李 靖,李姝漪,付俊璇,張起輝*

1重慶興泰濠制藥有限公司,重慶 400000;2中南大學材料科學與工程學院,長沙 410083;3重慶大學化學化工學院,重慶 400000

蛇足石杉(Huperziaserrata(Thunb.ex Murray)Trev)為石杉科石杉屬蕨類植物,是一種治療跌打損傷、解毒、止痛以及治療精神分裂癥的珍稀中草藥[1]。蛇足石杉也是目前研究較好的用于治療阿爾茨海默病的藥物,其有效成分石杉堿甲是一種治療重癥肌無力和阿爾茨海默病的高效、低毒性、可逆和高選擇性的乙酰膽堿酯酶(AChE)抑制劑,它可以增強乙酰膽堿的作用,而乙酰膽堿是一種與注意力、警惕性、專注力和記憶力有關的中樞神經遞質[2,3]。在1982年,石杉堿甲成功從蛇足石杉中分離出來,被當做“希望之星”。據(jù)調查,到2025年,發(fā)達國家65歲以上的阿爾茨海默病患者將達到710萬人,比2018年的550萬患者增加近29%,除非有醫(yī)學上的突破,否則到2050年,該病患者數(shù)量可能從550萬增加到1 380萬[4],而僅在美國,大約每10萬人中就有14～20人患有重癥肌無力,患者總人數(shù)約為36 000～60 000人,這也是一個十分驚人的數(shù)字[5]。對于阿爾茨海默病和重癥肌無力,目前市面上藥物的最大問題是藥物毒性以及耐藥性。與目前的藥物相比,石杉堿甲是天然植物提取物,安全性好、不良反應少、可被人體快速吸收,并且抑制方式為競爭性和非競爭性的混合型抑制,治療效果顯著,有效時間長[6]。

蛇足石杉在世界各地均有分布,但其資源十分有限,其中一個限制因素是蛇足石杉生長緩慢,從孢子到成熟至少需要15年時間。且在成熟階段蛇足石杉的高度也僅有10～30 cm。同時,其生長環(huán)境難以復刻[7],在實際栽培過程中難以推廣。因此,在不久的將來,蛇足石杉將面臨滅絕的威脅。近年來,對這種珍稀植物開展了多項研究,例如對外植體和愈傷組織的體外培養(yǎng)。Kan′ichiro Ishiuchi的團隊先后從H.pinifolia的莖尖中獲得外植體,并在滅菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)2個周期(每個周期為7 d),最后成功地將外植體轉入愈傷組織生長培養(yǎng)基中[8],此外,研究人員對蛇足石杉培養(yǎng)方法進行了各種改進,例如培養(yǎng)基成分篩選以及莖尖培養(yǎng)技術的研究,但組培過程中外植體的消殺問題仍未得到有效的解決,限制了石杉堿甲的大規(guī)?；a[9,10]。由于蛇足石杉的自然資源匱乏以及以上所提及的原因,急需找到一種以較低成本就可提高石杉堿甲含量的新方法。

內生真菌是一類生活在植物莖和葉組織內的真菌,已有研究發(fā)現(xiàn),如果內生真菌與植株長時間共生進化,它們就可以通過基因重組獲得宿主植物的某些基因,產生與宿主植物相同的次生代謝物[11-13]。同時,內生真菌還可以產生激素促進寄主植物的生長發(fā)育。因此,在共培養(yǎng)體系中,內生真菌被認為是激發(fā)子[13],這意味著植物細胞可以在一定濃度范圍內與內生真菌共培養(yǎng),在共培養(yǎng)體系中內生真菌和植物細胞相互影響,促進植物積累產物。麥角甾醇是真菌細胞膜的重要組成成分,屬于真菌類的特征甾醇,可作為衡量真菌生物量的代表性指標[14]。

本研究引入了一種新型的共培養(yǎng)體系(co-culture system,CCS),以一種經濟、便捷的方式提高蛇足石杉中石杉堿甲的含量,以改善蛇足石杉因為資源短缺而無法廣泛應用的現(xiàn)狀。

1 材料與方法

1.1 材料

植株取自湖北省神農架多年生的野生蛇足石杉植株,經重慶大學藥學院張傳瑞研究員鑒定為石杉科石杉屬蕨類植物蛇足石杉(Huperziaserrata(Thunb.ex Murray)Trev),樣品(202005006)存于重慶大學植物園室外設施網室內;腐殖土取自重慶市四面山森林公園。

1.2 儀器與試劑

Agilent 1100高效液相色譜儀(Agilent有限公司);BDS200型倒置生物顯微鏡(重慶奧特光學儀器有限公司);RE-52型旋轉蒸發(fā)器(上海雅榮生化儀器廠)。

MS培養(yǎng)基(批號:20200406,純度:BR,杭州百思生物技術有限公司);激動素(KT)(批號:I2020156,純度≥99%,金坦生物技術分公司);2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)(批號:I1846732,純度97%,金坦生物技術分公司);青霉素(批號:B184012,純度98%,北京華邁科生物技術有限公司);鏈霉素(批號:B160603,純度90%,北京華邁科生物技術有限公司);兩性霉素B(批號:B200208,純度≥90.0%,北京華邁科生物技術有限公司);特美汀(批號:B173024,純度≥99%,北京華邁科生物技術有限公司);中性紅(批號:20200123,規(guī)格:指示劑,天津博迪化工股份有限公司);石杉堿甲(批號:100243-202003,純度≥98%,四川維克奇生物科技有限公司);麥角甾醇(批號:111845-202004,純度≥98%,四川維克奇生物科技有限公司);甲醇(批號:2020031702,純度:色譜純,天津盾特特種化工有限公司);乙酸銨(批號:2020041323,純度:色譜純,成都科隆化工有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 蛇足石杉的馴化

為了獲得蛇足石杉最佳培養(yǎng)條件,參考Huang等[15]對蛇足石杉適宜生長環(huán)境研究結果,對其馴化條件進行考察。將野生蛇足石杉樣本種植于重慶大學室外設施網室內,以蛇足石杉植株的存活率為指標,對馴化時腐殖土與河沙比例、空氣濕度、光照強度進行單因素考察,每次試驗供試植株為10株,重復3次。植株存活率計算方法為:植株存活率=植株存活數(shù)量/供試植株總數(shù)×100%。

蛇足石杉在設定的條件下開始發(fā)芽(見圖1A),即蛇足石杉成功馴化。

圖1 萌發(fā)的蛇足石杉植株( A ),植株表皮細胞( B )和海綿細胞( C )Fig.1 Germinate Huperzia serrata (A),botanical epidermal cells (B) and spongy cells (C)

1.3.2 組織培養(yǎng)基的制備

以真菌生長情況和葉肉細胞存活率為指標,對培養(yǎng)基制備過程中基礎培養(yǎng)基種類(1/2 MS,MS和B5)進行研究[16,17];以叢生芽萌發(fā)率和莖段數(shù)量為指標考察蔗糖濃度(1%、2%、3%、4%)[17];以愈傷組織誘導率和愈傷組織增殖率為指標考察最佳植物激素2,4-D濃度(0、2、5、7 mg/L)[18]?？刂婆囵B(yǎng)基pH為5.8,采用青霉素(30.0 mg/L)、鏈霉素(50.0 mg/L)、兩性霉素B(0.5 mg/L)、特美汀(5.0 mg/L)等抗生素控制培養(yǎng)基中其他微生物的無限增殖,通過分析未植入外植體的滅菌空白培養(yǎng)基的真菌生長情況判斷培養(yǎng)基制備過程滅菌是否徹底。愈傷組織誘導率和增殖率的計算方式為:愈傷組織誘導率=誘導出愈傷組織的胚胎數(shù)/接種的胚胎數(shù)×100%;愈傷組織增殖率=(收獲的愈傷組織重量-接種的愈傷組織重量)/接種的愈傷組織重量×100%。

1.3.3 外植體的體外殺菌和繁殖

據(jù)報道,蛇足石杉葉片中石杉堿甲的產量最高,因此體外培養(yǎng)的靶細胞為葉肉細胞[16]。將健康葉片用普通肥皂洗凈,分別用70%酒精浸泡50 s,0.5 mg/L孔雀石綠浸泡8 min,3%H2O2浸泡10 min,再用無菌水洗滌3次。將滅菌后的外植體在含有5～10 mL液體滅菌介質的研缽中機械粉碎。1～3 min后,將葉肉細胞懸液轉入容量瓶中稀釋,然后轉入培養(yǎng)基中,在室溫(24 ℃),光照強度(100 Lux左右),濕度(95%)下培養(yǎng)[19]。

1.3.4 單細胞計數(shù)

每2 d測定一次葉肉細胞數(shù)。樣品以4∶1的比例懸浮于含0.04%中性紅的沉積物中,孵育20 min后,用血細胞計計數(shù)染色活細胞。

在顯微鏡下,可以清晰地觀察到懸浮液中的表皮細胞和海綿狀細胞(見圖1B、1C)。海綿狀細胞中的石杉堿甲的濃度最高,其成像長約23～38 μm,寬約15～23 μm[20]。

1.3.5 提取

取5 mL培養(yǎng)基懸液,通過3次凍融提取,2次超聲提取(單次40 min,每次間隔10 min)提取石杉堿甲和麥角甾醇[21]。將懸液減壓蒸餾濃縮,提取液用甲醇溶解。將溶液轉移到10 mL容量瓶中定容。在HPLC分析前溶液用0.22 μm濾膜過濾。

每天測定一次石杉堿甲和麥角甾醇的濃度和混合比例。

1.3.6 色譜條件

采用高效液相色譜儀和紫外檢測器對提取物進行色譜分析。色譜柱:Agilent TC-C18(150 mm×4.6 mm,5 μm),進樣量10 μL,流速1.0 mL/min,柱溫25 ℃。石杉堿甲和麥角甾醇的檢測波長分別為310 nm和282 nm。流動相由水和甲醇(含0.008 mol/L乙酸銨)組成,比例為75∶25[22,23]。

1.3.7 方法驗證

以5～45 μg/mL石杉堿甲和麥角甾醇標準溶液繪制標準曲線。采用相關系數(shù)法(r)測定標準曲線的線性度。

精密度試驗:在相同條件下,將標準溶液(10 μg/mL)進樣5次,測定方法精密度。重復性試驗:樣品在相同條件下操作5 次,測試方法重復性。穩(wěn)定性實驗:樣品分別于1、2、4、8、12 h測定,測試方法穩(wěn)定性[24]。以上三種試驗結果均以峰面積的相對標準偏差(RSD,%)表示。取已測定石杉堿甲和麥角甾醇含量的樣品(1 mL)加入石杉堿甲(0.5 mL,10 μg/mL)和麥角甾醇(1 mL,15 μg/mL)在“1.3.6”的色譜條件下進行加標回收試驗,重復5次,計算回收率,并根據(jù)回收率進行評價:回收率=(加標試樣測定值-樣品測定值)/加標量×100%。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

2 結果與分析

2.1 馴化條件考察

為了研究共培養(yǎng)體系最佳培養(yǎng)條件,對蛇足石杉馴化條件進行了單因素考察,并選取各因素考察試驗中存活率較高的三組進行顯著性差異分析。如圖2A所示,土壤由腐殖土和河沙組成,在不同土壤配比下植株存活率存在顯著差異,土壤配比為2∶1時植株存活率最高,并且2∶1與1∶1之間的P值小于0.01,2∶1與4∶1之間的P值小于0.05,故選取2∶1作為最佳土壤配比。在最佳光照強度研究中,不同光照強度下植物存活率存在著顯著差異,見圖2B,100 Lux與300 Lux之間的P值小于0.01,100 Lux與80 Lux的P值小于0.05,最佳光照強度為100 Lux。由圖2C可知,空氣濕度對植物存活率也存在著顯著影響,95%與85%和95%與100%之間的P值均小于0.01,最佳空氣濕度為95%。

圖2 馴化條件對植株存活率的影響Fig.2 Effect of domestication conditions on plant survival rate 注:*P < 0.05;**P < 0.01。

2.2 不同培養(yǎng)基條件研究

由表1結果所示,空白對照組在相同培育條件下未見真菌污染物,表明培養(yǎng)基制備過程中滅菌徹底,只有使用MS培養(yǎng)基時,葉肉細胞存活率為12.5%,并且伴隨著內生真菌的生長,說明基礎培養(yǎng)基的種類對蛇足石杉內生真菌的生長和細胞培養(yǎng)體系有顯著影響;改變培養(yǎng)體系蔗糖濃度,叢生芽萌發(fā)率和莖段數(shù)量發(fā)生明顯變化,在蔗糖濃度為(2%)20.0 g/L時,叢生芽萌發(fā)率和莖段數(shù)量最高;添加植物激素有利于蛇足石杉愈傷組織的誘導,在5.0 mg/L時誘導率最佳,但植物激素對愈傷組織增殖有著不利影響,隨著植物激素濃度增加增殖率不斷減小,綜合選擇5.0 mg/L 2,4-D作為最適濃度。因此,最佳培養(yǎng)基條件為MS液體培養(yǎng)基,蔗糖(20.0 g/L)、2,4-D(5.0 mg/L)和KT(1.0 mg/L)。

表1 培養(yǎng)條件對比結果

2.3 共培養(yǎng)體系指標性成分含量測定

我們采用機械破碎法制得蛇足石杉的葉肉細胞懸液。在CCS過程中,內生真菌的增殖被控制在一定的范圍內,以維持葉肉細胞和內生真菌之間的平衡,而其他類型的微生物則受到抗生素的有效抑制。通過HPLC檢測培養(yǎng)體系內石杉堿甲和麥角甾醇含量,探究內生真菌生長對石杉堿甲富集的影響。石杉堿甲是蛇足石杉的主要活性成分,反映了葉肉細胞的數(shù)量。而麥角甾醇是真菌細胞膜的重要組成部分,是衡量生物量的代表性指標[25]。

按照上述原則,對提取物進行色譜分析。石杉堿甲和麥角甾醇的代表性色譜圖見圖3。A和B圖分別顯示了石杉堿甲和麥角甾醇在培養(yǎng)基中的相應色譜峰和結構,在相同色譜條件下,標準品2個峰的基線分離時間分別為9.31 min和10.95 min。通過提取物與對照品進行對比,證明提取物中存在石杉堿甲和麥角甾醇。

圖3 標準品與樣品HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of standards and samples

圖4A顯示石杉堿甲和麥角甾醇濃度隨時間的變化規(guī)律。由圖分析可知,在6 d時石杉堿甲上升至最高水平,麥角甾醇下降到最低水平,在12 d時,麥角甾醇濃度達到峰值。這兩種特征化合物的峰值濃度不是同步的,石杉堿甲比麥角甾醇更早達到峰值濃度,說明當石杉堿甲與麥角甾醇的濃度比在2.2～1.5之間時,內生真菌的生長對石杉堿甲富集具有促進作用。

圖4 分析指標隨時間的變化Fig.4 The change of analysis indicators with time注:*P < 0.05;**P < 0.01。

圖4B展示了蛇足石杉細胞數(shù)量隨培養(yǎng)周期的變化規(guī)律,植物細胞在4 d內生長穩(wěn)定,在第4 d時每體積細胞計數(shù)中活細胞數(shù)為8個,達到最大值,隨后細胞數(shù)量開始下降,通過對第4 d與第2 d以及第6 d之間的顯著性差異分析,發(fā)現(xiàn)4 d時的活細胞數(shù)量顯著高于2 d和6 d時的數(shù)量,因此初步確定第4 d為采收和繼代的最佳時間點。

為進一步驗證采收和繼代的最佳時間,采用HPLC法測定石杉堿甲在1～6 d的含量,每天取樣1次。由圖4C可知,在蛇足石杉植物細胞與內生真菌的共培養(yǎng)體系中,石杉堿甲含量在1～4 d內逐漸增加,達到最大值13.68 μg/mL,4 d后石杉堿甲含量呈現(xiàn)降低趨勢,表明第4 d是石杉堿甲含量變化的拐點。通過拐點與相鄰兩天含量之間的顯著性差異分析,第4 d與第5 d的P值小于0.05,第4 d與第3 d的P值小于0.01,說明4 d時石杉堿甲含量顯著高于相鄰兩天時的含量,因此認為第4 d是石杉堿甲采收和繼代的最佳時間。經過4 d共培養(yǎng)之后石杉堿甲含量較1 d 時的9.16 μg/mL增長了49.34%。

2.4 檢測方法學研究

方法學研究結果如表2所示,經計算,石杉堿甲和麥角甾醇濃度分析精密度RSD分別為0.81%和1.07%,重復性分別為1.36%和2.7%。說明方法精密度和重復性良好,穩(wěn)定性RSD分別為1.33%和2.45%,說明方法穩(wěn)定,兩種分析物的回收率分別為101.81%和100.01%,并且RSD小于5%,說明測試方法結果準確。

表2 方法線性度

3 討論與結論

石杉堿甲是一種用于治療老年癡呆和重癥肌無力的AChE抑制劑,其主要來源是蛇足石杉,但石杉堿甲在蛇足石杉中含量較低,并且蛇足石杉資源有限,限制了石杉堿甲在醫(yī)藥領域的進一步發(fā)展[3]。有研究表明,在植物體內存在著多種內生真菌,它們在長期的進化過程中與宿主植物形成了一種復雜的互利共生關系,一方面,內生真菌需要從植物中吸取營養(yǎng),以滿足自身生存[26]。另一方面,內生真菌為了抵抗宿主的防御系統(tǒng),與宿主植物產生了特殊的生物化學交流,可通過識別宿主的化學信號或者雇用宿主酶系來合成與宿主相似的次級代謝產物[27]。如Jiang等[28]在半紅樹植物黃槿中通過分離純化內生真菌,固體發(fā)酵得到了與宿主相同的次生代謝產物。Tong等[29]通過對蛇足石杉內生真菌FS4次級代謝產物的分離研究,發(fā)現(xiàn)其5種代謝產物表現(xiàn)出與石杉堿甲相似的強抑制乙酰膽堿酯酶生物活性。

本研究中對野生蛇足石杉的馴化條件和組織培養(yǎng)基條件進行了試驗,確定了最佳培養(yǎng)條件為光照強度100 Lux,濕度95%,MS液體培養(yǎng)基,蔗糖20.0 g/L,2,4-D 5.0 mg/L和KT 1.0 mg/L,并以石杉堿甲和麥角甾醇這兩種化合物的相對變化趨勢來反映CCS的動態(tài)生長過程,由其拐點確定第4 d為采收和繼代的最佳時間。通過CCS培養(yǎng)4 d之后,石杉堿甲的含量提升了49.34%,達到最大值,培養(yǎng)體系內石杉堿甲含量總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,這是由于在生長后期內生真菌的繁殖能力比植物細胞分化能力更強,搶奪了培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分和生長空間,導致細胞數(shù)量減少,所以采收和繼代時間的選擇是共培養(yǎng)體系實現(xiàn)石杉堿甲增量富集的關鍵,同時植物激素2,4-D濃度對體系有著較大的影響,2,4-D對植物器官的脫分化、愈傷組織的誘導具有促進作用,但濃度過高時對細胞的分化有抑制作用,所以在培養(yǎng)體系中,采用5 mg/L作為最適濃度[30]。本實驗成功采用共培養(yǎng)體系實現(xiàn)石杉堿甲的生物合成,此方法克服了傳統(tǒng)的固定觀念,因為植物體細胞培養(yǎng)不需要事先徹底滅菌,植物體細胞與內生真菌可以實現(xiàn)共培養(yǎng),并且在特定比例下可以促進石杉堿甲的生成。只要準確掌握培養(yǎng)周期規(guī)律,就可以利用這種方便快捷的方法積累石杉堿甲,對保護植物資源和豐富石杉堿甲重要的生物活性物質具有重要意義。