蔡佳煒,張 琛,靳榮帥,鮑志遠(yuǎn),張希宇,王 璠,翟 頻,趙博昊,陳 陽, 湯先偉,吳信生*

(1.揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,揚(yáng)州 225009;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所,南京 210014; 3.江蘇省邳州市東方養(yǎng)殖有限公司,邳州 221300)

近年來,隨著氣候的變暖,高溫對畜牧業(yè)發(fā)展的影響已成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)[1]。適宜的溫濕度、優(yōu)良的飼養(yǎng)環(huán)境是家畜健康生長,高效生產(chǎn)的重要保障。熱應(yīng)激(heat stress,HS)指動物機(jī)體對生長環(huán)境溫度升高產(chǎn)生的一系列非特異性防御應(yīng)答的總和[2]。全球氣候變暖,機(jī)體暴露在極高溫度下會導(dǎo)致熱應(yīng)激的發(fā)生[3]。熱應(yīng)激會導(dǎo)致公畜精子數(shù)量、密度、畸形率等的改變,造成公畜繁殖性能的下降,甚至?xí)霈F(xiàn)不育的現(xiàn)象[4]。熱應(yīng)激對豬生長發(fā)育危害嚴(yán)重,導(dǎo)致種公豬睪丸退化、交配欲減退,甚至喪失生育能力[5-7],母豬初情期延遲,發(fā)情期變短,無法正常排卵,受胎率下降[8]。熱應(yīng)激狀態(tài)下,奶牛免疫機(jī)能下降,身體能量處于負(fù)平衡狀態(tài),采食量下降、產(chǎn)奶量和乳制品產(chǎn)量均會下降[9-11]。熱應(yīng)激嚴(yán)重影響了家畜的健康、生長和繁殖性能。

家兔是恒溫動物,功能性汗腺較少,在高溫下,呼吸頻率增加、采食量下降、體內(nèi)代謝紊亂,導(dǎo)致生產(chǎn)性能下降[12]。高溫條件下暴露3 h,公兔體內(nèi)活性氧(ROS)、熱休克蛋白(HSP)生成異常,睪丸微環(huán)境發(fā)生改變,染色質(zhì)構(gòu)像和DNA甲基化改變,阻礙了精子的生成,精子功能遭到破壞[13]。環(huán)境溫度高于18 ℃,公兔不育發(fā)生率會顯著增加[14]。研究發(fā)現(xiàn),公兔精子在38～40 ℃下孵育3 h,受精率從98%下降至96%,胚胎存活率更是從59%下降到了34%[15]。熱應(yīng)激還會通過線粒體途徑導(dǎo)致DNA損傷,導(dǎo)致DNA修復(fù)相關(guān)基因表達(dá)降低[16-18]。動物發(fā)生熱應(yīng)激時,體內(nèi)線粒體凋亡、生殖細(xì)胞死亡-受體凋亡、AMPK等通路均會受到影響,進(jìn)而影響精子的生成和發(fā)育[19-21]。

為了進(jìn)一步了解家兔熱應(yīng)激發(fā)生的分子機(jī)制,本研究分析了種公兔在熱應(yīng)激和未熱應(yīng)激條件下的睪丸組織形態(tài)差異,并采用RNA-Seq技術(shù)篩選了不同狀態(tài)下精子的差異表達(dá)基因,以探究熱應(yīng)激對種公兔精子發(fā)生的影響,為種公兔耐熱性狀的選育提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

課題組前期選取具有相同飼養(yǎng)水平,體況和體重相近的20只新西蘭白兔種公兔作為試驗(yàn)對象。通過計(jì)算溫濕度指數(shù)(THI),記錄了5月和8月溫濕度,將5月份定義為未熱應(yīng)激組(non-heat stressed, NHS),8月份定義為熱應(yīng)激組(heat stressed, HS)[22]。采精時間為2021年5月1～20日和8月1～20日。每組隨機(jī)選取3只種公兔,將采集的精液用于轉(zhuǎn)錄組分析。此外,用丙泊酚加塞拉嗪麻醉后,剖開腹腔取出睪丸,用于后期組織切片的制作。

1.2 睪丸組織切片的制作及HE染色

種公兔睪丸組織在PBS中清洗3次,加入4%多聚甲醛溶液固定24 h,濾紙吸凈多聚甲醛溶液,將組織依次放入由低到高濃度的酒精中脫水,然后通過二甲苯透明和石蠟包埋,將組織塊固定在切片機(jī)上,切取5～7 μm的組織,溫水展片,載玻片撈取,60 ℃烘箱烘干備用。

采用二甲苯去除睪丸切片中殘存的石蠟,再將制作好的睪丸切片依次放入由高到低濃度的酒精中,輕輕甩掉切片上多余的水分,蘇木素中浸染5 min,再用水漂洗數(shù)秒,1%鹽酸乙醇處理組織切片10 s,蒸餾水下沖洗后,用0.6%氨水使組織切片返藍(lán),再用伊紅染色液染色2 min,染色后切片經(jīng)過無水乙醇脫水、二甲苯透明等過程,滴上樹膠、蓋上蓋玻片封片,用顯微鏡觀察卵巢形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.3 轉(zhuǎn)錄組(RNA-Seq)測序分析

使用總RNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取6只新西蘭種公兔精子總RNA。總RNA經(jīng)純化后檢測其完整性和濃度。檢測合格后,合成cDNA并構(gòu)建文庫。基于Illumina HiSeq 測序平臺,對文庫進(jìn)行測序,回收測序數(shù)據(jù)。對原始下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾,將得到的Reads比對到參考基因組上,使用FPKM標(biāo)準(zhǔn)化對熱應(yīng)激組和未熱應(yīng)激組樣本進(jìn)行基因表達(dá)量分析。建庫及測序委托上海派森諾生物科技股份有限公司完成。

1.4 差異表達(dá)基因的分析和篩選

根據(jù)基因表達(dá)量對各樣品進(jìn)行主成分分析(PCA),采用DESeq(http://wwwbioconductororg/packagcs/rclcascbioc/html/DEScq.html)對基因表達(dá)進(jìn)行差異分析,篩選出符合表達(dá)差異倍數(shù)|log2FoldChange|>1,P-value<0.05的差異表達(dá)基因。使用R語言Pheatmap軟件包對所有比較組差異基因的并集和樣品進(jìn)行雙向聚類分析,并對篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能以及KEGG富集通路分析。

1.5 實(shí)時熒光定量驗(yàn)證

利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物,由擎科生物科技公司合成。使用ChamQTM SYBR qPCR Mster Mix(諾唯贊生物科技(南京)有限公司)試劑盒進(jìn)行熒光定量驗(yàn)證。引物序列見表1。反應(yīng)體系共20 μL:2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL,上、下游引物各0.4 μL,50×ROX Reference Dye 2 0.4 μL,cDNA 1 μL、ddH2O 7.8 μL。PCR擴(kuò)增程序:預(yù)變性階段為95 ℃ 30 s;循環(huán)反應(yīng)為95 ℃ 10 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s(40個循環(huán));熔解曲線為95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s。

表1 實(shí)時熒光定量PCR引物序列Table 1 Real-time PCR primer sequences

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0軟件比較不同樣品間的均值與標(biāo)準(zhǔn)誤,試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用2-△△Ct法對數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析,利用t檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)的顯著性,并利用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行繪圖,以*P<0.05表示差異顯著,**P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 熱應(yīng)激下睪丸組織切片分析

種公兔睪丸組織切片HE染色表明,NHS組的睪丸曲細(xì)精管基膜清晰,生精上皮細(xì)胞排列緊密、整齊有序,各種排列相均清晰可辨,精原細(xì)胞、精母細(xì)胞和精子細(xì)胞在小管中排列緊密(圖1A)。而HS組的睪丸生精上皮較薄,受損情況顯著,中央出現(xiàn)明顯的空泡化和撕裂,精子細(xì)胞數(shù)量減少,生殖細(xì)胞和基底膜之間存在分離,間質(zhì)空間增加(圖1B)。

A. 未熱應(yīng)激組;B. 熱應(yīng)激組A. Non-heat stress group; B. Heat stress group圖1 睪丸切片圖Fig.1 Testicular section

2.2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

采用Cutadapt去除3′端帶接頭的序列以及去除平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于Q20的序列,可以發(fā)現(xiàn)Q20、Q30及純凈序列的占比都在85%以上(表2),表明測序質(zhì)量好,完整性較高。此外,將過濾得到的純凈序列與兔參考基因組進(jìn)行比對分析(表3),對比率均高于70%,表明得到的純凈序列對比率和可信度較高。同時,對樣品間進(jìn)行PCA主成分分析,結(jié)果見圖2,PC1(84%),表明在受到熱應(yīng)激刺激后兩組之間基因表達(dá)發(fā)生了明顯的變化,可進(jìn)行后續(xù)差異基因的分析。

表2 測序數(shù)據(jù)過濾Table 2 Results of sequencing data filtering

表3 測序數(shù)據(jù)對比分析Table 3 Comparison and analysis of sequencing data

圖2 PCA主成分分析結(jié)果圖Fig.2 PCA principal component analysis result

2.3 差異表達(dá)基因分析

采用DESeq對基因表達(dá)進(jìn)行差異分析,共檢測到差異表達(dá)基因1 676個,其中上調(diào)基因894個,下調(diào)基因782個,包括ATP5MC1、MDH2、ALDH7A1、GAPDHS、PRPS1基因等。對篩選出的差異基因進(jìn)行聚類分析,結(jié)果顯示兩組間的差異基因聚類效果較好(圖3)。

A.差異表達(dá)基因火山圖;B.差異表達(dá)基因聚類分析A. Volcano plot of differentially expressed genes; B. Clustering analysis of differentially expressed genes圖3 差異表達(dá)基因分析圖Fig.3 Analysis of differentially expressed genes

2.4 差異表達(dá)基因的GO富集分析

按照生物學(xué)過程(biological process)、分子功能(molecular function)和細(xì)胞組分(cellular component)對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析,挑選每個GO分類中富集最顯著的前10個GO 條目進(jìn)行分析。差異上調(diào)基因主要富集在應(yīng)激反應(yīng)(response to stress)、細(xì)胞因子(response to cytokine)、蛋白質(zhì)代謝過程(protein metabolic process)、有機(jī)物質(zhì)運(yùn)輸(organic substance transport)等功能;差異下調(diào)基因主要富集在代謝過程(metabolic process)、免疫反應(yīng)(immune response)、催化活性(catalytic activity)等功能(圖4)。

A.差異基因表達(dá)GO分類圖;B.差異基因表達(dá)GO富集氣泡圖A. GO classification map of differential gene expression; B. GO enrichment bubble diagram of differential gene expression圖4 差異基因表達(dá)的GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of differential gene expression

2.5 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

在動物體內(nèi),基因間通過協(xié)同作用發(fā)揮各自的功能,對基因進(jìn)行通路分析有助于確定相關(guān)基因行使的生物學(xué)功能。對差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析,共涉及316條通路,其中,與熱應(yīng)激相關(guān)的主要有MAPK(MAPK signaling pathway)、PI3K-Akt(PI3K-Akt signaling pathway)、Toll樣受體(Toll-like receptor signaling pathway)、Ras(Ras signaling pathway)等信號通路(圖5)。

2.6 差異表達(dá)基因的RT-PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證RNA-Seq測序結(jié)果的可靠性,隨機(jī)選取5個差異表達(dá)基因(ATP5MC1、MDH2、PRPS1、ALDH7A1和GAPDHS)進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ATP5MC1、MDH2、ALDH7A1和GAPDHS基因在NHS種公兔精液中相對表達(dá)量高于HS種公兔(P<0.01),而PRPS1基因在NHS種公兔精液中相對表達(dá)量低于HS種公兔(P<0.01)(圖6)。RT-PCR結(jié)果與RNA-Seq測序結(jié)果趨勢一致,證明本次測序結(jié)果可靠。

A.差異基因表達(dá)KEGG分類圖;B.差異基因表達(dá)KEGG富集氣泡圖A. KEGG classification map of differentially expressed genes; B. Bubble diagram of KEGG enrichment of differential gene expression圖5 差異基因表達(dá)的KEGG通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis of differential gene expression

A.差異基因測序時的表達(dá)量;B.差異基因RT-PCR驗(yàn)證分析。**表示差異極顯著(P<0.01)A.Expression of differential gene sequencing; B. RT-PCR verification analysis of differential genes.** represents P<0.01, with significant difference圖6 差異基因的表達(dá)圖Fig.6 Expression map of differential genes

3 討 論

家兔汗腺不發(fā)達(dá),大多通過呼吸和耳垂來進(jìn)行散熱。熱應(yīng)激會引起動物機(jī)體多種生理反應(yīng),對動物福利產(chǎn)生負(fù)面影響,并顯著降低繁殖性能[23-25]。在熱應(yīng)激下,動物機(jī)體抗氧化能力下降,活性氧(ROS)增加,發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),精子的DNA和運(yùn)動能力均會受到影響,最終導(dǎo)致精液品質(zhì)的下降[26-28]。熱應(yīng)激對睪丸功能有負(fù)面影響,能抑制睪丸激素的分泌,導(dǎo)致精子質(zhì)量和生育能力的下降[29]。家兔的最佳環(huán)境溫度范圍為15～25 ℃,最佳濕度為55%～65%,當(dāng)環(huán)境溫度高于35 ℃時,家兔不能調(diào)節(jié)體溫,易產(chǎn)生熱應(yīng)激[30]。種公兔比母兔對高溫更加敏感,高溫抑制了下丘腦促性腺激素釋放激素(GnRH)的合成和分泌,顯著影響睪丸的功能并導(dǎo)致精液品質(zhì)的下降[31]。種公兔的繁殖效率在生產(chǎn)中極為重要[32],因此具有高品質(zhì)的精液是實(shí)現(xiàn)高生育能力和提高經(jīng)濟(jì)效益所必需的。

本試驗(yàn)采集了HS組和NHS組新西蘭種公兔睪丸和精液,通過HE染色,比較不同條件下睪丸組織結(jié)構(gòu)的差異,并利用RNA-Seq技術(shù)分析了精子的轉(zhuǎn)錄組,通過分析比較共發(fā)現(xiàn)1 676個差異基因,其中差異上調(diào)基因894個,差異下調(diào)基因782個。進(jìn)一步對差異基因進(jìn)行篩選、功能注釋和富集分析發(fā)現(xiàn),GO富集分析在代謝過程中的差異基因有843個,其中包括ATP5MC1、MDH2、PRPS1、ALDH7A1和GAPDHS等。ALDH7A1蛋白也稱遺蛋白,RNA-Seq分析方法鑒定經(jīng)過急性熱應(yīng)激處理的黃羽肉雞肝臟中的差異表達(dá)基因,發(fā)現(xiàn)ALDH7A1基因參與丙酮酸代謝,并且在賴氨酸的分解代謝中也發(fā)揮了重要作用[33],賴氨酸是一種必需氨基酸,其代謝對維持細(xì)胞氮庫和酮體的形成具有重要意義[34]。據(jù)研究表明,ALDH7A1可通過甜菜堿醛生成滲透物甜菜堿來防止哺乳動物受到高滲應(yīng)激方面的影響[35]。在哺乳動物中,GAPDHS是一種精子特異性糖酵解酶,是精子中唯一的GAPDH同工酶,可調(diào)節(jié)精子的運(yùn)動,是精子活力和男性生育能力所必需的。研究表明,缺乏GAPDHS的小鼠無法生育,產(chǎn)生的精子ATP水平非常低且缺乏運(yùn)動能力[36-38]。MDH2是一種檸檬酸循環(huán)酶,可催化蘋果酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸,并通過將草酰乙酸還原成蘋果酸和蘋果酸共同穿過線粒體內(nèi)膜參加糖異生過程。MDH2位于精子線粒體內(nèi),為精子尾部運(yùn)動提供所需的能量[39-41],MDH2的異常表達(dá)會破壞精子內(nèi)部能量平衡,影響精子的活力、獲能過程以及降低生育能力[42]。研究發(fā)現(xiàn),MDH2的敲除顯著降低了細(xì)胞的ATP水平,同時提高了ADP/ATP和NAD/NADH的水平以及細(xì)胞內(nèi)ROS的濃度[43]。從GO富集分析看來,ALDH7A1、GAPDHS、MDH2等基因可能與熱應(yīng)激狀態(tài)下公兔精液品質(zhì)下降有關(guān)。

此外,通過對差異表達(dá)基因的KEGG富集分析發(fā)現(xiàn),與熱應(yīng)激相關(guān)的主要有MAPK、PI3K-Akt、Toll樣受體、Ras等信號通路。在熱應(yīng)激中,MAPK通路被激活,可防止HS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[44],MAPK通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生存、增殖和分化等過程,這在保護(hù)細(xì)胞免受熱損傷中起著關(guān)鍵作用。PI3K-Akt通路是參與細(xì)胞生長、存活和代謝的重要通路之一,陳威[45]發(fā)現(xiàn),抑制睪丸中PI3K/Akt/FoxO1信號通路,凋亡因子Caspase-3被激活,進(jìn)而導(dǎo)致睪丸組織細(xì)胞凋亡。睪丸支持細(xì)胞(SCs)是促使睪丸產(chǎn)生正常精子的重要細(xì)胞之一,PI3K/Akt信號通路可以通過調(diào)節(jié)激素水平來調(diào)控精子發(fā)生[46]。因此,推測熱應(yīng)激與MAPK、PI3K-Akt等信號通路密切相關(guān),影響種公兔精子的發(fā)生。

綜上,HS的機(jī)制可能涉及ATP5MC1、MDH2、PRPS1、ALDH7A1和GAPDHS等多個基因,也可能通過MAPK、PI3K-Akt這些信號通路來調(diào)控細(xì)胞的生長、增殖和凋亡。通過了解熱應(yīng)激反應(yīng)的分子機(jī)制,確定新的靶點(diǎn),可以有效地預(yù)防熱應(yīng)激帶來的疾病和危害。

4 結(jié) 論

本研究對新西蘭種公兔精子熱應(yīng)激組和未熱應(yīng)激組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,檢測差異表達(dá)基因及相關(guān)信號通路,共篩選出1 676個差異表達(dá)基因(上調(diào)基因894個,下調(diào)基因782個),發(fā)現(xiàn)SIRT1、PHGDH、MDH2、ATP5MC1、PRPS1、ALDH7A1等5個可能與熱應(yīng)激狀態(tài)下公兔精液品質(zhì)下降有關(guān)的潛在基因,本研究結(jié)果為高溫環(huán)境下家兔的選育提供理論基礎(chǔ),對養(yǎng)兔業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展具有重要意義。