黃碧蕓,卓仁英,喬桂榮*

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所,浙江 杭州 311400;2.南京林業(yè)大學(xué)林草學(xué)院,江蘇 南京 210037)

毛竹(Phyllostachysedulis)生長快、分布廣、成材早、產(chǎn)量高,在建材、食品、觀賞、環(huán)保等方面廣泛的應(yīng)用價值使其具有不可替代的生態(tài)、經(jīng)濟(jì)地位[1]。第9次全國森林資源調(diào)查結(jié)果顯示,我國現(xiàn)有毛竹林467.8萬hm2,占我國竹林總面積的72.69%。隨著2013年毛竹基因組測序的完成[2],毛竹快速生長、莖稈發(fā)育等特性相關(guān)基因的研究備受關(guān)注[3-4]。但由于缺乏完善的組織培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化體系,毛竹基因功能主要通過在水稻(Oryzasativa)、擬南芥(Arabidopsisthaliala)等模式植物中進(jìn)行異源轉(zhuǎn)化驗(yàn)證。目前,竹子組織培養(yǎng)研究多集中于叢生竹種,如麻竹(Dendrocalamuslatiflorus)、版納甜龍竹(Dendrocalamushamiltonii)等[6-7]。有關(guān)竹子遺傳轉(zhuǎn)化研究報道甚少,Qiao等[8]和Ye等[9]在麻竹中建立了遺傳轉(zhuǎn)化體系。經(jīng)過多年努力,中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所成功建立了以毛竹未成熟胚為外植體的離體再生及遺傳轉(zhuǎn)化體系,并實(shí)現(xiàn)了基因編輯技術(shù)在毛竹上的應(yīng)用[10],為毛竹分子生物學(xué)研究及育種提供了技術(shù)支持。

在植物組織培養(yǎng)過程中,愈傷組織表現(xiàn)為多種不同的狀態(tài),通過觀察愈傷的顏色、質(zhì)地、形狀大小可將其進(jìn)行分類。組織培養(yǎng)過程中挑選適宜狀態(tài)的愈傷組織,有利于愈傷組織增殖及提高植株再生率。有學(xué)者對山杏(Armeniacasibirica)[11]、荻(Miscanthussacchariflorus)[12]、墨西哥玉米草(Zeamexicana)[13]、芍藥(Paeonialactiflora)[14]等植物組織培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的不同類型愈傷組織進(jìn)行了研究,結(jié)果顯示不同類型愈傷組織在細(xì)胞組成、增殖能力、分化能力上存在較大差異。本研究通過石蠟切片、流式細(xì)胞儀、實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)對3種不同類型的毛竹愈傷組織進(jìn)行差異分析,經(jīng)過組織細(xì)胞學(xué)觀察對各類愈傷組織結(jié)構(gòu)差異、細(xì)胞類型進(jìn)行比較;利用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期時相分布比例,比較不同類型愈傷組織細(xì)胞群體的增殖活性,以期選出適合于毛竹離體再生的愈傷組織材料,并對毛竹不同類型愈傷組織中胚性維持及生長調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行分析,篩選可用于后續(xù)提高再生效率的候選基因。

1 材料與方法

1.1 供試材料

毛竹種子于2020年7—8月采自廣西壯族自治區(qū)天然開花毛竹林(110°46′12″E,25°12′36″N),種子采后于4 ℃條件下保存。人工挑選狀態(tài)一致、籽粒飽滿的毛竹未成熟種子,去除種子外殼;將外殼霉變污染嚴(yán)重和成熟的褐色種子剔除,避免造成污染及影響后續(xù)愈傷誘導(dǎo)率,保留黃綠色鮮嫩種子用于誘導(dǎo)愈傷組織。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 毛竹愈傷組織誘導(dǎo)、增殖及分化培養(yǎng)

將種子置于自來水下沖洗2 h,轉(zhuǎn)移至超凈臺內(nèi)用75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液浸泡1 min后以2.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的 NaClO(含有0.1%Tween-20)浸泡滅菌15～20 min,無菌水沖洗3～5次,于無菌濾紙上將未成熟胚分離,胚根向下接種于誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基(MS+30 g/L蔗糖 + 8 g/L瓊脂+4 mg/L 2,4-D, pH 5.8)。誘導(dǎo)2周左右毛竹未成熟胚盾片部位膨大,開始愈傷化;培養(yǎng)后將盾片部位產(chǎn)生的愈傷組織與外植體分離,轉(zhuǎn)移至含有0.5 mg/L 2,4-D的愈傷繼代培養(yǎng)基(MS+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂+0.5 mg/L 2,4-D, pH5.8)繼續(xù)培養(yǎng),每隔30 d更換1次培養(yǎng)基。不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L BA+3.0 mg/L ZT+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂, pH 5.8。愈傷組織誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)條件為25 ℃黑暗培養(yǎng),不定芽誘導(dǎo)為16 h光照/8 h黑暗培養(yǎng)。當(dāng)繼代培養(yǎng)至3個月時,根據(jù)毛竹愈傷組織顏色、質(zhì)地、形態(tài)特征將其分為3種類型(白色半透明型、白色致密型和黃色致密型)。挑選各狀態(tài)愈傷組織,部分材料在徠卡MF165體視顯微鏡下觀察并拍照記錄后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測,其余材料分別用酒精醋酸福爾與林固定液(FAA)固定和液氮冷凍處理,作為石蠟切片和qRT-PCR試驗(yàn)材料。

1.2.2 愈傷組織石蠟切片

愈傷組織石蠟切片方法參考文獻(xiàn)[15],選取各類型毛竹愈傷組織,將材料用酒精醋酸福爾馬林固定液(FAA)固定液(甲醛、乙酸、甘油、乙醇、水的體積比為 2∶1∶2∶10∶5)浸沒,抽真空15 min,重復(fù)2次,室溫固定24 h后逐級脫水,再經(jīng)過浸蠟包埋處理,用石蠟切片機(jī)(賽默飛 Thermo Fisher HM325)將材料切成10 μm厚的連續(xù)蠟片,在載玻片上展片后烤片烘干,脫蠟過程中用番紅-固綠染色,中性樹脂封片后在徠卡DM4000B顯微鏡下觀察、拍照記錄。

1.2.3 愈傷組織流式細(xì)胞分析

取少量毛竹愈傷組織置于干凈的培養(yǎng)皿中,加入1.5 mL預(yù)冷的MgSO4細(xì)胞解離液[50 mmol /L KCl、10 mmol /L MgSO4·7H2O、5 mmol /L 羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、6.48 mmol/L DTT、0.25% Triton X-100],用鋒利的單面刀片將愈傷組織快速切碎,冰上放置5 min,經(jīng)40 μm的濾膜過濾解離液至1.5 mL EP管中,4 ℃、1 000 r/min離心5 min收集沉淀,用500 μL預(yù)冷解離液重懸沉淀,加入RNaseA (終質(zhì)量濃度為 30 μg /mL)、碘化丙啶(PI)染料(終質(zhì)量濃度為 100 μg/mL)于樣品中,4 ℃避光染色15 min后上樣于BD Accuri C6流式細(xì)胞儀,檢測單個細(xì)胞核DNA含量。流式細(xì)胞儀檢測過程選擇低速上樣,選用488 nm激發(fā)器、FL2濾光片(610/20)檢測PI-DNA熒光信號。每類愈傷收集10 000個細(xì)胞,重復(fù)3次。利用Modfit LT軟件對檢測結(jié)果進(jìn)行分析,統(tǒng)計(jì)細(xì)胞周期中各時期即DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)和DNA合成后期(G2期) 的百分比。

1.2.4 愈傷組織WUS、GRF基因表達(dá)分析

取液氮速凍后保存于-80 ℃ 冰箱的各狀態(tài)毛竹愈傷組織,轉(zhuǎn)移至去酶處理并液氮預(yù)冷的研缽中磨成粉末后用 Norgan Biotek 公司的 Total RNA Purification Kit 試劑盒,參照試劑盒說明書步驟提取3種類型毛竹愈傷組織總 RNA,每種類型愈傷取3個生物學(xué)重復(fù)。用分光光度儀檢測RNA 濃度,1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 提取質(zhì)量。

提取的毛竹愈傷總 RNA,以0.5 μg總RNA為模板, 用PrimeScript RT Master Mix (cat. No. RR036A, TaKaRa) 反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成 cDNA 第1鏈(具體反應(yīng)體系參照試劑盒說明書),反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,稀釋 10 倍后可用作 qRT-PCR 反應(yīng)模板。

以擬南芥WUS、GRF蛋白序列為參照序列比對毛竹二代基因組數(shù)據(jù),得到對應(yīng)家族成員基因ID,分別設(shè)計(jì)qRT-PCR引物如表1所示。以上述cDNA為模板,PeTIP41作為內(nèi)參基因[16],用 TB GreenTMPremix ExTaqTM試劑盒(購自 TaKaRa 寶生物工程有限公司)和實(shí)時熒光定量 PCR 儀 Applied Biosystems 7300 進(jìn)行 qRT-PCR 反應(yīng),檢測胚性維持及生長調(diào)節(jié)相關(guān)的WUSCHEL(WUS)基因和growth-regulating factor(GRF)基因在不同類型毛竹愈傷組織的表達(dá)量。

反應(yīng)體系如下:cDNA模板 2 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL,2×TB GreenTMPremix ExTaqTM10 μL,ROX Reference Dye (50×) 0.4 μL,ddH2O 6.8 μL,總計(jì)20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s,60 ℃退火31 s,共40個循環(huán)。熔解曲線:95 ℃,15 s;60 ℃,60 s;95 ℃,15 s。結(jié)果采用 2-ΔΔCT的方法計(jì)算每個基因在不同類型愈傷組織中的相對表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,多組樣本均值比較采用單因素方差分析,P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛竹愈傷組織類型及組織細(xì)胞學(xué)觀察

a、A. 第Ⅰ類愈傷組織the type Ⅰ callus; b、B. 第Ⅱ類愈傷組織the type Ⅱ callus; c、C.第Ⅲ類愈傷組織the type Ⅲ callus; d. 第Ⅰ類愈傷組織繼代后褐化the type Ⅰ callus browning during subculture; e. 第Ⅱ類愈傷組織繼代后增殖the type Ⅱ callus proliferated after subculture; f. 第Ⅲ類愈傷組織繼代后表面產(chǎn)生白色顆粒愈傷the type Ⅲ callus produced white granular callus on the surface after subculture; g、h.愈傷組織繼代過程中分化出芽和根shoot and root differentiation from callus during subculture; i. 組培瓶中第Ⅱ類愈傷分化再生植株的同時增殖產(chǎn)生新的愈傷in tissue culture flask, the type Ⅱ callus differentiated into plants and proliferated to produce new callus;D、E. 愈傷組織內(nèi)部胚性細(xì)胞團(tuán)embryonic cell clumps inside callus; F. 愈傷組織內(nèi)部子葉胚cotyledon embryo inside callus。 黑色箭頭→指向非胚性細(xì)胞black arrow represents the non-embryonic cells;紅色箭頭指向胚性細(xì)胞red arrow represents the embryonic cells; 黃色箭頭指向分生組織細(xì)胞團(tuán)yellow arrow represents the meristematic cell mass; 粉色箭頭指向子葉胚 pink arrow represents the cotyledon embryo。圖1 不同類型毛竹愈傷組織及組織細(xì)胞學(xué)觀察Fig. 1 Different types of callus and their cytological observation of moso bamboo

繼代過程中毛竹愈傷組織根據(jù)顏色、質(zhì)地、形態(tài)特征可分為3種類型。第Ⅰ類愈傷組織整體呈白色半透明狀,質(zhì)地松散易碎、含水率高(圖1a)。愈傷組織表面及內(nèi)部細(xì)胞大小差異明顯,表面由單層類表皮細(xì)胞組成,細(xì)胞體積小,排列規(guī)則。內(nèi)部細(xì)胞呈橢圓形,排列松散,細(xì)胞體積大,細(xì)胞壁薄,未觀察到細(xì)胞核及細(xì)胞內(nèi)容物,整體空泡化(圖1A)。隨著繼代時間增加,此類愈傷組織不斷增大,繼代多次后愈傷組織增殖能力逐漸降低,最終褐化死亡(圖1d),不具有分化產(chǎn)生植株的能力。

第Ⅱ類愈傷組織外觀呈乳白色,整體組織致密,表面有不規(guī)則突起(圖1b)。組織細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),愈傷組織表層有3～5層胚性細(xì)胞緊密排列,突起部分是由胚性細(xì)胞分裂形成的多個分生組織細(xì)胞團(tuán)。這類胚性細(xì)胞體積小,有大而明顯的細(xì)胞核,液泡較少或無液泡,細(xì)胞內(nèi)含物多,染色深。除了愈傷組織表層,愈傷組織內(nèi)部也存在分生組織細(xì)胞團(tuán)(圖1D、1E),外部由大體積非胚性細(xì)胞包裹,兩者分界明顯(圖1B)。分生組織細(xì)胞團(tuán)內(nèi)細(xì)胞不斷分裂后產(chǎn)生極性,出現(xiàn)由圓形的小體積細(xì)胞組成的頂端以及體積較大的長方形細(xì)胞組成的基部,形成原胚。頂端細(xì)胞繼續(xù)分裂分化后形成子葉胚,分裂分化旺盛的細(xì)胞集中于頂端,周圍細(xì)胞逐漸解體消失,形成空腔(圖1F)。繼代時發(fā)現(xiàn),此類愈傷組織增殖能力強(qiáng),隨著繼代次數(shù)的增加未出現(xiàn)減弱的現(xiàn)象,愈傷組織增殖后本體不斷變大,表面會產(chǎn)生球狀愈傷組織顆粒(圖1e),觸碰易分離,掉落的小顆粒愈傷組織具有與此類愈傷組織相同性狀。此類愈傷繼代過程中能夠自主分化成產(chǎn)生根和芽(圖1g、1h),在組培瓶中生成再生植株的同時,愈傷能夠保持增殖活力,產(chǎn)生新的愈傷塊(圖1i)。經(jīng)分化誘導(dǎo),其不定芽分化率可達(dá)34%左右。

第Ⅲ類愈傷組織表面呈淡黃色或乳黃色,質(zhì)地緊實(shí),愈傷組織表面呈圓球形突起,相互之間連接緊密(圖1c)。愈傷組織表面有胚性細(xì)胞分布,但愈傷組織內(nèi)部存在大量小體積的非胚性細(xì)胞,細(xì)胞排列十分緊密且細(xì)胞壁厚(圖1C)。此類愈傷組織具有增殖能力,但增殖速度慢于第Ⅱ類愈傷組織,幾乎不能分化產(chǎn)生再生植株。多次繼代后黃色愈傷組織塊變大但仍較致密緊實(shí),愈傷組織表面產(chǎn)生白色小顆粒愈傷(圖1f),該小顆粒愈傷組織可輕松與母體脫離,繼代逐漸發(fā)展成第Ⅱ類愈傷組織。

2.2 不同類型愈傷流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

不同細(xì)胞分裂周期的細(xì)胞核內(nèi)DNA含量不同,PI染料能夠結(jié)合DNA,流式細(xì)胞儀檢測到的熒光強(qiáng)度直接反應(yīng)細(xì)胞核內(nèi)DNA含量[17],并通過Modfit LT軟件分析計(jì)能夠顯示各細(xì)胞時期的細(xì)胞數(shù)量比(圖2)。如圖2b為毛竹第Ⅱ類愈傷組織流式分析結(jié)果圖,從圖中可以直觀地看到各細(xì)胞時期的分布比例。圖2b中第1個峰代表的是G1期,所占比例為80.74%;第2個峰代表的是G2期,所占比例為9.88%;兩個峰之間的陰影部分代表的是S期,所占比例為9.37%。其他結(jié)果以相同方法處理,得出不同類型毛竹愈傷組織G1期、S期、G2期細(xì)胞百分比平均值分別如圖2d所示。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05)。The same below.圖2 基于Modifit LT 分析的不同類型毛竹愈傷組織流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果Fig. 2 Flow cytometry test results of different types of callus moso bamboo based on the Modifit LT analysis plot

3類愈傷組織各時期細(xì)胞分布比例趨勢基本一致,但第Ⅱ類愈傷組織G2期細(xì)胞比例顯著高于其他兩組愈傷組織,達(dá)到8.95%,S期細(xì)胞比例占也是高于其他兩種類型,達(dá)到8.78%,與石蠟切片結(jié)果中第Ⅱ類愈傷組織內(nèi)具有多個分生組織細(xì)胞團(tuán)的結(jié)果相對應(yīng),推斷出該類愈傷組織處于分裂期的細(xì)胞數(shù)量較多,具有較強(qiáng)的增殖能力;第Ⅰ類愈傷組織絕大多數(shù)細(xì)胞處于G1期,占細(xì)胞總數(shù)的92.59%,S期和G2期細(xì)胞所占比例顯著小于第Ⅱ類和第Ⅱ類,與切片結(jié)果顯示愈傷組織內(nèi)細(xì)胞為不具有分裂能力的非胚性細(xì)胞相對應(yīng);第Ⅲ類愈傷組織S期和G2期細(xì)胞所占比例相近,分別為細(xì)胞總數(shù)的6.49%和6.39%。G2期時相比例顯著小于第Ⅱ類愈傷,但S期時相比例與第Ⅱ類不存在顯著差異,說明第Ⅲ類愈傷組織也具有一定增殖能力但稍弱于第Ⅱ類。

2.3 不同類型愈傷組織基因表達(dá)分析

通過qRT-PCR技術(shù)對PeWUS基因和PeGRF基因家族成員在3種不同類型毛竹愈傷組織中的表達(dá)量進(jìn)行分析,檢測到5個PeWUS基因在3種不同類型愈傷組織中顯著差異表達(dá),其中ID為PH02Gene44184.t1和PH02Gene15929.t1在第Ⅱ類和第Ⅲ類胚性較強(qiáng)的愈傷組織中的表達(dá)量均顯著高于第Ⅰ類非胚性愈傷組織(圖3a);14個PeGRF基因在3種不同類型愈傷組織中差異表達(dá),其中ID為PH02Gene01484.t1、PH02Gene03343.t1和PH02Gene03768.t1的PeGRF在第Ⅱ類愈傷組織中的表達(dá)量均顯著高于其他兩種類型 (圖3b)。

圖3 不同類型毛竹愈傷組織WUS和GRF基因相對表達(dá)量Fig. 3 Relative expression of WUS and GRF genes in different types of callus moso bamboo

3 討 論

通過對3種類型毛竹愈傷組織進(jìn)行體視鏡觀察及石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn),不同類型的愈傷組織除表觀差異外,細(xì)胞學(xué)特征也存在明顯差異,這與對高粱(Sorghumbicolor)[18]、苜蓿(Medicagosativa)[19]、香樟(Cinnamormumcamphora)[20]、麻櫟(Quercusacutissima)[21]等植物愈傷組織的細(xì)胞學(xué)觀察結(jié)果一致。研究顯示,植物愈傷組織通?？煞譃榕咝杂鷤胺桥咝杂鷤麅纱箢?且不同類型的愈傷組織表觀存在差異,通常胚性愈傷組織質(zhì)地緊密、扎實(shí),表面具有突起,繼代過程中能夠產(chǎn)生新的愈傷組織,且易分化產(chǎn)生芽和根;而非胚性愈傷組織多表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)松軟、組織含水量高,且易在培養(yǎng)過程中褐化死亡。

本研究結(jié)果顯示,所觀察的3種毛竹愈傷組織中,白色半透明型的毛竹愈傷組織含水量高、質(zhì)地疏松、表面光滑,內(nèi)部細(xì)胞排列松散,細(xì)胞體積大且內(nèi)含物少,呈空泡狀,屬于非胚性愈傷;白色致密型和黃色致密型愈傷組織為胚性愈傷組織,內(nèi)部結(jié)構(gòu)緊密,表面具有小顆粒狀突起。小體積、具有明顯細(xì)胞核且細(xì)胞質(zhì)濃的胚性細(xì)胞緊密排列形成胚性細(xì)胞團(tuán),分布于這兩類愈傷組織的表面及內(nèi)部。該結(jié)果與馬來甜龍竹(Dendrocalamusasper)[22]、版納甜龍竹[23]、慈竹(Neosinocalamusaffinis)[24]、香竹(Chimonocalamusdelicatus)[25]愈傷組織培養(yǎng)研究過程中胚性愈傷質(zhì)地緊密、愈傷組織表面具有不規(guī)則突起的表型一致。但在慈竹和香竹愈傷組織培養(yǎng)過程中胚性愈傷組織呈現(xiàn)綠色和紫色,與本研究中白色或黃色胚性愈傷組織不同,可能是由于竹種間的不同及培養(yǎng)基中添加物質(zhì)不同造成的。閔義等[26]認(rèn)為組織培養(yǎng)繼代時非胚性愈傷組織易占據(jù)生長優(yōu)勢,應(yīng)對非胚性愈傷組織盡早進(jìn)行篩選和剔除,有利于形成胚性愈傷。因此,對毛竹愈傷組織類型進(jìn)行區(qū)分,并有目的地將白色和黃色致密型愈傷組織挑選培養(yǎng)有利于獲得均質(zhì)的胚性愈傷組織。

細(xì)胞周期是指細(xì)胞從一側(cè)分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程,可分為間期和極短的分裂期,間期又包括DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)與DNA合成后期(G2期)。采用流式細(xì)胞儀通過檢測與DNA相結(jié)合的PI染料快速分析細(xì)胞內(nèi)DNA含量,從而得出所檢測組織內(nèi)各時相細(xì)胞所占比例[27]。因此,流式細(xì)胞儀常被用于檢測組織培養(yǎng)再生植株的體細(xì)胞無性系倍性變異[28],以及愈傷組織增殖能力判別[29-30]。有關(guān)柑橘(Citruscalli)[30]愈傷組織再生能力研究中,通過檢測不同基因型柑橘愈傷組織的S期時相比例大小,比較愈傷組織增殖能力。本研究利用流式細(xì)胞儀測定了3種毛竹愈傷組織的細(xì)胞周期時相分布比例,結(jié)果顯示白色致密型愈傷組織S期和G2期時相比例均高于其他兩種類型檢測結(jié)果,且各類型愈傷G2期數(shù)據(jù)差異顯著,表明白色致密型愈傷組織內(nèi)細(xì)胞分裂能力最強(qiáng),這與此類型愈傷在繼代時能夠快速、大量增殖的表現(xiàn)相符合。

WUS轉(zhuǎn)錄因子屬于WOX基因家族,在胚胎發(fā)生及分生組織干細(xì)胞維持中起關(guān)鍵作用[31-33],研究表明WUS能夠在擬南芥中使體細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝约?xì)胞,并維持細(xì)胞分裂能力,促使形成體胚[34]。肖艷青[35]發(fā)現(xiàn),擬南芥表達(dá)GhWUS基因能夠誘導(dǎo)根尖形成胚狀體結(jié)構(gòu),并且體胚發(fā)生相關(guān)基因表達(dá)量上升。Hoerster等[36]在玉米中轉(zhuǎn)化表達(dá)WUS2基因促使玉米(Zeamays)體細(xì)胞胚胎的形成和再生,提高了轉(zhuǎn)化效率?？锶A琴等[37]在馬銀花(Rhododendronovatum)愈傷組織繼代至第5代快速增殖狀態(tài)時檢測到WUS基因表達(dá)量達(dá)到最高值。這些結(jié)果說明WUS基因參與植物細(xì)胞增殖及體胚形成過程。本研究中檢測到5個PeWUS基因在3種不同類型愈傷組織中顯著差異表達(dá),其中ID為PH02Gene44184.t1和PH02Gene15929.t1的PeWUS在第Ⅱ類和第Ⅲ類胚性較強(qiáng)愈傷組織中的表達(dá)量均高于第Ⅰ類非胚性愈傷組織,推測這兩個基因可能對于毛竹胚性細(xì)胞的維持起關(guān)鍵作用。

GRF基因是植物特有的,在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮生長調(diào)節(jié)作用[38-40]。大多數(shù)GRF可以促使細(xì)胞增殖,在幼嫩組織中比在成熟組織中更高表達(dá)。Wang等[4]在毛竹節(jié)間分生組織區(qū)檢測到與細(xì)胞增殖相關(guān)的11個GRF基因表達(dá)水平均高于成熟區(qū)。王錦楠[41]將銀腺楊(Populusalba×P.glandulosa)PagGRF12a和PagGRF12b基因過表達(dá)后發(fā)現(xiàn),過表達(dá)植株的葉片面積變大、細(xì)胞數(shù)目增多、細(xì)胞體積變小,同時細(xì)胞增殖標(biāo)志基因表達(dá)量顯著增加。擬南芥AtGRF4、AtGRF1基因功能類似,同樣參與細(xì)胞增殖[42];Kong等[43]發(fā)現(xiàn)AtGRF5及其同源基因能促進(jìn)雙子葉植物和單子葉植物的再生,包括油菜(Brassicanapus)、大豆(Glycinemax)、甜菜(Betavulgaris)、向日葵(Helianthusannuus)和玉米。由小麥(Triticumaestivum) 組成的融合蛋白能夠顯著提高小麥、黑小麥和水稻的再生效率和再生速度,且GRF4-GIF1在不存在外源性細(xì)胞分裂素的情況下誘導(dǎo)了小麥的高效再生,有助于選擇無選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植物[44]。Feng等[45]利用西瓜(Citrulluslanatus)內(nèi)源嵌合基因ClGRF4-GIF1將西瓜的遺傳轉(zhuǎn)化效率較以前提高了近9倍。本試驗(yàn)qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,14個PeGRF基因在3種類型愈傷組織中表達(dá)差異顯著,其中ID為PH02Gene01484.t1、PH02Gene03343.t1和PH02Gene03768.t1的基因在第Ⅱ類愈傷組織中的表達(dá)量均高于其他兩種類型。該類型愈傷組織不僅細(xì)胞分裂旺盛、增殖能力最強(qiáng),而且具有形成體胚的潛力,在繼代過程中可自主分化產(chǎn)生根和芽,形成再生植株。在該類愈傷組織中高表達(dá)的3個PeGRF可作為候選基因以進(jìn)一步提高毛竹再生效率,本實(shí)驗(yàn)室正在開展遺傳轉(zhuǎn)化相關(guān)驗(yàn)證試驗(yàn)。

本研究中3種不同類型毛竹愈傷組織的石蠟切片組織細(xì)胞學(xué)觀察、流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞時相分布比例和植物生長相關(guān)基因表達(dá)量檢測結(jié)果顯示,表面白色、組織致密類型的毛竹愈傷具有更強(qiáng)的細(xì)胞增殖與再生能力,推測其更適合作為毛竹組織培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化的材料。目前在竹子轉(zhuǎn)化過程中仍存在愈傷組織恢復(fù)較慢、轉(zhuǎn)化周期較長、再生和轉(zhuǎn)化效率低等問題,將來可嘗試?yán)肳US、GRF等基因來提高再生和轉(zhuǎn)化效率。