董 月,于 蘭#,李曉露,曹鵬然,林 旸,趙建強(qiáng)

(1.華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司 微生物藥物國家工程研究中心河北省工業(yè)微生物代謝技術(shù)創(chuàng)新中心,河北 石家莊 052165;2.華北制藥華勝有限公司,河北 石家莊 052160)

那他霉素(Natamycin),又稱匹馬霉素(Pimamycin),是一種首次從鏈霉菌中提取得到的四烯類抗生素。那他霉素最早被用作食品添加劑,用于抑制食品中酵母、霉菌的生長。體外活性研究顯示,那他霉素具有抗多種絲狀真菌和酵母的活性,與利福平或慶大霉素聯(lián)用對鐮刀菌具有協(xié)同抑制作用[1-4]。那他霉素的抗真菌活性與劑量具有一定相關(guān)性,殺菌機(jī)制為:其與真菌細(xì)胞膜上的固醇相結(jié)合轉(zhuǎn)化為多烯固醇復(fù)合物,通過改變細(xì)胞膜內(nèi)外滲透壓使細(xì)胞內(nèi)容物外溢,造成真菌細(xì)胞死亡[5]。1978年,那他霉素眼用制劑在美國批準(zhǔn)上市,用于治療真菌性角膜炎,療效顯著[6-8]。目前,那他霉素已被廣泛應(yīng)用于抗真菌治療、食品綠色防腐及農(nóng)業(yè)真菌性病害治理等領(lǐng)域,具有巨大的社會價值。

那他霉素經(jīng)微生物發(fā)酵、提煉和精制制得,為白色或淡黃色結(jié)晶粉末。那他霉素原料藥在存放過程中雜質(zhì)含量不斷增加,且該雜質(zhì)對光敏感。隨著藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的不斷提高,藥品雜質(zhì)特別是潛在雜質(zhì)控制越來越受到重視。鑒于此,作者將那他霉素精品進(jìn)行光降解,得到那他霉素光降解雜質(zhì)粗品,采用制備液相色譜法對那他霉素光降解雜質(zhì)粗品進(jìn)行分離純化,并通過MS和NMR等分析手段對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定,為那他霉素的質(zhì)量控制及安全儲運提供技術(shù)參考。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

那他霉素精品(批號YFNT220301,純度99.1%),華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司;乙腈、甲醇、氘代二甲基亞砜(DMSO-d6),色譜純,美國Merck公司;乙腈、甲醇,制備級,安徽時聯(lián)特種溶劑股份有限公司;其它試劑均為分析純。

分析液相色譜系統(tǒng),Agilent公司;制備液相色譜系統(tǒng),北京澳諾科技有限公司;光照試驗儀,Star iTech公司;TDL-40B型臺式離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,Heidolph公司;分析天平,Mettler-Toledo公司;質(zhì)譜儀(Acquity UPLC系統(tǒng),PDA檢測器),Waters公司;AVANCE Ⅲ 500型核磁共振波譜儀,Bruker公司。

1.2 方法

1.2.1 那他霉素精品的光降解

取10 g那他霉素精品于表面皿中攤成薄層,置于光照試驗儀中進(jìn)行光降解實驗,調(diào)整光照強(qiáng)度為5 000 Lx,每隔一定時間取樣檢測,當(dāng)目標(biāo)雜質(zhì)比例達(dá)到一定要求后,停止光照,得到那他霉素光降解雜質(zhì)粗品。

1.2.2 那他霉素光降解雜質(zhì)粗品的分離純化

將那他霉素光降解雜質(zhì)粗品用甲醇溶解,參照《中華人民共和國藥典2020年版 二部》[9]中那他霉素有關(guān)物質(zhì)檢測條件進(jìn)行HPLC在線分析,收集目標(biāo)雜質(zhì)純度大于95%的洗脫液,濃縮至干,得到那他霉素光降解雜質(zhì)純品。

1.2.3 檢測條件

制備色譜條件:Kromasil 100-10-C18制備色譜柱(21.2 mm×250 mm),洗脫劑為乙腈-2%乙酸銨緩沖液(30∶70,體積比,下同),檢測波長為303 nm。

質(zhì)譜條件:樣品用甲醇溶解,電噴霧電離源(ESI),正離子檢測。

核磁共振波譜條件:樣品用DMSO-d6溶解。

2 結(jié)果與討論

2.1 光照時間對那他霉素光降解的影響

按1.2.1方法在光照強(qiáng)度5 000 Lx下進(jìn)行光降解實驗,分別在5 d、10 d、15 d、20 d、25 d、30 d取樣檢測,那他霉素目標(biāo)雜質(zhì)比例分別為0、0.11%、0.24%、1.13%、1.80%、2.37%。結(jié)果表明,在強(qiáng)光照射下,那他霉素易降解生成目標(biāo)雜質(zhì),且隨著光照時間的延長目標(biāo)雜質(zhì)比例逐漸增大,同時有其它雜質(zhì)生成。

2.2 純化條件優(yōu)化

洗脫劑對那他霉素光降解雜質(zhì)粗品純化效果的影響見表1。

表1 洗脫劑對那他霉素光降解雜質(zhì)粗品純化效果的影響

由表1可知,以乙腈-1%醋酸水溶液(40∶60)為洗脫劑時,目標(biāo)雜質(zhì)與那他霉素不能有效分離;以乙腈-1%醋酸水溶液(30∶70)為洗脫劑時,分離效果略好,但出峰時間較長,且峰型較寬、拖尾嚴(yán)重;以乙腈-1%乙酸銨緩沖液(30∶70)為洗脫劑時,峰型較好,但不能實現(xiàn)良好分離;以乙腈-2%乙酸銨緩沖液(30∶70)為洗脫劑時,分離效果明顯改善,目標(biāo)雜質(zhì)HPLC純度達(dá)到95%以上。因此,選擇乙腈-2%乙酸銨緩沖液(30∶70)作為洗脫劑進(jìn)行分離純化,得到那他霉素光降解雜質(zhì)純品16 mg。

那他霉素光降解雜質(zhì)粗品和純品的HPLC圖譜見圖1。

2.3 雜質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定

2.3.1 MS分析(圖2)

圖2 那他霉素光降解雜質(zhì)的MS圖譜Fig.2 MS spectrum of photodegradation impurity of Natamycin

2.3.2 NMR分析

那他霉素光降解雜質(zhì)的13CNMR和1HNMR數(shù)據(jù)見表2。

表2 那他霉素光降解雜質(zhì)的13CNMR和1HNMR數(shù)據(jù)

2.3.3 結(jié)構(gòu)解析

由MS(ESI+)圖譜可知,該光降解雜質(zhì)的相對分子質(zhì)量為665,與那他霉素的相對分子質(zhì)量相同。參照文獻(xiàn)[5]對NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)該光降解雜質(zhì)與那他霉素的C、H個數(shù)相同,因此,確定該光降解雜質(zhì)的分子式與那他霉素相同。比對該光降解雜質(zhì)與那他霉素的NMR數(shù)據(jù),可以看出二者數(shù)據(jù)基本一致,其中C12 (ΔδC2.8)、C15(ΔδC2.6)、C27(ΔδC1.6)等的化學(xué)位移差別較大,推測是由C15和C12構(gòu)型的改變引起;在NOESY圖譜中可觀察到H12/H14和H12/H10的NOE效應(yīng),表明H12為β朝向;NOESY圖譜中H15與H12無NOE相關(guān),表明H15為α朝向,即C15處構(gòu)型未發(fā)生改變。

綜上,推測該光降解雜質(zhì)為那他霉素的C12位差向異構(gòu)體,其結(jié)構(gòu)式見圖3。

圖3 那他霉素光降解雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)式Fig.3 Structure formula of photodegradation impurity of Natamycin

3 結(jié)論

將那他霉素精品在光照強(qiáng)度5 000 Lx下進(jìn)行光降解,得到那他霉素光降解雜質(zhì)粗品,采用制備液相色譜法對那他霉素光降解雜質(zhì)粗品進(jìn)行分離純化,并通過MS和NMR 等分析手段對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定,確定該光降解雜質(zhì)為那他霉素的C12位差向異構(gòu)體。該研究開發(fā)了一種微量潛在雜質(zhì)的制備方法,對于開展藥品質(zhì)量控制和安全性評價具有重要意義。