陳 璐,常新宇,沈嘉忱,沈瑞廷,趙振華,侯曉林

(北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京 102206)

雞傳染性支氣管炎(infectious bronchitis,IB)是由IB病毒(infectious bronchitis virus, IBV)引起的一種急性、高度傳染性呼吸道疾病,于20世紀(jì)30年代在美國首次被發(fā)現(xiàn),它是造成全球家禽養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的最重要原因之一[1-2]。IBV主要引起禽類呼吸道疾病,此外,它也會(huì)導(dǎo)致腎炎、產(chǎn)蛋量和產(chǎn)蛋品質(zhì)下降,甚至死亡[3]。由于基因突變和重組,不同的IBV毒株表現(xiàn)出不同的特性,在致病機(jī)制、毒力、年齡取向以及受體特異性方面存在差異,迄今為止,還沒有針對(duì)IBV感染有效藥物報(bào)道,接種疫苗也不足以提供完全的保護(hù)[4],因此IBV的防控還存在巨大挑戰(zhàn)[5]。

研究表明,宿主先天免疫在抵抗IBV中發(fā)揮重要作用,是機(jī)體保護(hù)的第一道防線。IBV進(jìn)入宿主細(xì)胞,免疫系統(tǒng)識(shí)別產(chǎn)生抗病毒免疫。IBV天然免疫應(yīng)答的研究受到越來越多的關(guān)注,了解感染早期宿主細(xì)胞對(duì)抗IBV發(fā)揮的作用具有重要研究意義。

本研究使用IBV Beaudette株感染雞巨噬細(xì)胞HD11,進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)檢測(cè)分析,將差異表達(dá)基因按照功能進(jìn)行分類,分析其參與的信號(hào)通路,了解IBV感染早期宿主細(xì)胞產(chǎn)生的抗病毒反應(yīng)和免疫應(yīng)答,為探究IBV的致病機(jī)制提供理論依據(jù),從而為疫苗開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和病毒

雞巨噬細(xì)胞HD11購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫(上海),IBV Beaudette株由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)提供,現(xiàn)保存于北京農(nóng)學(xué)院基礎(chǔ)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與病毒感染

將對(duì)數(shù)生長期的HD11細(xì)胞鋪于6孔板中,當(dāng)細(xì)胞匯合率達(dá)到80%左右時(shí),感染100 TCID50的IBV,37 ℃、5%CO2孵育1 h后,棄去病毒液,加入2%維持培養(yǎng)基,2 h后收集細(xì)胞。病毒感染組命名為IBV-1、IBV-2、IBV-3,未感染病毒的細(xì)胞為對(duì)照組,分別命名為NC-1、NC-2、NC-3。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

Trizol法提取細(xì)胞總RNA,檢測(cè)合格后將RNA純化、片段化并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,使用Illumina TruseqTM RNA sample prep Kit進(jìn)行文庫構(gòu)建、Illumina NovaSeq6000上機(jī)測(cè)序分析[6]。

1.4 差異表達(dá)基因和模式識(shí)別受體的RT-qPCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性,隨機(jī)選擇10個(gè)與天然免疫、抗病毒反應(yīng)相關(guān)的差異表達(dá)基因和3個(gè)模式識(shí)別受體基因進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證(以β-Actin為內(nèi)參基因,引物由上海生工生物工程有限公司合成,詳見表1)。擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性15 s,60 ℃退火/延伸1 min,共40個(gè)循環(huán);熔解曲線分析:95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s。GraphPad Prism 8軟件統(tǒng)計(jì)分析。將得到的Ct值按照2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量,GraphPad Prism 8軟件統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 差異表達(dá)基因篩選

以P<0.05,|log2FC|≥1為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因,共檢測(cè)到2 016個(gè)差異表達(dá)基因,其中1 363個(gè)基因表達(dá)上調(diào),653個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。

2.2 GO注釋分析

GO注釋分析顯示,差異表達(dá)基因共分為細(xì)胞組分(cellular component,CC)、生物學(xué)過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)三大類,圖1為前20個(gè)顯著富集的二級(jí)條目。在CC分類中占比較大的為細(xì)胞成分、細(xì)胞器、細(xì)胞膜;BP分類中占比較大的為細(xì)胞過程、生物調(diào)節(jié)和代謝過程;MF分類中結(jié)合、催化活性和分子功能調(diào)節(jié)劑數(shù)量較多。

2.3 KEGG富集分析

KEGG 信號(hào)通路富集分析顯示,癌癥通路、細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體之間的相互作用、MAPK信號(hào)通路是富集到差異表達(dá)基因最多的前3個(gè)信號(hào)通路(圖2)。與免疫相關(guān)的MAPK信號(hào)通路中,主要有促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶5(mitogen-activated protein kinase kinase kinase, MAP3K5)、TNF 受體關(guān)聯(lián)因子6(TNF receptor-associated factor 6, TRAF6)、雙調(diào)蛋白(amphiregulin, AREG)等,這些結(jié)果可以進(jìn)一步為細(xì)胞抗IBV的天然免疫應(yīng)答的研究提供理論基礎(chǔ)。

表1 差異表達(dá)基因RT-qPCR引物設(shè)計(jì)Table 1 Design of RT-qPCR primers for differentially expressed genes

圖1 差異表達(dá)基因GO注釋分析Fig.1 GO annotation analysis of differentially expressed genes

圖2 差異表達(dá)基因KEGG富集分析氣泡圖Fig.2 Bubble map of KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes

2.4 RT-qPCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果的可靠性,任意選取10個(gè)與天然免疫、抗病毒反應(yīng)有關(guān)的差異表達(dá)基因,以β-Actin為內(nèi)參基因,RT-qPCR檢測(cè)其相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果如圖3A所示,RT-qPCR的變化趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致,IL10、IFNG、IL8、IL1β、CCL20上調(diào);CXCR4、CLP1、ALDOB、TNFSF10、CCR4下調(diào)。

本次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中,模式識(shí)別受體基因MDA5、TLR3、TLR7轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照組相比并無顯著性差異(圖3B)。

A. 差異表達(dá)基因的RT-qPCR驗(yàn)證;B. 模式識(shí)別受體基因,ns. P>0.05A. Differentially expressed genes; B. Pattern recognition receptors genes, ns. P>0.05圖3 差異表達(dá)基因和模式識(shí)別受體基因的RT-qPCR驗(yàn)證Fig.3 Verification of differentially expressed genes and pattern recognition receptors genes by RT-qPCR

3 討 論

模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors, PRRs)是宿主先天免疫的重要組成部分,例如MDA5、TLR3、TLR7等,它們可以識(shí)別IBV復(fù)制產(chǎn)生的雙鏈RNA和單鏈RNA,然后通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生干擾素、促炎細(xì)胞因子,抑制IBV的復(fù)制[7-8]。本次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中,MDA5、TLR3、TLR7轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照組相比并無顯著性差異(圖3B),推測(cè)可能由于感染時(shí)間過短,IBV還未處于復(fù)制階段,PRRs沒有開始識(shí)別病毒。

通過對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG分析發(fā)現(xiàn),差異表達(dá)基因富集最顯著的信號(hào)通路是細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體之間的相互作用,其中包括CCR4、IL8、IL1β、CCL20等參與免疫反應(yīng)的基因,其中CXCR4在協(xié)調(diào)免疫反應(yīng)方面發(fā)揮突出作用,它可以調(diào)節(jié)白細(xì)胞的運(yùn)輸和分布,與CCR5共同促進(jìn)免疫突觸的形成和穩(wěn)定來支持T細(xì)胞啟動(dòng)[9-11]。TNF信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路也發(fā)生了顯著的變化,TNF是炎癥和免疫反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)和調(diào)節(jié)因子,它能夠與受體TNF-R1相互作用激活不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[12],富集到的TNF信號(hào)通路有34個(gè)差異表達(dá)基因,其中包括IRF1、TNFRSF1A、TRAF1、TRAF3等。MAPK能夠?qū)⒓?xì)胞表面的信號(hào)傳遞給細(xì)胞核內(nèi)部,MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作為一種高度保守的信號(hào)通路參與各種生物事件[13]。TRAF6是一種連接蛋白,它可以直接激活MAPK信號(hào)通路[14]。本研究中,TRAF6在IBV感染2 h后顯著上調(diào),提示它在參與細(xì)胞的免疫反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。

此次分析發(fā)現(xiàn),大多數(shù)差異表達(dá)基因與免疫調(diào)控有關(guān),表明細(xì)胞感染后通過調(diào)控免疫因子發(fā)揮抗病毒效應(yīng)。例如JAK-STAT調(diào)節(jié)代謝過程信號(hào)通路幾乎介導(dǎo)所有的免疫調(diào)節(jié)過程[15]。Toll樣信號(hào)通路能夠識(shí)別保守的微生物結(jié)構(gòu),哺乳動(dòng)物的Toll樣受體還誘導(dǎo)多種效應(yīng)分子,直接破壞微生物病原體[16-17]。

綜上所述,本研究采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析了IBV感染HD11細(xì)胞后參與免疫應(yīng)答、抗病毒的相關(guān)基因,這些差異表達(dá)基因可能與IBV的致病機(jī)制或細(xì)胞的抗病毒反應(yīng)有關(guān)。這將為研究IBV的防治提供一定的理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

IBV感染HD11細(xì)胞后,感染組篩選出1 363個(gè)上調(diào)基因,653個(gè)下調(diào)基因,進(jìn)一步GO和KEGG分析,發(fā)現(xiàn)IBV感染HD11細(xì)胞早期,差異表達(dá)基因大多與免疫反應(yīng)、抗病毒作用有關(guān),富集到的信號(hào)通路主要集中在細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體之間的相互作用、病毒蛋白與細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體之間的相互作用、TNF信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等。本研究有助于探究IBV致病機(jī)制和感染早期宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)。