張 哲,王 蓓,唐根云,饒利兵,林 玲*

1廣州醫(yī)科大學研究生院,廣州 510000;2三亞中心醫(yī)院(海南省第三人民醫(yī)院),三亞 572000;3湖南醫(yī)藥學院,懷化 418000

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是一種以大、中動脈血管內(nèi)膜形成粥樣斑塊或纖維斑塊為特征的常見慢性心血管疾病[1]。動脈內(nèi)膜中的脂質(zhì)滲入現(xiàn)已成為AS的主要發(fā)病機制[2]。聚集在內(nèi)膜與中膜的巨噬細胞通過細胞膜上的清道夫受體吞噬大量的低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)后形成泡沫細胞,驅(qū)動細胞釋放大量的促炎因子、基質(zhì)金屬蛋白酶于細胞間隙,促使動脈管壁中的斑塊蓄積增加,進而轉(zhuǎn)為不穩(wěn)定斑塊,最終進展為心肌梗死[2]。然而有效延緩AS的進展一直是困擾學術界的難題之一。近年來備受歡迎的新興藥食同源之品海巴戟被證明其有良好地調(diào)節(jié)血脂,改善AS的作用[3]。

海巴戟(Morindacitrifolia),又稱諾麗(Noni)為茜草科巴戟天屬植物,具有抗炎、抗氧化、降脂等藥理作用[4]。根據(jù)中醫(yī)理論,海巴戟藥味酸、甘,藥性平和,有補益腎精、平補陰陽及延緩衰老之功效,可有效預防心腦血管疾病[5]。然而,海巴戟治療AS的具體機制尚不清楚。鑒于海巴戟的化學成分復雜,其主要由蒽醌類、黃酮類、苯丙素類、酚酸類等成分組成[7],符合傳統(tǒng)中藥的多成分、多靶點的特點,因此使用網(wǎng)絡藥理學可較清楚地闡述海巴戟發(fā)揮藥理作用的分子機制。近年來網(wǎng)絡藥理學是一門以計算機科學、生物信息學及數(shù)據(jù)挖掘為一體的新興學科,它通過構(gòu)建“藥物-有效成分-疾病靶點-疾病”網(wǎng)絡,并對該網(wǎng)絡進行生物學功能解釋,使人們更加清楚地認識到藥物治療疾病的機制機理[6]。本研究基于海巴戟有效成分多樣,作用靶點豐富的特點,擬采用網(wǎng)絡藥理學方法,對海巴戟治療AS的靶點、生物學過程、信號通路預測和分析,同時采用體外實驗進行驗證,以期為治療AS的藥物開發(fā)和治療提供藥理學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑

THP-1細胞(貨號:CL-0233,武漢普諾賽生命科技有限公司);海巴戟萃取粉(貨號:0003S,海南西沙諾麗生物科技有限公司);胎牛血清(貨號:10270-106,美國Gibco公司);RPMI1640培養(yǎng)基(貨號:C11875500BT,美國Gibco公司);佛波酯(PMA)(貨號:P1585,批號:SLCD3659,美國Sigma);油紅O染色試劑盒(貨號:01391,美國Sigma);人源性氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)(貨號:YB-002,廣州奕元生物科技有限公司);CCK-8試劑盒(貨號:GK10001;GlpBio公司);22-NBD-Cholesterol(貨號:GC46527,美國GlpBio公司);TRIzol(貨號:ER501-01-01,北京全式金生物技術股份有限公司);cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號:AT311-03,北京全式金生物技術股份有限公司);PPARγ、ABCA1引物(貨號:007P20220307,北京擎科生物科技有限公司);抗PPARγ抗體(貨號:ab178860,英國Abcam公司);抗ABCA1抗體(貨號:A-7228,武漢ABclonal公司);PPARγ抑制劑GW9662(貨號:A4300,美國APExBio公司)。

1.2 主要儀器

多功能酶標儀(美國BIOTeK公司);倒置相差顯微鏡(美國Olympus公司);倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司);低溫高速冷凍離心機(美國Thermo公司);電泳儀(美國Bio-Rad公司);轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司);化學熒光凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司);PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3 海巴戟有效成分靶點及疾病靶點收集

在CMAUP數(shù)據(jù)庫(https://www.bidd.group/CMAUP)中利用關鍵詞“Morindacitrifolia”檢索其有效成分[7]?；钚猿煞值暮Y選:在CMAUP數(shù)據(jù)庫的“Ingredient of the Plant”功能區(qū)中選擇實驗已驗證的有效成分,其他未經(jīng)驗證的成分以化合物名稱或者SMILES格式分別在TCMSP數(shù)據(jù)庫(https://tcmsp-e.com/tcmsp.php)和SwissADME數(shù)據(jù)庫(http://www.swissadme.ch/)中篩選。TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選標準為口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%,且類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18;SwissADME數(shù)據(jù)庫需滿足“藥代動力學”與“類藥性”兩個特征。通過文獻檢索又補充了部分活性成分[7]。

疾病靶點的獲取借助“GeneCards”(https://www.genecards.org/)、“OMIM”(https://omim.org/)、“TTD”(http://db.idrblab.net/)、“PharmGKB”(https://www.pharmgkb.org/)、“DrugBank”(https://go.drugbank.com/)五個數(shù)據(jù)庫,以“atherosclerosis”為關鍵詞在各數(shù)據(jù)庫中檢索,其中“GeneCards”中設置篩選條件,即“score”>1。刪除或合并各數(shù)據(jù)庫中檢索得到的重復基因。將獲取的海巴戟有效成分靶點與疾病靶點取交集,導入R語言4.2.1中,使用“venn”包作圖。

1.4 海巴戟治療AS疾病蛋白互作網(wǎng)絡(PPI)構(gòu)建及核心網(wǎng)絡篩選

將得到的交集基因?qū)隨TRING在線數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI,下載同時生成的“.tsv”格式文件導入Cytoscape 3.7.2計算各節(jié)點的自由度并對其可視化操作,然后利用軟件中“CytoNCA”插件[6]根據(jù)“介數(shù)”“接近中心性”“自由度”“特征向量”“基于局部平均連接度方法”“網(wǎng)絡中心性”6個拓撲學參數(shù)對各個節(jié)點評分,經(jīng)過篩選后得到靶點的核心網(wǎng)絡,篩選條件為核心基因均須大于6個拓撲參數(shù)的中位數(shù)分值。

1.5 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析

使用R語言4.2.1中“org.Hs.eg.db”“clusterProfiler”及“enrichplot”包計算交集基因的GO富集與KEGG富集條目,再使用“ggplot2包”分別作圖,其中GO富集中的細胞成分(cellular component,CC)、生物學過程(biological process,BP)和分子功能(molecular function,MF)顯示排名前10的條目;KEGG通路富集顯示排名前20的條目。

1.6 體外實驗驗證

1.6.1 分組與造模

先使用100 ng/mL PMA預處理THP-1細胞48 h,然后將THP-1源性巨噬細胞分為6組:正常對照組、模型組、海巴戟低濃度組、海巴戟中濃度組、海巴戟高濃度組、海巴戟高濃度組+PPARγ抑制劑GW9662組。除正常對照組外,其余各組均需與50 μg/mL ox-LDL共孵育48 h;而海巴戟低、中、高濃度組需加入各濃度的海巴戟萃取液(海巴戟萃取粉溶于RPMI1640培養(yǎng)基中配成海巴戟萃取液)并與ox-LDL共孵育48 h;海巴戟高濃度組+PPARγ抑制劑GW9662組在共孵育前2 h加入10 μmol/L GW9662預處理;正常對照組使用無血清RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。

1.6.2 CCK-8實驗

取對數(shù)生長期的THP-1細胞,利用細胞計數(shù)板計數(shù),調(diào)整細胞濃度每孔2×104個,使用100 μL含100 ng/mL PMA工作液將細胞接種于96孔板中,組別設置空白組和海巴戟8個不同濃度組(0、10、20、40、80、160、320、640 μg/mL),其中0濃度組為對照組,每組設置3個復孔。分別培養(yǎng)24 h、48 h后,檢測前每孔加入10 μL CCK-8試劑后繼續(xù)于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。然后使用多功能酶標儀檢測450 nm波長的吸光值(OD值),實驗重復3次。按公式(1)計算細胞存活率。

細胞存活率 =

(A實驗組-A空白組) / (A對照組-A空白組) × 100%

(1)

1.6.3 油紅O染色

取滅菌的細胞爬片分別放置于12孔板中,將對數(shù)生長期的細胞接種于各孔,每孔細胞的數(shù)量調(diào)整為3×105個,每組設置2個復孔。待PMA誘導48 h后,分別向各組中加入ox-LDL及不同濃度的海巴戟共孵育48 h,棄上清,PBS溶液洗3次。4%多聚甲醛固定30 min,PBS洗3次,向每孔中加入1 mL的油紅O工作液并于37℃烘箱避光孵育30 min,60%異丙醇分色10 s,PBS清洗3次,待自然晾干后滴加甘油封片,使用倒置熒光顯微鏡拍照保存。

1.6.4 22-NBD-Cholesterol細胞熒光

將處于對數(shù)生長期的各組細胞接種于96孔板中,每孔細胞數(shù)量調(diào)整為1×104個,每組設置5個復孔。待各組給藥處理完成后,棄去上清,每孔加入100 μL濃度為1 μg/mL 22-NBD-Cholesterol工作液共孵育24 h,PBS洗3次,避光條件下迅速于多功能酶標儀測量熒光值和倒置熒光顯微鏡下拍照保存。

1.6.5 RT-PCR檢測各組細胞中PPARγ、ABCA1 mRNA的表達

消化各組加藥處理后的細胞,收集于離心管中,離心后取上清,PBS清洗1次,各組加入0.5～1 mL的TRIzol冰上裂解3 min,分別加入氯仿、異丙醇、無水乙醇離心分離提取總RNA,使用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR反應中模板定量為1 μg,2×Fine Taq Mix 25 μL,上游引物、下游引物各1 μL,其中引物序列見表1。PCR反應經(jīng)歷94 ℃預變性、94 ℃變性、56 ℃退火、72 ℃延伸、72 ℃再延伸,得到擴增后產(chǎn)物。配置2%瓊脂糖凝膠,上樣后進行DNA電泳,于凝膠成像顯影儀拍照,計算mRNA的相對表達量。

表1 引物序列

1.6.6 Western blot檢測各組細胞中PPARγ、ABCA1蛋白的表達

向各組加藥處理后的60 mm細胞培養(yǎng)皿中加入裂解液100 μL并在冰上裂解30 min,收集細胞懸液后離心,取上清用BCA法檢測各組蛋白的濃度后調(diào)整各組蛋白濃度一致,加入上樣緩沖液后100 ℃煮沸10 min配制成樣品。配置8%、10%的SDS-PAGE凝膠,電泳,轉(zhuǎn)膜,5%脫脂牛奶封閉1.5 h,一抗孵育過夜(抗PPARγ抗體:1∶1 000;抗ABCA1抗體:1∶1 000),次日TBS-T洗膜3次,二抗孵育1 h,均勻滴加高敏化學發(fā)光液后顯影,利用Image J軟件分析目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值,計算目的條帶/內(nèi)參蛋白的比值。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 海巴戟有效成分靶點及疾病靶點

在CAMUP數(shù)據(jù)庫中得到實驗驗證的有效成分有17個及73個疾病靶點,TCMSP數(shù)據(jù)庫、SwissADME數(shù)據(jù)庫及檢索文獻去重后共獲得有效成分42個,相關疾病靶點259個。因此海巴戟中共檢索到59個有效成分(見表2),332個相關疾病靶點。分別從“GeneCards”“OMIM”“TTD”“PharmGKB”“DrugBank”數(shù)據(jù)庫中檢索到AS相關靶點為1 428個、2個、35個、4個和45個,去重后得到的靶點1 461個靶點。與海巴戟有效成分靶點的交集靶點為154個(見圖1)。使用Cytoscape軟件繪制海巴戟有效成分與交集靶點網(wǎng)絡圖,根據(jù)各節(jié)點的“degree”設置節(jié)點的顏色,“degree”越高顏色越趨于藍色(見圖2)。

圖1 有效成分與疾病交集靶點Fig.1 Intersection targets of active ingredients and disease

圖2 海巴戟有效成分與交集靶點網(wǎng)絡圖Fig.2 Network diagram of active ingredients of M.citrifolia and intersection targets

表2 海巴戟的有效成分

2.2 PPI構(gòu)建及核心網(wǎng)絡構(gòu)建

將交集靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫中在線生成PPI圖,在Cytoscape軟件中對其可視化,交集靶點鄰接節(jié)點個數(shù)越多,顏色愈趨于藍色(見圖3)。使用軟件的插件“CytoNCA”對PPI網(wǎng)絡的核心網(wǎng)絡進行篩選,納入同時大于各項拓撲參數(shù)中位數(shù)分值的靶點進行下一級分析,共完成兩級核心網(wǎng)絡創(chuàng)建,最后得到的核心網(wǎng)絡中包含核心節(jié)點為28個,716條邊(見表3)。篩選得到的核心靶點相鄰節(jié)點越多,圓形面積越大且顏色越藍(見圖4)。值得注意的是,核心網(wǎng)絡中含有大量與脂代謝及炎癥相關的基因,如PPARG、MMP9、IL-6、CCL2等,這些均是促進AS發(fā)生發(fā)展的直接關聯(lián)基因。

圖3 海巴戟治療AS的蛋白互作網(wǎng)絡(PPI)Fig.3 PPI network of M.citrifolia in the treatment of AS

圖4 核心網(wǎng)絡拓撲圖Fig.4 Network topograph for the core network

表3 核心網(wǎng)絡節(jié)點拓撲參數(shù)

2.3 GO富集分析與KEGG富集分析

GO功能富集分析得到2 844個條目,KEGG通路富集分析得到182個條目。以P<0.05為條目的篩選條件,富集得到GO的功能主要包括細胞膜受體、核受體等生物學功能(見圖5A)。KEGG富集通路主要包括脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、PPAR信號通路等,這些生物學過程均與海巴戟調(diào)節(jié)脂質(zhì)異常密切相關,其中過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome transcriptional proliferator-activated receptors,PPAR)信號通路可能在其中發(fā)揮著重要作用(見圖5B)。

圖5 海巴戟調(diào)節(jié)AS靶點的GO分析(A)和KEGG富集分析(B)Fig.5 GO function enrichment analysis (A) and KEGG pathway analysis (B) for AS by M.citrifolia

2.4 體外實驗

2.4.1 不同濃度的海巴戟對THP-1源性巨噬細胞活性的影響

CCK-8結(jié)果顯示,不同濃度(0～640 μg/mL)的海巴戟在24 h及48 h對細胞活性的影響,在濃度為320、640 μg/mL時,相比于對照組,海巴戟對THP-1源性巨噬細胞的毒性作用顯著增加(P<0.05)(見圖6)。海巴戟濃度在0～160 μg/mL對細胞毒性的作用較小,因此本研究分別選擇10、20、40 μg/mL作為海巴戟低、中、高濃度組。

圖6 不同濃度的海巴戟對THP-1源性巨噬細胞活性的影響Fig.6 Effect of different concentrations of M.citrifolia on the activity of THP-1-derived macrophages注:在24 h組中,與對照組比較,##P<0.01;在48 h組中,與對照組比較,**P<0.01。Note:In the 24 h group,compared with control group,##P<0.01;In the 48 h group,compared with control group,**P<0.01.

2.4.2 海巴戟促進THP-1源性巨噬細胞膽固醇流出

結(jié)果如圖7、表4所示,與對照組比較,模型組的脂滴含量與熒光強度顯著升高(P<0.05);與模型組比較,海巴戟各濃度組的脂滴含量明顯降低,而熒光強度在中、高濃度組顯著降低(P<0.05)。

圖7 海巴戟干預后對THP-1源性巨噬細胞膽固醇流出的影響Fig.7 The effect of M.citrifolia on cholesterol efflux from THP-1-derived macrophages注:A.正常對照組;B.模型組;C.海巴戟低濃度組;D.海巴戟中濃度組;E.海巴戟高濃度組(下同)。I:油紅O實驗(×200);II:22-NBD-Cholesterol細胞熒光(×200)。Note:A.Control group;B.Model group;C.M.citrifolia low dose group;D.M.citrifolia medium dose group;E.M.citrifolia high dose group (the same below);I:Oil red O staining (×200);II:22-NBD-Cholesterol fluorescence (×200).

表4 海巴戟干預后對THP-1源性巨噬細胞膽固醇流出量的影響

2.4.3 海巴戟對THP-1源性巨噬細胞中PPARγ、ABCA1 mRNA及蛋白表達的影響

結(jié)果如圖8所示,與對照組比較,模型組PPARγ、ABCA1 mRNA表達顯著降低(均P<0.05);與模型組比較,各濃度海巴戟組的PPARγ、ABCA1 mRNA的表達呈劑量依賴性增加(均P<0.05)。如圖9所示,與對照組比較,模型組PPARγ、ABCA1蛋白表達顯著降低(均P<0.05);與模型組比較,各濃度海巴戟組的PPARγ、ABCA1 蛋白表達呈劑量依賴性增加(均P<0.05)。

圖8 海巴戟對THP-1源性巨噬細胞PPARγ、ABCA1 mRNA表達的影響Fig.8 Effect of M.citrifolia on the mRNA expression of PPARγ and ABCA1 in THP-1-derived macrophages注:與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01;與對照組比較,#P<0.05(下同)。Note:Compared with the model group,*P<0.05,**P<0.01;Compared with the control group,#P<0.05(the same below).

圖9 海巴戟對THP-1源性巨噬細胞中PPARγ、ABCA1 蛋白的表達的影響Fig.9 Effect of M.citrifolia on the expression of PPARγ and ABCA1 proteins in THP-1-derived macrophages

2.4.4 海巴戟對GW9662預處理THP-1源性巨噬細胞后膽固醇流出的影響

結(jié)果如圖10所示,與海巴戟高濃度組比較,海巴戟高濃度組+GW9662可顯著增加細胞內(nèi)脂滴含量與熒光強度。結(jié)果如圖11和圖12所示,與海巴戟高濃度組比較,海巴戟高濃度組+GW9662可顯著降低THP-1源性巨噬細胞PPARγ、ABCA1 mRNA的表達(均P<0.05);與海巴戟高濃度組比較,海巴戟高濃度組+GW9662可顯著降低THP-1源性巨噬細胞PPARγ、ABCA1蛋白的表達(均P<0.05)。

圖10 海巴戟對GW9662預處理THP-1源性巨噬細胞后膽固醇流出的影響Fig.10 The effect of M.citrifolia on cholesterol efflux from THP-1-derived macrophages pretreated with GW9662注:A.正常對照組;B.模型組;C.海巴戟高濃度組;D.海巴戟高濃度+GW9662(下同)。I:油紅O實驗(×200);II:22-NBD-Cholesterol細胞熒光(×200)。Note:A.Control group;B.Model group;C.M.citrifolia high dose group;D.M.citrifolia high dose + GW9662 group(the same below).I:Oil red O staining (× 200);II:22-NBD-Cholesterol fluorescence (× 200).

圖11 海巴戟對GW9662預處理THP-1源性巨噬細胞后PPARγ、ABCA1 mRNA表達的影響Fig.11 Effect of M.citrifolia on the expression of PPARγ and ABCA1 mRNA in THP-1-derived macrophages pretreated with GW9662注:與海巴戟高濃度組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05(下同)。Note:Compared with M.citrifolia high dose group,*P<0.05;Compared with the model group,#P<0.05(the same below).

圖12 海巴戟對GW9662預處理THP-1源性巨噬細胞后PPARγ、ABCA1蛋白表達的影響Fig.12 The effect of M.citrifolia on the expression of PPARγ and ABCA1 proteins in THP-1-derived macrophages pretreated with GW9662

3 討論與結(jié)論

AS是一種常見的心血管疾病,其快速進展可直接促使患者發(fā)生惡性心血管事件,如心肌梗死等[1]。現(xiàn)代醫(yī)學認為脂質(zhì)學說仍是AS發(fā)生的主要機制[2]。臨床上常使用他汀類、PCSK9抑制劑等降脂藥物來延緩AS的進展,但因這些藥物在治療劑量下仍出現(xiàn)如肌肉酸痛、肝功能損害等不良反應,使得許多患者不能耐受[8]。因此尋找新型、更安全、低毒的藥物治療AS具有積極意義。海巴戟作為新興藥食同源之品,具有廣泛的活性成分與藥理作用,符合傳統(tǒng)中藥多靶點、多途徑治療疾病的典型特點。本研究利用網(wǎng)絡藥理學預測海巴戟治療AS的有效成分及作用靶點,并構(gòu)建了THP-1源性巨噬細胞模型驗證海巴戟通過PPARγ信號通路促進細胞內(nèi)膽固醇的流出。

通過多種數(shù)據(jù)庫對海巴戟的有效成分進行篩選,發(fā)現(xiàn)黃酮類、苯丙素類及酚酸類等59個化合物主要發(fā)揮著治療AS的作用。近年來多項研究報道[9],黃酮類化合物在治療AS中扮演著關鍵角色,是植物藥的主要活性部位。Sahib等[10]研究發(fā)現(xiàn)海巴戟果實中兒茶酸、槲皮素與山柰酚的含量分別為53.68 mg/g、7.4 mg/g、6.4 mg/g,在已知有活性的黃酮類化合物中排名前三位,而這三種成分在調(diào)節(jié)血脂異常與延緩AS中作用顯著。研究發(fā)現(xiàn)[11],益心通脈顆粒主要成分兒茶酸通過分子對接和體內(nèi)外實驗均證實其能直接激活PPARγ通路從而改善AS。槲皮素廣泛存在于多種植物中,而在海巴戟中含量占比顯著,Jia等[12]和Li等[13]均報道槲皮素可明顯減少高脂飲食誘導ApoE-/-小鼠AS模型胸主動脈斑塊含量,其機制與ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)表達增加有關。研究證實[14],山柰酚具有較強抗炎活性,能通過激活PI3K/AKT/Nrf2通路延緩AS進展。

隨后在GO富集分析中發(fā)現(xiàn),海巴戟主要調(diào)節(jié)細胞的膜受體以及核受體等生物學功能;KEGG信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)海巴戟治療AS與脂代謝相關信號通路有關,而PPAR信號通路位列其中。研究表明[15],脂代謝相關信號通路尤其是PPAR信號通路與細胞膜的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運體及細胞核內(nèi)受體關系密切。眾所周知,PPARs是位于細胞核內(nèi)一類經(jīng)典的核受體,在接受到第二信使的信號后,通過激活下游轉(zhuǎn)錄因子,增加細胞膜上膽固醇轉(zhuǎn)運體的表達,進而減少細胞內(nèi)膽固醇的聚集,阻礙巨噬細胞演變?yōu)榕菽毎鸞16]。因此PPAR信號通路在減少脂核中泡沫細胞的形成及延緩AS扮演著重要的角色。此外,在本研究中PPARG基因亦是成分靶點網(wǎng)絡中核心網(wǎng)絡的重要節(jié)點。

基于上述網(wǎng)絡藥理學分析,本研究在體外實驗構(gòu)建THP-1源性巨噬細胞模擬粥樣斑塊中泡沫細胞[12],海巴戟干預THP-1源性巨噬細胞后發(fā)現(xiàn),細胞內(nèi)膽固醇含量明顯減少,并且細胞內(nèi)PPARγ的表達顯著上調(diào)。Inada等[17]、Nerurkar等[18]分別通過動物實驗明確海巴戟的降脂作用。在一項臨床研究中發(fā)現(xiàn)[19],海巴戟可顯著降低重度吸煙受試者血清中LDL含量,并升高其高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)的水平。最近Chong等[3]證實海巴戟可使熱氧化棕櫚油飲食誘導的AS大鼠模型主動脈中脂質(zhì)斑塊明顯減少,但具體機制尚未闡明。早前,Lee等[20]使用70%甲醇萃取海巴戟果實干粉,發(fā)現(xiàn)其在C2C12骨骼肌細胞中能激動PPARγ受體,該實驗報道與我們結(jié)果一致。本研究首次發(fā)現(xiàn)海巴戟能促進THP-1源性巨噬細胞膽固醇流出,并結(jié)合網(wǎng)絡藥理學預測其通過激活PPARγ信號通路發(fā)揮膽固醇逆轉(zhuǎn)運(reverse cholesterol transport,RCT)作用。RCT系體內(nèi)調(diào)節(jié)脂質(zhì)異常和改善AS重要機制之一,可將細胞中的膽固醇經(jīng)細胞膜上的清道夫受體轉(zhuǎn)出細胞,隨后與血漿中的載脂蛋白apoA、apoE等結(jié)合后運輸至肝臟代謝,并轉(zhuǎn)化為膽汁酸排出體外,從而改善脂代謝異常[21]。而ABCA1作為巨噬細胞膜上重要的清道夫受體,受上游核轉(zhuǎn)錄因子PPARγ的精細調(diào)控,通過RCT過程負責將細胞內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)運至細胞外[16]。本研究中ABCA1的表達水平隨PPARγ的激活而上調(diào),當使用PPARγ抑制劑GW9662時,THP-1源性巨噬細胞中ABCA1受體表達升高趨勢受到抑制,同時細胞內(nèi)膽固醇含量無明顯下降,表明PPARγ介導的ABCA1是細胞內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)運的主要載體。類似地,槲皮素[12]、黃芩苷[22]和二氫楊梅素[23]均可通過激活PPARγ/ABCA1信號通路,促進RCT,發(fā)揮抗AS的作用。因此,海巴戟能通過激活PPARγ信號通路促進THP-1源性巨噬細胞的膽固醇流出。

綜上,海巴戟藥味甘、酸,藥性平和,可補益腎精、平補陰陽,預防心腦血管疾病。本研究利用網(wǎng)絡藥理學結(jié)合體外實驗揭示了海巴戟治療AS的機制,首次證明海巴戟能促進THP-1源性巨噬細胞膽固醇流出,并通過激活PPARγ信號通路促進RCT。因此本研究為海巴戟有效防治AS提供新的藥理作用機制。然而本研究仍存在一些局限:(1)由于TCMSP數(shù)據(jù)庫未納入植物藥海巴戟,因此借助CAMUP數(shù)據(jù)庫和SwissADME數(shù)據(jù)庫輔助篩選其活性成分。雖然有研究[24]亦借助多種數(shù)據(jù)庫聯(lián)合篩選中藥成分,但不同數(shù)據(jù)庫活性成分的篩選標準不同,所以在篩選可靠性方面有待進一步驗證;(2)本研究篩選了5種疾病相關數(shù)據(jù)庫,結(jié)果顯示各數(shù)據(jù)庫中AS靶點數(shù)目差異較大,可能與每種數(shù)據(jù)庫收錄的病種存在差異有關;(3)本課題組將在體外實驗結(jié)果基礎上,進一步構(gòu)建AS動物模型,從體內(nèi)實驗角度為海巴戟促進RCT延緩AS提供更加完整的實驗依據(jù)。