAT)通路,使轉(zhuǎn)錄因子如 NF-κB、信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia inducible factor 1,HIF1)和AP-1的持續(xù)激活,導(dǎo)致氧化應(yīng)激和炎癥增強(qiáng)[32]。研究表明,通過抑制 AGEs/RAGE/NF-κB通路來下調(diào)炎癥因子的表達(dá)可改善糖尿病大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)、外核層的水腫情況,減少神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的丟失[33]。

白細(xì)胞介素-17A(interleukin-17A,IL-17A)屬于IL-17家族的標(biāo)志性細(xì)胞因子,是一種促炎細(xì)胞因子[34]。Müller細(xì)胞是視網(wǎng)膜的主要神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,參與血-視網(wǎng)膜屏障的形成,調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜谷氨酸鹽代謝,并支持視網(wǎng)膜神經(jīng)元存活。IL-17A經(jīng) IL-17 受體A(IL-17RA)激活A(yù)ct1-TRAF6-IKK-NF-κB信號通路損害Müller細(xì)胞功能,導(dǎo)致糖尿病視網(wǎng)膜病變惡化[35]。

HIF-1信號通路主要控制組織或細(xì)胞對缺氧的適應(yīng)。HIF-1α是HIF家族成員中的關(guān)鍵因子,參與細(xì)胞存活、血管生成、能量代謝[36]。研究發(fā)現(xiàn),HIF1α所誘導(dǎo)的HIF1α-PFKFB3通路與DR病理性血管生成和神經(jīng)變性相關(guān)。一方面,HIF-1α激活下游PFKFB3決定內(nèi)皮末梢細(xì)胞的競爭促使萌芽血管生成。另一方面,PFKFB3驅(qū)動的糖酵解損害了神經(jīng)元的抗氧化能力,導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和反應(yīng)性神經(jīng)膠質(zhì)增生,因此,抑制HIF1α-PFKFB3通路可減少新生血管生成及視網(wǎng)膜神經(jīng)變性,有助于延緩DR的病程進(jìn)展[37]。

PI3K/AKT/mTOR信號通路是自噬中常見的通路,在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、分化、增殖和遷移中起重要作用[38]。自噬是溶酶體介導(dǎo)的降解過程,在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用,然而過度激活的自噬可能導(dǎo)致視網(wǎng)膜變性疾病早期階段的細(xì)胞死亡,加快疾病進(jìn)展[39]。研究發(fā)現(xiàn),人參皂苷Rg3能夠通過激活 PI3K-AKT/PKB信號通路,下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子和細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)蛋白的表達(dá),從而抑制細(xì)胞凋亡,保護(hù)糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠的視網(wǎng)膜組織[40]。

TNF-α是單核細(xì)胞因子的一種,廣泛表達(dá)于人體的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、米勒細(xì)胞、脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞等眼視網(wǎng)膜基底膜等多種細(xì)胞中。在高糖條件下,TNF-α經(jīng)米勒細(xì)胞釋放,激活EGFR/p38/NF-κB/p62通路,增加視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的有絲分裂和凋亡,加速DR的發(fā)病[41]。此外,TNF-α增強(qiáng)活性氧的合成以及IL-6、血管內(nèi)皮細(xì)胞中黏附分子的表達(dá),促進(jìn)白細(xì)胞從血流滲透到視網(wǎng)膜,加重視網(wǎng)膜內(nèi)的炎癥反應(yīng),誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷[42]。

綜上所述,枸杞子-菊花藥對可能通過槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、木犀草素、柚皮素等藥物活性成分作用于AKT1、IL-6、VEGFA、TNF、TP53等關(guān)鍵靶點(diǎn),進(jìn)而通過調(diào)控AGE-RAGE、IL-17、HIF-1、TNF、PI3K-AKT等信號通路,調(diào)節(jié)機(jī)體氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、糖脂代謝等生物過程參與DR發(fā)生、發(fā)展過程。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)從復(fù)雜的生物網(wǎng)絡(luò)角度將系統(tǒng)生物學(xué)、藥理學(xué)、信息網(wǎng)絡(luò)、計算機(jī)等學(xué)科深度融合,揭示了枸杞子-菊花藥對防治DR的作用機(jī)制,為下一步基礎(chǔ)研究、藥物研發(fā)等提供了科學(xué)依據(jù)及理論基礎(chǔ)。