程 方,孫婷玉,葉建仁*

(1.南京林業(yè)大學(xué)林草學(xué)院,南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210037; 2.廣東象頭山國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局,廣東 惠州 516001)

由松針座盤孢菌(Lecanostictaacicola)引發(fā)的松針褐斑病嚴(yán)重阻礙了濕地松的推廣[1]。自開展?jié)竦厮?Pinuselliotii)抗松針褐斑病無性系的組織培養(yǎng)研究工作以來[2-5],以濕地松成熟胚、離體胚無菌苗、無菌實(shí)生苗等為外植體,已成功建立其器官發(fā)生的組織培養(yǎng)再生體系,并且使試管苗移栽成活[6-7]。相對(duì)于器官發(fā)生而言,體細(xì)胞胚胎發(fā)生具有數(shù)量多、速度快、結(jié)構(gòu)完整、再生率高、變異小等優(yōu)點(diǎn),是植物規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化快速繁殖和基因轉(zhuǎn)化再生植株的重要手段,在良種繁育中有著廣泛的應(yīng)用前景[8-9]。目前關(guān)于濕地松的體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究已有報(bào)道[10-15],但是仍存在胚性愈傷組織誘導(dǎo)率低的問題。影響胚性愈傷組織誘導(dǎo)的主要因素有基因型、培養(yǎng)基種類、激素和培養(yǎng)條件等。不同因素對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)的效果隨不同因素組合及培養(yǎng)材料而不盡相同。為此,本研究以抗病濕地松未成熟合子胚為外植體,探索適宜抗病濕地松體胚誘導(dǎo)的培養(yǎng)條件,進(jìn)一步提高抗病濕地松優(yōu)良基因型的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率,為濕地松的體胚發(fā)生提供更多的精英細(xì)胞系,促進(jìn)抗病濕地松家系組培苗的推廣應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 供試材料

從葉建仁等[4-5]在福建沙縣官莊林場(chǎng)建立的抗松針褐斑病濕地松種子園采集9號(hào)、8號(hào)、34號(hào)、2號(hào)、23號(hào)、39號(hào)、11號(hào)、25號(hào)、10號(hào)抗病家系的未成熟合子胚為外植體材料,6—8月采取定點(diǎn)定株分批采集濕地松未成熟球果,確定6月15日、6月22日、6月28日、7月4日、7月13日、7月28日、8月3日等7個(gè)球果采收期,每次每株采集6個(gè)球果。

1.2 外植體發(fā)育階段檢測(cè)

隨機(jī)抽取各濕地松家系球果7個(gè)采集時(shí)間的合子胚在體視顯微鏡((Leica MZ16, Wetzlar, Germany)下觀察合子胚的發(fā)育階段,參照Pullman等[16]的松屬合子胚發(fā)育階段劃分標(biāo)準(zhǔn)判斷不同家系、采集期合子胚的發(fā)育階段。

1.3 球果采集、家系和冷藏處理

球果采集以9號(hào)家系2019年7個(gè)采收期的雌配子體為試驗(yàn)材料(其中7月13日采集的球果采用冷藏運(yùn)輸?shù)姆绞?其余采收期的球果采用郵寄方式),誘導(dǎo)培養(yǎng)基為lobbly pine medium(LP)基本培養(yǎng)基[17],添加2.2 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、1.0 mg/L 6-芐基氨基嘌呤(6-BA)、15 g/L麥芽糖、200 mg/L肌醇、250 mg/L 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)、500 mg/L 酸水解酪蛋白(CH)、450 mg/L 谷氨酰胺、5.2 g/L瓊脂,每個(gè)處理50個(gè)雌配子體,培養(yǎng)21～35 d觀察并統(tǒng)計(jì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率。

球果家系以7月13日采集的濕地松9號(hào)、8號(hào)、34號(hào)、2號(hào)、23號(hào)、39號(hào)、11號(hào)、25號(hào)家系為試驗(yàn)材料,將其雌配子體培養(yǎng)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,每個(gè)處理35個(gè)雌配子體,培養(yǎng)21～35 d觀察統(tǒng)計(jì)胚性愈傷誘導(dǎo)率。

冷藏時(shí)間以7月13日采集的8號(hào)家系為材料,培養(yǎng)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,設(shè)置球果冷藏時(shí)間為0、5、15、30、60 d,每個(gè)處理32個(gè)雌配子體,培養(yǎng)21～35 d觀察并統(tǒng)計(jì)胚性愈傷誘導(dǎo)率。

1.4 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加物的處理

糖種類處理以7月4日采集的11號(hào)家系為試驗(yàn)材料,誘導(dǎo)培養(yǎng)基為LP添加2.2 mg/L 2,4-D、1.0 mg/L 6-BA、200 mg/L肌醇、250 mg/L MES 、500 mg/L CH、450 mg/L谷氨酰胺、5.2 g/L瓊脂,添加的各種糖質(zhì)量濃度分別為麥芽糖15、30 g/L,蔗糖15、30 g/L,葡萄糖15、30 g/L,每個(gè)處理35個(gè)雌配子體,培養(yǎng)21～35 d觀察統(tǒng)計(jì)胚性愈傷誘導(dǎo)率。

肌醇處理以6月15日采集的10號(hào)家系為試驗(yàn)材料,誘導(dǎo)培養(yǎng)基為LP添加2.2 mg/L 2,4-D、1.0 mg/L 6-BA、15 g/L麥芽糖、250 mg/L MES、500 mg/L CH、450 mg/L谷氨酰胺、5.2 g/L瓊脂,添加的肌醇質(zhì)量濃度分別為0、100、300、500、1 000 和 2 000 mg/L,每個(gè)處理35個(gè)雌配子體,培養(yǎng)21～35 d觀察統(tǒng)計(jì)胚性愈傷誘導(dǎo)率。

抗壞血酸處理以6月28日采集的11號(hào)家系為試驗(yàn)材料,誘導(dǎo)培養(yǎng)基為LP添加2.2 mg/L 2,4-D、1.0 mg/L 6-BA、15 g/L麥芽糖、200 mg/L肌醇、500 mg/L CH、250 mg/L MES、450 mg/L谷氨酰胺、5.2 g/L瓊脂,添加的抗壞血酸質(zhì)量濃度分別為0、1、2、3 mg/L,每個(gè)處理35個(gè)雌配子體,培養(yǎng)21～35 d觀察統(tǒng)計(jì)胚性愈傷誘導(dǎo)率。

a-c.發(fā)育早期 early stage; d-f. 發(fā)育中期 metaphase; g-i. 發(fā)育后期 late stages。圖1 濕地松合子胚發(fā)育的9個(gè)階段Fig. 1 The nine development process of zygotic embryo of Pinus elliottii

α-酮戊二酸和丙酮酸處理。以7月4日采集的34號(hào)家系為試驗(yàn)材料,誘導(dǎo)培養(yǎng)基為LP添加2.2 mg/L 2,4-D、1.0 mg/L 6-BA、15 g/L麥芽糖、200 mg/L肌醇、250 mg/L MES、500 mg/L CH、450 mg/L 谷氨酰胺、5.2 g/L瓊脂,添加的α-酮戊二酸和丙酮酸質(zhì)量濃度組合分別為0 mg/Lα-酮戊二酸和0 mg/L 丙酮酸(CK),0 mg/Lα-酮戊二酸和60.7 mg/L 丙酮酸,100 mg/Lα-酮戊二酸和0 mg/L丙酮酸,100 mg/Lα-酮戊二酸和60.7 mg/L丙酮酸,每個(gè)處理40個(gè)雌配子體,培養(yǎng)21～35 d觀察統(tǒng)計(jì)胚性愈傷誘導(dǎo)率。

1.5 激素組合

以7月13日采集的9號(hào)、8號(hào)、34號(hào)、2號(hào)、23號(hào)家系為試驗(yàn)材料,誘導(dǎo)培養(yǎng)基為LP添加15 g/L麥芽糖、200 mg/L肌醇、250 mg/L MES、500 mg/L CH、450 mg/L谷氨酰胺、5.2 g/L瓊脂,激素質(zhì)量濃度分別為2,4-D(2、4、6、8、10 mg/L)、6-BA(0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/ L)和激動(dòng)素(KT)(0、0.5、1.5、2.5、4.0 mg/ L)3因素5水平全面試驗(yàn)的125個(gè)組合,實(shí)驗(yàn)編號(hào)為Ⅰ-13～Ⅰ-137。每個(gè)處理35個(gè)雌配子體(每個(gè)家系7個(gè)雌配子體),培養(yǎng)21～35 d觀察并統(tǒng)計(jì)胚性愈傷誘導(dǎo)率。

1.6 培養(yǎng)條件及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有培養(yǎng)基在滅菌前pH調(diào)至5. 8,高溫高壓蒸汽滅菌(121 ℃,20 min)。所有材料均在(23±1) ℃,暗培養(yǎng)條件誘導(dǎo)胚性愈傷組織。實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)采用Excel 2020整理、分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 濕地松未成熟合子胚的發(fā)育階段

本研究發(fā)現(xiàn)在福建沙縣官莊林場(chǎng)采集的濕地松球果的發(fā)育階段大致可分為9個(gè)階段(圖1),其中:a—c為合子胚發(fā)育早期階段;d—f為合子胚發(fā)育中期階段;g—i為合子胚發(fā)育后期階段。研究中,6月15日和6月22日兩個(gè)時(shí)間未檢測(cè)出合子胚形態(tài);6月28日和7月4日合子胚在發(fā)育早期階段;7月13日合子胚由發(fā)育早期向發(fā)育中期階段(b—d階段);7月28日合子胚由發(fā)育中期向發(fā)育后期階段(e—h階段);8月3日合子胚已完全發(fā)育至后期階段(g—i階段)。

2.2 濕地松誘導(dǎo)的愈傷組織形態(tài)分類

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)愈傷組織表面形態(tài)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)將雌配子體誘導(dǎo)的愈傷組織劃分為6種類型(圖2)。其中,細(xì)胞形態(tài)為胚性胚柄細(xì)胞團(tuán)結(jié)構(gòu)的愈傷組織在后期產(chǎn)生體胚的概率較高,稱之為胚性愈傷組織(圖2a—2b);反之,稱之為非胚性愈傷組織(圖2c—2i),但圖2g、2h、2i無法進(jìn)行增殖培養(yǎng)。因此,本研究統(tǒng)計(jì)的出愈率指愈傷組織類型即圖2a、2b、2d、2e所占百分比之和。

a.白色、透明、黏性強(qiáng),細(xì)胞形態(tài)呈胚性胚柄團(tuán)狀white, hyaline, sticky cells with embryonic germinal stalk clusters;b.絲狀、白色、透明、黏性強(qiáng),細(xì)胞顯微形態(tài)呈胚性胚柄團(tuán)狀的早期原胚,即胚頭聚攏,胚柄細(xì)胞呈長形細(xì)胞狀filamentous, white, hyaline, strongly adhesive cells and the clusters performed embryonal suspensor mass in cell microscopic form: embryonal heads clustered, the suspensor cells in the form of elongated cells;c.a—b早期原胚顯微觀察microscopic observation-early proembryos of a-b.;d.白色、透明、黏性較強(qiáng),細(xì)胞顯微形態(tài)呈腎形或圓形white, transparent, sticky, with a reniform or rounded cell microscopic form;e.珠孔處1簇愈傷,質(zhì)地松、軟,黏性較強(qiáng),細(xì)胞形態(tài)呈腎形細(xì)胞female gametophyte with a cluster of callus at the bead hole ejection, soft, more viscous, with a kidney-shaped cell microscopic morphology;f.d—e腎形細(xì)胞顯微觀察microscopic observation-renal cells of d-e.;g.米黃色、黏性,附著在雌配子體表面的極少數(shù)愈傷組織female gametophyte cells are beige in colour and surrounded by a sticky substance;h—i.褐化,疙瘩狀,無愈傷組織產(chǎn)生female gametophyte browned, lumpy, no healing tissue produced。 圖2 濕地松雌配子體誘導(dǎo)的愈傷組織類型Fig. 2 The types of induced callus in P. elliottii

2.3 球果采集時(shí)間、家系和冷藏處理時(shí)間對(duì)濕地松胚性愈傷誘導(dǎo)的影響

研究發(fā)現(xiàn),在7個(gè)采收期中,6月28日、7月4日和7月13日球果的出愈率較高(表1),對(duì)比發(fā)育階段發(fā)現(xiàn),此時(shí)合子胚處在發(fā)育早期階段或由發(fā)育早期向發(fā)育中期過渡階段(圖1),此時(shí)間段之前或之后的出愈率較低,此時(shí)間段之前未檢測(cè)出合子胚形態(tài),此時(shí)間段之后合子胚發(fā)育至中、后期階段。因此,筆者認(rèn)為濕地松合子胚在發(fā)育早期階段對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)是有利的,在福建官莊林場(chǎng)采集未成熟濕地松球果進(jìn)行體胚誘導(dǎo)時(shí)間為6月底至7月中上旬最佳。本研究中8個(gè)家系的出愈率均較高,其中,23號(hào)家系的出愈率最優(yōu)(85.8%),其次是25號(hào)(82.4%)、34號(hào)(81.2%)、9號(hào)(80.6%)、11號(hào)(80.5%)。雖然這幾個(gè)家系均未獲得胚性胚柄細(xì)胞團(tuán)結(jié)構(gòu)的愈傷組織,但這些家系對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的響應(yīng)均較高,在合適的誘導(dǎo)條件下產(chǎn)生胚性愈傷組織的可能性會(huì)更高。濕地松球果冷藏5 d,其出愈率最高(80.6%),球果冷藏時(shí)間在15天內(nèi)濕地松出愈率都較高,冷藏60 d的出愈率也能達(dá)到68.7%,但Ⅲ型、Ⅳ型愈傷組織能否轉(zhuǎn)化成胚性胚柄細(xì)胞團(tuán)以及其轉(zhuǎn)化率多高還有待進(jìn)一步觀察(表1)。

表1 采集時(shí)間、家系和冷藏時(shí)間對(duì)濕地松愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

2.4 不同添加物對(duì)濕地松胚性愈傷誘導(dǎo)的影響

在添加的所有種類糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,30 g/L麥芽糖的出愈率最高(78.6%),其次是添加15 g/L麥芽糖,并且出愈率大小依次為麥芽糖>蔗糖>葡萄糖,可見麥芽糖對(duì)濕地松胚性愈傷組織的誘導(dǎo)是有利的,而添加葡萄糖的誘導(dǎo)培養(yǎng)基出愈率最差(表2)。

表2 添加物對(duì)濕地松愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

表2(續(xù))

出愈率最高的是500 mg/L肌醇的處理,質(zhì)量濃度1 000 mg/L肌醇是唯一誘導(dǎo)出胚性胚柄結(jié)構(gòu)愈傷組織的處理,當(dāng)肌醇質(zhì)量濃度高于1 000 mg/L時(shí),出愈率降低(表2)。說明1 000 mg/L肌醇對(duì)濕地松未成熟合子胚胚性愈傷組織的誘導(dǎo)最合適,過高則會(huì)抑制其愈傷的誘導(dǎo)。在抗壞血酸質(zhì)量濃度為0、1、2、3 mg/L時(shí),對(duì)濕地松胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響區(qū)別不大(表2)。本研究中,α-酮戊二酸和丙酮酸單獨(dú)添加對(duì)愈傷誘導(dǎo)的促進(jìn)作用較小,而當(dāng)兩者同時(shí)添加時(shí)明顯促進(jìn)了濕地松愈傷組織的誘導(dǎo)。α-酮戊二酸和丙酮酸同時(shí)添加時(shí),濕地松雌配子體的出愈率為85.8%,單獨(dú)添加α-酮戊二酸或丙酮酸時(shí)出愈率分別為75.9%、76.3%,均高于對(duì)照處理(表2)。

2.5 不同激素組合對(duì)濕地松胚性愈傷誘導(dǎo)的影響

以不同濃度2,4-D、6-BA、KT的125個(gè)組合中,結(jié)果顯示有14個(gè)對(duì)濕地松愈傷組織誘導(dǎo)產(chǎn)生反應(yīng)的培養(yǎng)基(表3),其中,Ⅰ-128出愈率最高,達(dá)到90.4%,且有早期原胚Ⅰ型愈傷1.8%;另一個(gè)產(chǎn)生早期原胚的Ⅱ型愈傷的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為Ⅰ-26,其出愈率為78.9%,雖然比其余組合的出愈率低,但是其獲得早期原胚型愈傷組織的誘導(dǎo)率最高(2.9%)。另外,111個(gè)對(duì)濕地松愈傷組織誘導(dǎo)未產(chǎn)生反應(yīng)的組合不列入表格分析。因此,筆者認(rèn)為濕地松早期原胚愈傷誘導(dǎo)的較優(yōu)組合為LP+2 mg/L 2,4-D+2 mg/L 6-BA+2.5 mg/L KT。

表3 激素配比對(duì)濕地松愈傷組織誘導(dǎo)的影響

3 討 論

從體細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝杂鷤M織是一個(gè)復(fù)雜的過程,受多種因素的影響。本研究對(duì)誘導(dǎo)濕地松愈傷組織的影響因素進(jìn)行了較為全面的探索,涉及影響因素比已有研究更為多樣,以抗病濕地松未成熟合子胚為外植體,從外植體采集、保存、基因型、培養(yǎng)基及添加物等胚性愈傷組織誘導(dǎo)的主要影響因素進(jìn)行全過程的研究,取得了一定的成果,確定了在福建官莊林場(chǎng)采集未成熟濕地松球果進(jìn)行體胚誘導(dǎo)最佳時(shí)間為6月底至7月中上旬即濕地松合子胚發(fā)育至2—4階段時(shí),最利于胚性愈傷組織的誘導(dǎo)。這與胡繼文等[14]、張彩云等[15]對(duì)濕地松胚性愈傷組織的誘導(dǎo)以及吳靜等[18]對(duì)抗松材線蟲病赤松胚性愈傷組織的誘導(dǎo)研究結(jié)果一致。針葉樹體胚發(fā)生能力與基因型有很大關(guān)系[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)較易獲得愈傷組織的5個(gè)基因型為23號(hào)、25號(hào)、34號(hào)、9號(hào)和11號(hào)家系,孫婷玉等[21]在黑松的研究中也發(fā)現(xiàn)將基因型是胚性愈傷組織誘導(dǎo)的關(guān)鍵因素。本研究發(fā)現(xiàn)將濕地松球果冷藏5 d時(shí)其出愈率最高。唐巍等[12]將濕地松球果在4 ℃冰箱中放置1個(gè)月后進(jìn)行誘導(dǎo),胚性愈傷誘導(dǎo)率達(dá)25.12%;吳麗君[7]發(fā)現(xiàn)濕地松球果冷藏5～10 d胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高,冷藏時(shí)間延長至20 d以上,愈傷組織誘導(dǎo)率呈下降趨勢(shì)。誘導(dǎo)的胚性愈傷組織材料必須預(yù)先低溫(4～8 ℃)儲(chǔ)藏,沒有低溫處理不能啟動(dòng)[22-23],與本研究結(jié)果一致。短時(shí)間冷藏對(duì)提高體胚誘導(dǎo)率有一定的促進(jìn)作用,這可能由于冷藏運(yùn)輸?shù)牡蜏貤l件抑制了合子胚的繼續(xù)發(fā)育,也可能由于郵寄的球果在途中受到的刺激,導(dǎo)致活性不如冷藏運(yùn)輸?shù)母?。本研究發(fā)現(xiàn)添加30 g/L的麥芽糖對(duì)濕地松胚性愈傷組織的誘導(dǎo)是有利的。吳麗君[7]在濕地松胚性愈傷誘導(dǎo)時(shí)添加15 g/L的麥芽糖,Pullman等[16]誘導(dǎo)火炬松胚性愈傷組織也添加了15 g/L的麥芽糖,而在馬尾松和云南松的胚性愈傷組織的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中均添加30 g/L蔗糖[24-25],這說明不同的松樹對(duì)糖類的需求存在差異。α-酮戊二酸和丙酮酸同時(shí)添加明顯促進(jìn)了濕地松愈傷組織的誘導(dǎo)。肌醇以1 000 mg/L最合適,過高則會(huì)抑制濕地松愈傷組織的誘導(dǎo)?？箟难豳|(zhì)量濃度為0、1、2、3 mg/L時(shí),對(duì)濕地松胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響區(qū)別不大。

本研究對(duì)影響濕地松胚性愈傷組織誘導(dǎo)的因素進(jìn)行了全面的研究,篩選出1種較優(yōu)的濕地松胚性愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基,即LP+2 mg/L 2,4-D+2 mg/L 6-BA+2.5 mg/L KT,確定了適合濕地松胚性愈傷組織誘導(dǎo)的主要條件,可為提高濕地松胚性愈傷組織誘導(dǎo)率,促進(jìn)濕地松體胚發(fā)生的研究提供依據(jù)。