張 紅,趙 鑫,吳 昊,溫 彤,馬 勇

(包頭師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,內(nèi)蒙古 包頭 014030)

類(lèi)胡蘿卜素是脂溶性萜類(lèi)化合物,可分為原A和非原A化合物,也可分為“無(wú)氧胡蘿卜素”和“含氧葉黃素”[1]。前者包括番茄紅素、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、γ-胡蘿卜素;后者包括葉黃素、玉米黃質(zhì)、β-隱黃質(zhì)、蝦紅素、海膽烯酮和蝦青素[2-3]。類(lèi)胡蘿卜素主要由8個(gè)異戊二烯基團(tuán)通過(guò)共軛雙鍵構(gòu)成[4]。類(lèi)胡蘿卜素的顏色因共軛雙鍵的數(shù)目不同而表現(xiàn)出黃、橙、紅等顏色特征。人類(lèi)自身不能合成類(lèi)胡蘿卜素,需從外界攝取,故類(lèi)胡蘿卜素是平衡人類(lèi)膳食的重要成分。類(lèi)胡蘿卜素具有多種生物學(xué)功能,如維生素A活性、調(diào)節(jié)免疫力、預(yù)防癌癥、降低退行性疾病(如白內(nèi)障、心血管疾病等)的風(fēng)險(xiǎn)、延緩衰老等。類(lèi)胡蘿卜素的用途較廣泛[5-9],其市場(chǎng)需求量增長(zhǎng)非常迅速,預(yù)計(jì),2022～2027年的年復(fù)合增長(zhǎng)率(CAGR)為5.7%。 化學(xué)合成法可滿足人們對(duì)類(lèi)胡蘿卜素的商業(yè)需求,但合成過(guò)程中產(chǎn)生的部分副產(chǎn)品具有高過(guò)敏性或致癌性。天然類(lèi)胡蘿卜素在植物和微生物(酵母、細(xì)菌和微藻)中發(fā)揮生物活性,但從植物中提取類(lèi)胡蘿卜素存在成本高、受季節(jié)限制等問(wèn)題[10],而微生物發(fā)酵具有產(chǎn)率高、合成周期短、綠色安全、色澤純正、易于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn),且不受自然條件、季節(jié)變化及病蟲(chóng)害的影響,在很大程度上滿足了人們對(duì)天然類(lèi)胡蘿卜素的需求。產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素的微生物主要有葡萄球菌(Staphylococcus)、黃桿菌(Microbacterium)、紅酵母(Rhodotorula)、三孢布拉霉(Blakesleatrispora)、杜氏藻(Dunaliellasalina)、紅球藻(Haematococcuspluvialis)等[11]。研究[12]表明,膠紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)具有單細(xì)胞的獨(dú)特性和生長(zhǎng)快速的優(yōu)勢(shì),是工業(yè)化生產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素的潛在來(lái)源。在此,作者對(duì)膠紅酵母產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,為類(lèi)胡蘿卜素的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 膠紅酵母產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素的代謝途徑

最常見(jiàn)的合成類(lèi)胡蘿卜素的真菌有酵母和霉菌,酵母廣泛分布在陸地、海洋、淡水等環(huán)境中[11],主要包括擲孢酵母屬(Sporobolomycesspp.)、紅法夫酵母屬(Phaffiaspp.)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidiumspp.)及紅酵母屬(Rhodotorulaspp.)等[12-13]。膠紅酵母屬子囊菌門(mén)、隱形酵母科、紅酵母屬,是單細(xì)胞真核生物[14-15]。隨著基因組學(xué)和蛋白組學(xué)的發(fā)展,人們對(duì)膠紅酵母產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素的代謝途徑有了更清晰的認(rèn)識(shí)。膠紅酵母細(xì)胞經(jīng)過(guò)一系列酶催化的環(huán)化、氧化、還原、異構(gòu)化以及羥基化反應(yīng)生成次級(jí)代謝產(chǎn)物類(lèi)胡蘿卜素(圖1)[16-21]。

注:HMGR:HMG-CoA還原酶; ERG20:法尼焦磷酸合酶; EGR9:鯊烯合酶; CrtB:八氫番茄紅素合成酶; CrtE:GGPP合成酶;

生物合成異戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate,IPP)有2種模塊:甲羥戊酸(mevalonic acid,MVA)模塊和2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(2-methyl-D-erythritol-4-phosphate,MEP)模塊[10,22]。其中膠紅酵母細(xì)胞內(nèi)類(lèi)胡蘿卜素的合成屬于MVA模塊,該合成反應(yīng)發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,初始物質(zhì)是乙酰CoA。膠紅酵母產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素的代謝途徑主要包括以下3個(gè)步驟:

(1)合成開(kāi)始階段。從碳源轉(zhuǎn)化為丙酮酸,通過(guò)丙酮酸脫氫酶復(fù)合物轉(zhuǎn)化為乙酰CoA;在HMG-CoA合成酶的催化下,將3分子的乙酰CoA轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A (3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A,HMG-CoA),緊接著轉(zhuǎn)化為MVA;MVA經(jīng)過(guò)磷酸化和脫羧作用合成IPP,即類(lèi)異戊二烯的一般前體。

(2)番茄紅素的合成階段。IPP在異戊二烯基焦磷酸異構(gòu)酶(isopentenyl diphosphate isomerase,IPPI)的作用下,異構(gòu)化為DMAPP;3分子的IPP按序添加到1個(gè)DMAPP中合成GGPP;GGPP在CrtYB催化下經(jīng)縮合反應(yīng)生成八氫番茄紅素(C40胡蘿卜素),然后在CrtI催化下得到番茄紅素。

(3)番茄紅素衍生出多種環(huán)狀類(lèi)胡蘿卜素。番茄紅素在一系列環(huán)化酶作用下,將其末端環(huán)化形成γ、β或δ環(huán)等。在CrtE、CrtB催化下,番茄紅素依次環(huán)化生成δ-胡蘿卜素和α-胡蘿卜素;而在CrtY催化下,番茄紅素環(huán)化生成γ-胡蘿卜素,進(jìn)而合成β-胡蘿卜素,再在CrtZ、CrtW催化下生成蝦青素。

番茄紅素是合成途徑的重要組成部分。提高β-胡蘿卜素產(chǎn)量的關(guān)鍵是增加萜類(lèi)的供應(yīng),防止麥角甾醇的生物合成,促進(jìn)GGPP向下游方向轉(zhuǎn)化[23]。

2 優(yōu)化菌株培養(yǎng)策略

類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)量受菌株、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件等因素影響而有顯著差異[24]。實(shí)現(xiàn)類(lèi)胡蘿卜素的大規(guī)模化生產(chǎn)策略,應(yīng)重點(diǎn)從以下3方面開(kāi)展:首先,馴化高產(chǎn)的紅酵母菌株,使生物量高水平表達(dá);其次,優(yōu)化培養(yǎng)條件及發(fā)酵工藝,促進(jìn)紅酵母菌株生長(zhǎng);最后,從經(jīng)濟(jì)友好和生態(tài)健康的角度上,開(kāi)發(fā)高效的方法破碎紅酵母細(xì)胞和積累細(xì)胞色素[25-26]。

2.1 光誘導(dǎo)分析

生物體內(nèi)類(lèi)胡蘿卜素的合成是一種光保護(hù)機(jī)制,類(lèi)胡蘿卜素可作為一種抗氧化劑,保護(hù)細(xì)胞免受紫外線傷害[27]。類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)量取決于光照時(shí)間和強(qiáng)度。光誘導(dǎo)與微生物生長(zhǎng)有直接相關(guān)性,生物合成所必需的酶活性的提高會(huì)促進(jìn)相關(guān)類(lèi)胡蘿卜素的積累[11,28-29]。

2.2 碳氮分析

在大多數(shù)酵母中,色素積累開(kāi)始于對(duì)數(shù)階段的后期,并持續(xù)在固定階段,而合適的碳源和氮源對(duì)非生長(zhǎng)階段的類(lèi)胡蘿卜素的生物合成非常重要。碳氮比在(11～33)∶1范圍內(nèi),類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)量差異不明顯;但隨著碳氮比的增大,類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)量下降?？刂坪门囵B(yǎng)基中碳源和氮源的質(zhì)量濃度,可促進(jìn)酵母生長(zhǎng)和類(lèi)胡蘿卜素的積累。培養(yǎng)條件對(duì)膠紅酵母產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素的影響如表1所示。

表1 培養(yǎng)條件對(duì)膠紅酵母產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素的影響

吳永存等[37]利用好食脈孢菌與紅酵母協(xié)同發(fā)酵玉米秸稈,采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了培養(yǎng)條件和發(fā)酵工藝,結(jié)果表明,20%的接種量(好食脈孢菌∶紅酵母=1∶1)可顯著提高類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)量。玉米秸稈的粗纖維含量高、蛋白質(zhì)含量低,經(jīng)好食脈孢菌和紅酵母協(xié)同發(fā)酵后,玉米秸稈的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值明顯提升,為生產(chǎn)功能性飼料提供了理論依據(jù)。利用豆類(lèi)、水果及其它原料加工過(guò)程中的廢棄殘?jiān)鳛榻湍赴l(fā)酵的碳源,可減少環(huán)境污染、實(shí)現(xiàn)廢棄物的高值化利用。

2.3 金屬元素分析

類(lèi)胡蘿卜素是一種抗氧化性色素,能有效清除O2和過(guò)氧化自由基。類(lèi)胡蘿卜素參與微生物的應(yīng)激反應(yīng),其合成受到外源應(yīng)激因素的影響,其中無(wú)機(jī)鹽對(duì)維持培養(yǎng)基的穩(wěn)態(tài)起到微緩沖作用。唐棠等[38]研究了8種無(wú)機(jī)鹽組分對(duì)紅酵母Y-5發(fā)酵產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素的影響,確定最優(yōu)無(wú)機(jī)鹽組分為KH2PO4、MgSO4和NaCl。

近年來(lái),稀土元素的生物效應(yīng)成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn),尤為突出的是Hormesis效應(yīng)[39],即毒理學(xué)上的“低促高抑”作用。稀土元素可能通過(guò)作用生物膜、酶分子、核酸等對(duì)微生物產(chǎn)生Hormesis效應(yīng)。陳聲明等[40]研究發(fā)現(xiàn),LaCl3和NdCl3濃度在25～50 mg·L-1范圍內(nèi)時(shí),對(duì)紅假單胞菌產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素有較好的促進(jìn)作用;而濃度高于75 mg·L-1時(shí)對(duì)紅假單胞菌細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用,且隨濃度的增加抑制作用增強(qiáng)。王怡平等[41]研究發(fā)現(xiàn),稀土元素La3+、Ce3+、Nd3+在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)紅酵母代謝產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素有促進(jìn)作用,當(dāng)LaCl3濃度為20 mg·L-1時(shí),類(lèi)胡蘿卜素含量提高了32.1%;當(dāng)CeCl3濃度為5 mg·L-1時(shí),類(lèi)胡蘿卜素含量提高了36.8%;當(dāng)NdCl3濃度為50 mg·L-1時(shí),類(lèi)胡蘿卜素含量提高了42.8%。在培養(yǎng)過(guò)程中用刺激物或誘導(dǎo)物適當(dāng)處理有助于提高類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)量,這可能是由于金屬作為輔助因子介導(dǎo)的激活(或抑制)特定關(guān)鍵酶的作用。

3 類(lèi)胡蘿卜素提取策略

類(lèi)胡蘿卜素的提取方法[42-43]如表2所示。

表2 類(lèi)胡蘿卜素的提取方法

其中超聲波輔助酸熱法的類(lèi)胡蘿卜素提取效果最優(yōu),其次是酸熱水解法,其具有操作簡(jiǎn)單、成本低、對(duì)內(nèi)溶物破壞小、破壁效果顯著等特點(diǎn),但對(duì)儀器設(shè)備的腐蝕性較強(qiáng),需及時(shí)除酸。綜合考慮工業(yè)化生產(chǎn)成本及操作條件等因素,目前最佳提取方法為酸熱水解法。

4 利用基因工程手段定向改變策略

物理和化學(xué)誘變能提高突變率,而基因工程手段可以通過(guò)定向調(diào)控酶基因獲得理想效果,進(jìn)一步提高類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)量。Landolfo等[44]研究了膠紅酵母C2.5t1合成胡蘿卜素的CAR基因及基因簇的轉(zhuǎn)錄水平。 國(guó)內(nèi)外學(xué)者從擬南芥(Arabidopsisthalina)、小球藻(Chlorellazofingiensis)、紅法夫酵母(Xanthophyllomycesdendrorhous)、雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)、歐文氏菌(Erwiniauredevora)、紅酵母等生物體中克隆出了IPPI基因、DMAPP合成酶基因、crtYB基因等一系列與類(lèi)胡蘿卜素合成相關(guān)基因,深入研究其調(diào)控機(jī)理?；诖x流中各個(gè)反應(yīng)步驟中相應(yīng)酶和產(chǎn)物關(guān)系以及編碼基因相互間作用,以IPP-DMAPP為界,可將代謝途徑分為上游和下游(圖1),其中上游是MVA模塊,HMG-CoA還原酶由hmg1和hmg2基因編碼,被視為類(lèi)異戊二烯途徑的關(guān)鍵調(diào)控酶[45]。Wang等[46]在酵母誘變菌株K4中引入并過(guò)表達(dá)HMG-CoA還原酶基因hmg1,構(gòu)建的轉(zhuǎn)化子G1可使類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)量提高到16.98 mg·L-1;此外,麥角甾醇在合成FPP途徑中與IPP產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng),通過(guò)阻斷ERG9酶基因的表達(dá)使麥角甾醇的合成大大削弱,從而獲得了類(lèi)胡蘿卜素高產(chǎn)工程菌。Shimada等[47]將歐文氏菌基因crtE、crtB、crtI分別與pgk、gal7、cap基因的啟動(dòng)子和終止子構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到S.cervisiaeR7中,約10%的麥角甾醇進(jìn)入到類(lèi)胡蘿卜素合成下游途徑中。類(lèi)胡蘿卜素合成的異源表達(dá)與上下游模塊中不同異源酶蛋白的表達(dá)處于相對(duì)統(tǒng)一時(shí),才能使多基因功能的適配性與宿主細(xì)胞間的適配性達(dá)到最佳[10]。葉立軍等[48]采用Golden Gate方法進(jìn)行一次性多基因組裝,將來(lái)源于P.agglomerans的4個(gè)功能基因crtE、crtY、crtI、crtB與不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子結(jié)合構(gòu)建質(zhì)粒文庫(kù),同時(shí)調(diào)控多功能基因表達(dá),β-胡蘿卜素產(chǎn)量最高提高了65.2%。金應(yīng)福等[49]通過(guò)引入番茄紅素環(huán)化酶基因crtY構(gòu)建β-胡蘿卜素合成模塊,并采用寡聚接頭介導(dǎo)的DNA組裝方法(oligo-linker mediated asembly method, OLMA)對(duì)CrtY的基因來(lái)源、表達(dá)水平等進(jìn)行高通量?jī)?yōu)化,通過(guò)篩選獲得β-胡蘿卜素高產(chǎn)工程菌株。

除了調(diào)控代謝流,還可以通過(guò)敲除旁支基因使其更多流向次級(jí)代謝物。CRISPR-Cas9是近年來(lái)基因組工程中十分熱門(mén)的基因編輯技術(shù)。湯皓等[50]構(gòu)建了質(zhì)粒p416-CAS9-gRNA,經(jīng)基因編輯后可以高效敲除Cas9,不僅避免了Cas9對(duì)酵母中類(lèi)胡蘿卜素合成的影響,還提高了基因編輯效率。但以往關(guān)于膠紅酵母產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素過(guò)程的報(bào)道,缺乏一些合成相關(guān)基因組功能注釋,可能會(huì)影響利用膠紅酵母提高類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)量的代謝效應(yīng)。

5 結(jié)語(yǔ)

膠紅酵母是有潛力的類(lèi)胡蘿卜素工業(yè)化生產(chǎn)菌株,但僅通過(guò)優(yōu)化膠紅酵母培養(yǎng)條件提升類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)量空間有限。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展,對(duì)膠紅酵母的潛力進(jìn)行重新挖掘,使基因靶向和隨機(jī)插入突變技術(shù)成為可能。近年來(lái),CRISPR-Cas9系統(tǒng)用于菌株基因敲除方面的完善,對(duì)理解單基因和基因網(wǎng)絡(luò)的功能及碳通量的管理具有重要意義。實(shí)時(shí)定量分析工具以及蛋白質(zhì)組學(xué)的相結(jié)合,有望為工業(yè)水平上優(yōu)化類(lèi)胡蘿卜素生產(chǎn)提供有用的工具,并將這些非常規(guī)酵母轉(zhuǎn)化為方便的“細(xì)胞工廠”。