陳 哲, 康虹陽(yáng), 劉 潔, 張 斌, 張 靈, 高炳華, 仲 梅

河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院1.血液科;2.檢驗(yàn)科,河北 張家口 075000;3.解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)大連康復(fù)療養(yǎng)中心,遼寧 大連 116013

原發(fā)免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia,ITP)是一種以血小板減少及出血癥狀為特點(diǎn)的獲得性自身免疫性疾病。目前,ITP的具體病理機(jī)制尚未明確。有研究報(bào)道,T細(xì)胞各亞群的比例、增殖分化及其分泌的細(xì)胞因子、膜表面受體等的異常在ITP的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［1-2］。程序性死亡受體1(programmed death-1,PD-1)/程序性死亡配體1(programmed death-1 ligand,PD-L1)是T細(xì)胞激活過(guò)程中重要的負(fù)性協(xié)同共刺激分子,可以抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞的增殖、活化,誘導(dǎo)免疫耐受,避免過(guò)度的免疫反應(yīng),在維持免疫穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用,與惡性腫瘤、自身免疫性疾病、感染等多種疾病相關(guān)［3-8］。但目前,關(guān)于PD-1/PD-L1與成人ITP的研究少見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在探討ITP患者外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-1及PD-L1的表達(dá)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取自2016年1月至2022年1月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院收治的120例成人ITP患者納入B組。納入標(biāo)準(zhǔn):符合《成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療中國(guó)專家共識(shí)(2016年版)》［9］的診斷標(biāo)準(zhǔn);1個(gè)月內(nèi)未進(jìn)行血小板輸注及ITP一線、二線治療,包括糖皮質(zhì)激素、丙種球蛋白、促血小板生成藥物、抗CD20單克隆抗體、脾切除術(shù)及硫唑嘌呤、環(huán)孢素A、達(dá)那唑、長(zhǎng)春堿類等治療。排除標(biāo)準(zhǔn):年齡<18歲;妊娠或哺乳期女性;肝病、感染、腫瘤、自身免疫性疾病等其他系統(tǒng)疾病及藥物繼發(fā)血小板減少;假性血小板減少及先天性血小板減少癥。另選取同期體檢的120例健康志愿者納入A組。A組中,男性36例,女性84例;平均年齡(46.32±15.18)歲;血小板計(jì)數(shù)(platelet count,PLT)(217.83±67.42)×109個(gè)/L。B組中,男性35例,女性85例;平均年齡(47.75±15.79)歲;PLT(10.28±6.99)×109個(gè)/L。兩組年齡、性別比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。B組PLT低于A組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有研究對(duì)象均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 治療方法 給予B組患者潑尼松(生產(chǎn)廠家:浙江仙琚制藥股份有限公司;生產(chǎn)批號(hào):161113;規(guī)格:5 mg/片)頓服,1 mg/(kg·d),連續(xù)治療4周。

1.3 觀察指標(biāo)及療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)PLT及是否有出血,將B組患者分為有效組(治療后PLT≥30×109個(gè)/L,較基礎(chǔ)PLT升高至少2倍,且無(wú)出血表現(xiàn);n=83)與無(wú)效組(PLT<30×109個(gè)/L,或PLT升高不到基礎(chǔ)值的2倍,或有出血;n=37)。應(yīng)用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)3組PLT水平,并評(píng)估有效組及無(wú)效組的ITP出血評(píng)分［4］。采集治療前后各組空腹靜脈血4 ml,比較治療前后3組CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-1、PD-L1的表達(dá)率。鼠抗人CD45-PerCP-Cy5.5(批號(hào):9247247)、CD3-APC(批號(hào):561811)、CD4-FITC(批號(hào):9239677)、CD8-PE(批號(hào):555367)、PD-1-BV421(批號(hào):565935)、PD-L1-BV510(批號(hào):740190)單克隆抗體、BD FACSCantoTM Ⅱ流式細(xì)胞儀均購(gòu)自美國(guó)BD公司。BD FACSDiva Software,XN-20［AI］全自動(dòng)模塊式血液體液分析儀購(gòu)自希森美康醫(yī)用電子有限公司。

2 結(jié)果

2.1 各組CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-1表達(dá)率比較 有效組與無(wú)效組治療前后CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-1表達(dá)率均高于A組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。有效組治療后CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-1表達(dá)率均低于治療前,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。有效組治療后CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-1表達(dá)率均低于無(wú)效組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-1表達(dá)率比較

2.2 各組CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)率比較 有效組與無(wú)效組治療前后CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)率均高于A組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。有效組治療后CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)率均低于治療前,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。有效組治療后CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)率均低于無(wú)效組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)率比較

2.3 各組PLT、出血評(píng)分比較 有效組、無(wú)效組治療前后PLT均低于A組,治療前后出血評(píng)分均高于A組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。有效組治療后PLT高于治療前,出血評(píng)分低于治療前,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。有效組治療后PLT高于無(wú)效組,出血評(píng)分低于無(wú)效組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組PLT、出血評(píng)分比較

2.4 PLT、出血評(píng)分與CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-1、PD-L1表達(dá)率相關(guān)性 經(jīng)Pearson系數(shù)檢驗(yàn),PLT與CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-1、PD-L1表達(dá)率具有極強(qiáng)負(fù)相關(guān)性(P<0.05);而出血評(píng)分與CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-1、PD-L1表達(dá)率具有中等強(qiáng)度正相關(guān)性(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 Pearson檢驗(yàn)結(jié)果的r值

3 討論

PD-1/PD-L1在維持外周免疫耐受和預(yù)防自身免疫紊亂方面具有重要作用,兩者之間的平衡被打破易導(dǎo)致疾病發(fā)生。有研究報(bào)道,PD-1基因敲除的小鼠會(huì)出現(xiàn)狼瘡樣癥狀、IgG3沉積性腎小球腎炎和破壞性關(guān)節(jié)炎［3］。此外,PD-L1的上調(diào)與多種惡性腫瘤的不良預(yù)后相關(guān),腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)激活JAK、STAT、NF-κB、mTOR和PI3K等信號(hào)通路激活PD-L1,發(fā)生免疫逃逸［10-14］。Shiuan等［15］研究報(bào)道,單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用抗PD-1藥物治療黑色素瘤后,患者發(fā)生了ITP。但PD-1/PD-L1在ITP發(fā)生發(fā)展中具體的作用機(jī)制尚未完全明確。

筆者前期研究發(fā)現(xiàn),外周血CD4+T淋巴細(xì)胞表面PD-1表達(dá)上調(diào)可能與ITP患者疾病發(fā)展及預(yù)后有關(guān)［16］。本研究通過(guò)檢測(cè)成人ITP患者CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-1和PD-L1表達(dá)率發(fā)現(xiàn),治療前有效組、無(wú)效組的CD4+、CD8+T細(xì)胞表面PD-1、PD-L1表達(dá)率無(wú)明顯差異,但均高于A組,與Nie等［17］研究結(jié)果一致。另有研究報(bào)道,小鼠結(jié)腸炎模型和人類炎癥性腸病中,T細(xì)胞表面PD-1、PD-L1表達(dá)均增加［18-20］。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的滑膜及關(guān)節(jié)液中,PD-1+T細(xì)胞、PD-L1+單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的數(shù)目均增多［21-22］。在這些自身免疫性疾病中,雖然免疫抑制分子表達(dá)上調(diào),但T細(xì)胞卻仍處于活化狀態(tài)。有研究認(rèn)為,血漿中sPD-1的高表達(dá)可以阻斷PD-1與PD-L1的結(jié)合,使PD-1/PD-L1負(fù)性信號(hào)通路功能異常,不能提供足夠的抑制性信號(hào)阻斷T細(xì)胞的活化增殖,最終導(dǎo)致自身免疫損傷發(fā)生［23-24］。Wang等［25］研究報(bào)道,ITP患者PD1/PD-L1表達(dá)增加,且sPD-1的水平也明顯升高,推測(cè)較高的sPD-1可能會(huì)阻斷PD-1/PD-L1通路,參與ITP患者的免疫失衡。但本研究未檢測(cè)ITP患者血漿sPD-1的表達(dá)水平,后續(xù)仍需進(jìn)一步深入研究探討PD1/PD-L1與ITP的關(guān)系。

本研究中,有效組治療后CD4+、CD8+T細(xì)胞表面PD-1、PD-L1表達(dá)率明顯降低,但仍高于A組;而無(wú)效組的CD4+、CD8+T細(xì)胞表面PD-1、PD-L1表達(dá)率雖然也降低,但與治療前比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);治療后,有效組的PLT升高、出血評(píng)分降低,而無(wú)效組PLT、出血評(píng)分與治療前比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。激素治療ITP的機(jī)制與免疫網(wǎng)絡(luò)的多個(gè)環(huán)節(jié)有關(guān),涉及B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、抗原遞呈細(xì)胞等多種細(xì)胞及細(xì)胞因子,從而調(diào)節(jié)體液及細(xì)胞免疫對(duì)PLT生成和破壞的影響,達(dá)到有效治療的目的,但激素治療對(duì)部分ITP患者無(wú)效,這可能與糖皮質(zhì)激素受體、P糖蛋白等異常有關(guān)［26-27］。本研究中,有效組的異常免疫失衡得到改善,可能反饋性地下調(diào)了PD1和PD-L1的表達(dá),也可能激素直接影響PD1、PD-L1的表達(dá)及PD-1/PD-L1信號(hào)通路,導(dǎo)致CD4+、CD8+T細(xì)胞表面PD-1、PD-L1的表達(dá)率明顯降低;而無(wú)效組患者體內(nèi)的免疫失衡未得到糾正,使PD1、PD-L1持續(xù)激活,持續(xù)高表達(dá)。

綜上所述,PD1/PD-L1可能與成人ITP的發(fā)生發(fā)展相關(guān),且患者治療后PLT計(jì)數(shù)、出血評(píng)分變化與CD4+、CD8+T細(xì)胞表面PD-1、PD-L1表達(dá)率變化具有中等至極強(qiáng)的相關(guān)性。但PD1/PD-L1信號(hào)通路的調(diào)節(jié)較復(fù)雜,其在ITP中的作用機(jī)制及其能否作為ITP治療的新靶點(diǎn),以及ITP患者T細(xì)胞表面PD-1、PD-L1的表達(dá)率能否作為ITP預(yù)后及療效評(píng)估的指標(biāo)仍需進(jìn)一步探討。