陳健，李利義，諸葛林敏，馬香愛，朱岳升，俞耀軍

溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院，浙江 溫州 325027，1.胃腸外科；2.手術(shù)室；3.消化內(nèi)科

胃癌是惡性腫瘤死亡的第四大原因，盡管目前臨床上進行的化療、放療、手術(shù)治療以及一些分子靶向治療能夠顯著延長胃癌患者的生存期，但其5年生存率依然很低[1]，因此，進一步研究胃癌發(fā)生的分子機制，尋找胃癌患者新的治療靶點并采取針對性的治療策略具有重要的意義[2]。復制蛋白A1 （replication protein A1, RPA1）是三聚體復制蛋白A的最大亞基，在真核細胞DNA復制、同源重組和切除修復中起核心作用，其在食管癌、結(jié)腸癌、尿路上皮癌等多種癌癥中均被擴增[3-5]。有研究發(fā)現(xiàn)，RPA1在胃癌中呈現(xiàn)高表達，與患者的臨床特征、預后之間存在相關(guān)性[6]，但是，具體機制尚不清楚。微小RNA（microRNA, miRNA）是一類小分子非編碼單鏈RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶mRNA的翻譯或降解mRNA， 參與調(diào)控細胞的增殖、分化和凋亡等。研究顯示，miR-30a在胃癌和卵巢癌細胞中通過靶向調(diào)控RPA1基因的表達進而抑制細胞增殖[7]，但miRNA與RPA1在胃癌中的相互作用尚不明確，因此，本研究在胃癌細胞中通過RNA pulldown技術(shù)探究了RPA1結(jié)合的miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-145在胃癌細胞中靶向結(jié)合并調(diào)控RPA1基因的表達，進而抑制胃癌細胞的增殖。

1 材料和方法

1.1 細胞和主要試劑 胃癌SGC-7901細胞（中科院細胞庫），F(xiàn)BS、RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司），胰蛋白酶、脂質(zhì)體2000、TRIzol試劑（美國 Invitrogen公司），miRNA分離試劑盒（美國Ambion公司），All-in-One miRNA qRT-PCR檢測試劑盒（美國Gene Copoeia公司），has-miR-145模擬物、miRNA對照物（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司），生物素標記的RNA pulldown探針（生工生物工程（上海）股份有限公司），RNA pulldown試劑盒（上海澤恒生物科技有限公司），RPA1抗體（美國Abcam公司），辣根過氧化物酶標記兔抗鼠二抗（美國CST公司），雙熒光素酶活性檢測試劑盒（美國Promega公司），包含RPA1基因3’-非翻譯區(qū)（3’UTR）熒光素酶報告載體由上海吉凱基因公司包裝合成。

1.2 RNA pulldown回收實驗 使用RNA pulldown試劑盒進行RNA回收實驗，參照文獻[8]并做稍加修改。使用的探針列于表1。將對數(shù)生長期的SGC-7901細胞接種于培養(yǎng)皿中，待細胞生長密度達80%時分為兩組，即RPA1探針回收組和對照探針回收組。首先用甲醛對細胞進行交聯(lián)，加甘氨酸緩沖液進行平衡，加裂解液收集細胞。細胞樣品經(jīng)超聲處理后離心。上清液移入2 mL離心管中。細胞裂解液用生物素標記的RPA1探針或?qū)φ仗结樞D(zhuǎn)孵育3 h。然后再加入鏈霉親和素磁珠旋轉(zhuǎn)孵育1 h。清洗磁珠3次。隨后進行解交聯(lián)處理，然后加TRIzol純化RNA。使用All-in-One miRNA qRT-PCR檢測試劑盒，檢測純化的miRNA。

表1 RNA pulldown探針

1.3 細胞增殖能力檢測 SGC-7901細胞增殖活性檢測采用MTT法。細胞在含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、50 mL/L CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。共分為3組：空白對照組（PBS組）、對照miRNA組（轉(zhuǎn)染miRNA對照模擬物）和miR-145組（轉(zhuǎn)染has-miR-145模擬物）。取各組轉(zhuǎn)染后的細胞，以2.5×104/mL的濃度，每孔200 μL接種于96孔板中，每組設3個復孔。分別培養(yǎng)24、48、72 h后，加入5 g/L的MTT溶液 20 μL。繼續(xù)孵育4 h后，棄去上清液。然后每孔加入150 μL的二甲基亞砜，充分振蕩溶解結(jié)晶紫，混勻后用酶標儀于490 nm處測定OD值。實驗重復3次。

1.4 細胞周期檢測 按上述1.3分組和準備細胞，用胰蛋白酶消化各組細胞，吹打使其充分變勻，制備成單細胞懸液離心，收集到流式專用管中，離心并去上清液，PBS液進行重懸，移入離心管內(nèi)，加入無水乙醇，在-20 ℃溫度固定24 h以上；細胞固定好以后，離心，去掉上清液，使用PBS洗滌沉淀若干次，用l mg/mL的RNase A溶液消化細胞內(nèi)的RNA；用PI溶液避光環(huán)境下染核10 min；最后用流式細胞儀分析3組細胞細胞周期百分比。

1.5 Western blot法檢測RPA1蛋白的表達 按上述1.3分組和準備細胞，收集各組細胞，PBS沖洗后，加入裂解液冰上裂解30 min，超聲破碎細胞，低溫離心后取上清液加樣，經(jīng)電泳蛋白分離和轉(zhuǎn)膜，50 g/L 脫脂奶粉封閉30 min。用RPA1（1:1 000稀釋）一抗孵育，4 ℃過夜，TBST洗膜3次，每次5 min。加兔抗鼠二抗常溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min。 凝膠成像系統(tǒng)顯色曝光，Quantity One進行灰度測量分析。

1.6 雙熒光素酶報告基因檢測 PCR擴增RPA1基因3’UTR，構(gòu)建包含RPA1 3’UTR的質(zhì)粒（pMIR-RPA1）和不包含RPA1 3’UTR的對照質(zhì)粒（pMIR）。調(diào)整胃癌SGC-7901細胞濃度為2.5×105個/mL，每孔2 mL接種于6孔板中。待細胞融合至60%時，分別共轉(zhuǎn)染pMIRRPA1與miR-145模擬物或miRNA對照模擬物、pMIR與miR-145模擬物或miRNA對照模擬物。轉(zhuǎn)染12 h 后，更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細胞。參照試劑盒說明書，檢測熒光素酶活性。

1.7 生物信息學分析 收集TCGA數(shù)據(jù)庫375例胃癌組織及32例正常胃黏膜組織的RNA測序數(shù)據(jù)，比較兩種組織中RPA1基因表達量[log2（TPM+1）]的差別。生存分析由在線分析工具Kaplan-Meier plotter （http://kmplot.com/analysis/）完成。

1.8 統(tǒng)計學處理方法 采用GraphPad Prism 6統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 RPA1基因在胃癌組織中顯著高表達 生物信息學分析結(jié)果顯示，相比較于正常胃黏膜組織（n= 32），腫瘤組織（n=375）中RPA1基因的表達量顯著升高（P＜0.05），見圖1。

2.2 RPA1基因在胃癌組織中高表達與患者較差的預后相關(guān) 根據(jù)胃癌組織中RPA1基因表達量的高低對TCGA數(shù)據(jù)庫中的胃癌患者進行了分組，并比較了其生存情況，結(jié)果顯示，RPA1基因高表達組（n=459）的預后顯著差于低表達組（n=172），HR=1.72（1.32～2.25，P＜0.01）。見圖2。

圖2 RPA1基因表達與胃癌患者預后的相關(guān)性

2.3 miR-145靶向結(jié)合RPA1基因3’UTR區(qū) 為了明確胃癌細胞中結(jié)合RPA1基因的miRNA，本研究設計了靶向RPA1基因3’UTR區(qū)的探針，進行了RNA pulldown 回收，并對回收到的miRNA進行了qRT-PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-145在胃癌細胞中和RPA1基因3’UTR區(qū)結(jié)合最高（見圖3）。

圖3 采用RNA pulldown法在胃癌細胞中回收并分析靶向結(jié)合RPA1基因3’UTR區(qū)的miRNA

2.4 miR-145在胃癌細胞中抑制RPA1基因的表達 為了驗證miR-145在胃癌細胞中是否能調(diào)控RPA1基因的表達，本研究進行了熒光素酶報告基因檢測和Western blot檢測。熒光素酶相對活性分析結(jié)果顯示，miR-145組相比于對照miRNA組顯著降低（P＜0.05，見圖4A、圖4B）。Western blot檢測結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染對照miRNA組比較，miR-145組RPA1表達顯著下降（P＜0.05，見圖4C、圖4D）。

圖4 胃癌細胞中檢測miR-145對RPA1基因的靶向和調(diào)控作用

2.5 miR-145抑制胃癌細胞增殖 MTT實驗結(jié)果表明，胃癌細胞轉(zhuǎn)入miR-145后72 h，細胞增殖顯著降低（P＜0.05），見圖5。

圖5 MTT檢測miR-145對胃癌細胞增殖的影響

2.6 miR-145阻滯胃癌細胞周期 流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，胃癌細胞轉(zhuǎn)染miR-145后，細胞阻滯在G2/M期（P＜0.05），見圖6。

圖6 流式細胞術(shù)檢測miR-145對胃癌細胞細胞周期的影響

3 討論

胃癌是消化道常見惡性腫瘤，全球每年約有85萬新增胃癌病例，65 萬例死亡病例[9]。盡管進行了大量的臨床和基礎(chǔ)研究，但人們對它仍然知之甚少。致癌基因蛋白表達、幽門螺桿菌感染、飲食因素、吸煙、飲酒、肥胖等因素均與胃癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[10-11]。盡管在早期發(fā)現(xiàn)、治療和預防方面取得了進步，但晚期胃癌仍然是不可治愈的，其5年生存率僅為4%～5%[12]。

無限制的癌細胞增殖是腫瘤發(fā)生的原因[13]。為了找到治療癌癥的方法，人們已經(jīng)在努力尋找抑制惡性細胞增殖的方法。有絲分裂是真核細胞增殖的主要途徑，在這個過程中，DNA被復制，然后將細胞的遺傳物質(zhì)傳遞到下一代細胞中。任何DNA復制的缺陷或DNA損傷都會觸發(fā)一個檢查點，延遲細胞周期的進程，并促進DNA修復。如果錯誤無法恢復，細胞將啟動死亡程序以消除危害[14]。RPA1基因在DNA復制中起關(guān)鍵作用。它幫助解開雙鏈DNA，招募聚合酶將核苷三磷酸結(jié)合到新合成的DNA鏈中，并保持基因組的完整性[15-16]。RPA1缺陷會引起自發(fā)的DNA損傷，誘導DNA復制檢查點，從而抑制有絲分裂或啟動細胞死亡[15，17]。研究發(fā)現(xiàn)RPA1基因與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。RPA1可以通過CDK4/Cyclin-D 通路促進肝細胞癌增殖[19]。沉默RPA1可增強結(jié)直腸惡性腫瘤細胞對5-Fu的敏感性[19]。RPA1表達的下調(diào)可通過阻斷RAD51的DNA損傷位點增強鼻咽癌的放療敏感性[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常胃黏膜比較，胃癌組織中RPA1基因的表達顯著上調(diào)，且RPA1的高表達與患者較低的累積生存率相關(guān)，提示RPA1在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用，因此，RPA1可能可以成為胃癌治療的潛在靶點。已有研究表明RPA1可通過各種轉(zhuǎn)錄后修飾如泛素化、巴豆?；{(diào)節(jié)其功能[21-22]。然而，目前對于RPA1的表達調(diào)控的研究卻鮮有報道。研究顯示，miR-30a在胃癌和卵巢癌細胞中通過靶向調(diào)控RPA1基因的表達進而抑制細胞增殖[7]，但是否還有其他miRNA在胃癌細胞中參與RPA1基因的表達調(diào)控還不清楚。

miRNA是一種長度約為22 nt的單鏈小RNA，進化高度保守，可參與細胞生長、分化、凋亡和血管生成等多種重要的生物學過程。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 可以通過與靶mRNA的3’-UTR結(jié)合而影響靶基因mRNA的轉(zhuǎn)錄后翻譯[23]。本研究采用RNA pulldown技術(shù)全面分析了靶向RPA1基因3’-UTR的miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多種miRNA包括miR-30a結(jié)合RPA1基因3’-UTR區(qū)域，但miR-30a并不是結(jié)合最多的miRNA，miR-145在RPA1基因3’-UTR區(qū)結(jié)合最高。

miR-145是一種抑癌miRNA，可通過對多種靶基因的調(diào)控抑制腸癌、食管癌等腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展調(diào)控[24-25]。XU等[26]發(fā)現(xiàn)miR-145通過靶向（mTOR）/p70S6K1信號通路抑制結(jié)腸癌患者腫瘤細胞生長和血管生成。WANG等[27]發(fā)現(xiàn)miR-145通過靶向AEG-I/MTDH信號通路抑制非小細胞肺癌患者腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移。也有研究發(fā)現(xiàn)，miR-145在胃癌腫瘤組織內(nèi)的表達明顯下調(diào)[22]，miR-145通過靶向IRS-I/β-actin信號通路抑制胃癌細胞的增殖[28]，通過靶向Six1 基因抑制胃癌細胞侵襲、血管形成及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[29]。本研究結(jié)果顯示，在胃癌細胞中miR-145可以抑制RPA1基因的表達，且將miR-145轉(zhuǎn)入胃癌細胞會通過抑制RPA1基因的表達抑制細胞的增殖，miR-145對胃癌細胞增殖的抑制是通過阻滯細胞周期獲得的。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-145可以通過靶向下調(diào)RPA1的表達而阻滯胃癌細胞周期并抑制細胞增殖，這可能為胃癌的治療提供一個新靶點。但是，本研究僅用了SGC-7901細胞，未來尚需在不同的胃癌細胞系進行實驗驗證，并進一步探討miR-145在RPA1基因3’UTR區(qū)的具體結(jié)合位點。