鄧 亮, 段一璇, 孫婧靚, 劉 暢, 鄧 捷, 王梓銘

1.大同大學(xué) 中醫(yī)藥健康服務(wù)學(xué)院,山西 大同 037009;2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科,陜西 西安 710061

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是在無冠狀動脈疾病、高血壓和瓣膜性心臟病的情況下發(fā)生心力衰竭的病理生理疾?。?］。流行病學(xué)研究表明,糖尿病患者心力衰竭的發(fā)病率高達(dá)19%～26%［2］。DCM是糖尿病的主要并發(fā)癥之一,也是糖尿病發(fā)病和死亡的主要原因。因此,有必要建立有效的科學(xué)策略來預(yù)防和治療DCM,以改善患者的預(yù)后［3-5］。目前,DCM的發(fā)病機(jī)制尚未明確。有研究報(bào)道,多種病理生理因素可導(dǎo)致DCM發(fā)生,包括系統(tǒng)代謝紊亂、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的不適當(dāng)激活、亞細(xì)胞異常、氧化應(yīng)激、炎癥和免疫調(diào)節(jié)功能失調(diào)等［6］。近年來,通過生物信息學(xué)分析,多種疾病的致病基因和核心通路已被有效識別。本研究通過對GEO數(shù)據(jù)庫中DCM的基因芯片進(jìn)行分析,篩選出導(dǎo)致DCM的差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs),并探索潛在的靶向藥物?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 選取基因集進(jìn)行差異基因分析 從GEO數(shù)據(jù)庫中下載C57BL/6小鼠兩個微列陣數(shù)據(jù)集GSE161052和GSE161931。其中,GSE161052數(shù)據(jù)集包括3個DCM病例,3個對照樣本;GSE161931數(shù)據(jù)集包括5個DCM病例,5個對照樣本。使用Homologene.R包將小鼠基因轉(zhuǎn)化為人類基因。使用limma R包進(jìn)行差異表達(dá)分析。過濾條件為|log FC|>1,P<0.05。得到DEGs,使用ggplot2 R對差異表達(dá)結(jié)果進(jìn)行可視化,得到DEGs的火山圖,使用pheatmap R包繪制DEGs的熱圖。

1.2 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)(weighted gene co-expression network analysis,WGCNA)R軟件包分析權(quán)重基因的表達(dá),并通過差異分析進(jìn)行校正。無標(biāo)度拓?fù)鋽M合指數(shù)的軟閾值為4(最佳功率值),基因重要性得分>0.6?；蚝湍K之間的相關(guān)性>0.8,輸出相關(guān)的樞紐基因模塊并確定最優(yōu)模塊。

1.3 獲取交集基因 使用venn R package包對DEGs、最優(yōu)基因模塊和樞紐基因模塊取交集,獲得交集基因。

1.4 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用String軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)分析［7］。最低要求的相互作用分?jǐn)?shù)為0.15。

1.5 免疫浸潤分析 使用GSVA R軟件包對校正后的表達(dá)矩陣數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析,使用vioplot.R軟件包可視化差異結(jié)果,然后使用CIBERSORT與交集基因進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.6 基因藥物分析及分子對接 使用藥物-基因相互作用數(shù)據(jù)庫(drug gene interaction database,DGIdb)預(yù)測交集基因的藥物,并獲得對應(yīng)的藥物信息。使用Cytoscape繪制基因與藥物的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。最后,使用PyMOL軟件對靶點(diǎn)基因結(jié)合活性最強(qiáng)的有效成分對接結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 基因差異表達(dá)結(jié)果 在標(biāo)準(zhǔn)化微陣列結(jié)果后,識別出349個DEGs,包括LCN2、COX6B2等197個上調(diào)基因,ARNTL、RET等152個下調(diào)基因。見表1、圖1。

圖1 DEGs(a.火山圖;b.熱圖)

表1 limma R包輸出的前20個DEGs

2.2 共同表達(dá)模塊構(gòu)建結(jié)果及關(guān)鍵模塊識別 權(quán)重基因共同表達(dá)分析得到15個模塊。根據(jù)模塊特征結(jié)果,pink模塊是最佳模塊(包含369個基因),與DCM的相關(guān)性最強(qiáng)(r=0.7,P=0.02)。輸出hubGen-MMpink模塊,得到85個核心基因。見圖2。

圖2 WGCNA分析結(jié)果(a.軟閾值圖和平均連通性圖;b.聚類樹;c.模塊與臨床特征的相關(guān)性熱圖;d.pink模塊的散點(diǎn)圖)

2.3 交集基因獲取結(jié)果 使用Venn R package包獲取交集基因,其中,DEGs和核心基因交集27個,DEGs、pink模塊基因和核心基因交集17個)。見圖3。

圖3 韋恩圖(a.DEGs和核心基因交集;b.DEGs、pink模塊基因和核心基因交集)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與模塊分析 應(yīng)用STRING在線工具,確定了22個具有蛋白質(zhì)互作關(guān)系的節(jié)點(diǎn),并根據(jù)連接度構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。其中,NTN1與SLIT3、CYP1B1與CYP2B2具有較強(qiáng)的相互作用。見表2、圖4。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表2 前10位DEGs相互作用得分

2.5 免疫浸潤分析結(jié)果 使用Cibersort工具評估免疫細(xì)胞在樣本中的浸潤比例。結(jié)果顯示,DCM樣本和健康樣本之間的浸潤免疫細(xì)胞比例存在著明顯的差異(圖5a)。與健康組相比,肥大細(xì)胞在DCM組高度表達(dá)(P=0.021),而Tfh則明顯減少(P=0.038)。對28種免疫細(xì)胞和基因的相關(guān)性分析表明,BEST1與Treg呈正相關(guān)(P<0.01);WFIKKN2與CD8+ T細(xì)胞、TIL呈負(fù)相關(guān)(P<0.01);PPP1R16B與Treg呈負(fù)相關(guān)(P<0.01);RET與NK細(xì)胞呈正相關(guān)(P<0.05);FKBP5與CD8+ T細(xì)胞、T細(xì)胞共抑制細(xì)胞、Th1呈負(fù)相關(guān)(P<0.05);CYP2B6與B細(xì)胞、Ⅱ型INF呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)(圖5b)。

圖5 免疫浸潤分析結(jié)果(a.臨床特征與免疫細(xì)胞差異;b.基因和免疫細(xì)胞之間的相關(guān)性)

2.6 潛在藥物的篩選結(jié)果 使用DGIdb數(shù)據(jù)庫搜索靶向生物標(biāo)志物的潛在藥物,共得到12種靶向FKBP5的藥物,48種靶向CYP2B6的藥物和62種靶向RET的藥物(圖6)。塞替派、美芬妥因、環(huán)磷酰胺、三胺硫磷、蒿甲醚的活性成分與FKBP5具有良好的結(jié)合活性;安非他酮、吉西他濱、氯丙咪嗪、西酞普蘭、氯氮平與CYP2B6具有良好的結(jié)合活性;AST-487、索拉非尼、Amuvatinib、AT-9283與Lenvatinib具有良好的結(jié)合活性。蒿甲醚、氯氮平和AST-487分別與CYP2B6、FKBP5和RET基因靶點(diǎn)結(jié)合時(shí)表現(xiàn)出最強(qiáng)的結(jié)合活性(圖7)。

圖6 基因-藥物關(guān)系網(wǎng)絡(luò)(紅色代表上調(diào)基因,綠色代表下調(diào)基因,藍(lán)色代表化合物)

圖7 藥物分子對接模型(a.CYP2B6-蒿甲醚對接模型;b.FKBP5-氯氮平對接模型;c.RET-AST-487對接模型)

3 討論

目前,DCM發(fā)生發(fā)展的主要機(jī)制仍不清楚,其原因已被歸結(jié)為許多因素,如活性氧生成、炎癥、晚期糖基化終產(chǎn)物的形成、線粒體對底物利用的改變、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的激活和脂質(zhì)毒性、遺傳因素以及表觀遺傳過程等［8］。本研究通過生物信息技術(shù)獲得了3個關(guān)鍵基因及其相應(yīng)的藥物信息,確定FKBP5、CYP2B6、RET為DCM潛在的生物標(biāo)志物。

FKBP5是一個編碼FK506結(jié)合蛋白51的基因。有研究報(bào)道,FKBP-5在心臟、腎、骨骼肌、肝、胎盤等組織中廣泛表達(dá)［9］。此外,FKBP5基因表達(dá)水平與胰島素抵抗標(biāo)志物有關(guān)［10］。有研究報(bào)道,與野生型小鼠相比,FKBP5基因敲除的小鼠體質(zhì)量減輕,對飲食引起的肥胖具有抵抗力,證明FKBP5與胰島素抵抗之間存在關(guān)聯(lián)［11］。FKBP5通過激活主免疫調(diào)節(jié)劑NF-κB促進(jìn)炎癥反應(yīng),從遺傳或藥理學(xué)上抑制FKBP5可以防止其對NF-κB的影響［12］。此外,FKBP5的衰老/應(yīng)激相關(guān)表觀遺傳特征與心肌梗死史有關(guān)。本研究中,FKBP5表達(dá)顯著上調(diào),提示FKBP5可能通過NF-κB途徑在DCM病理過程中的炎癥反應(yīng)階段發(fā)揮重要作用。免疫浸潤分析結(jié)果提示,FKBP5與CD8+ T細(xì)胞、T細(xì)胞共抑制細(xì)胞、Th1呈負(fù)相關(guān)。體內(nèi)研究表明,FKBP-5缺失可通過增加CD8+ T、CD4+ T、NKT和CD4+NKT細(xì)胞抑制腫瘤進(jìn)展［13］,與本研究結(jié)果一致。

CYP2B6在人類肝中高度表達(dá),是主要的藥物代謝酶之一。編碼藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因遺傳變異可以改變血漿濃度和藥物暴露,最終影響治療結(jié)果［14］。CYP2B6的活性是臨床多種藥物代謝、反應(yīng)、毒性的重要影響因素,這些藥物包括蒿甲醚［15］、環(huán)磷酰胺［16］、美沙酮［17］等。本研究分子對接結(jié)果也顯示,這些藥物與篩選出的靶點(diǎn)基因具有高結(jié)合力,提示CYP2B6可能通過影響藥物的代謝,在DCM疾病進(jìn)程中發(fā)揮作用。未來可進(jìn)一步探究CYP2B6的基因多態(tài)性與DCM的關(guān)系,為進(jìn)一步的藥物研發(fā)提供基礎(chǔ)。

本研究中,RET下調(diào)。RET是一種原癌基因,通過DNA重排激活,其本質(zhì)是一種跨膜的受體酪氨酸激酶。在正常細(xì)胞中,RET參與胎兒造血、泌尿生殖系統(tǒng)、胃腸道和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程。RET畸變被認(rèn)為是許多類型癌癥的致癌驅(qū)動因素［18］。有研究報(bào)道,GDF15升高通過與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子家族受體α樣(GFRAL) 結(jié)合和后腦中受體酪氨酸激酶RET的募集,減少動物模型食物攝入量、體質(zhì)量,并且該事件是減重、改善血糖控制所必需［19］。

此外,本研究篩選出了與FKBP5、CYP2B6、RET這3個基因結(jié)合能最高的藥物。蒿甲醚是青蒿素的一種衍生物,在臨床治療瘧疾方面發(fā)揮著重要作用［20］。有研究報(bào)道,蒿甲醚可以通過調(diào)節(jié)氨基酸的代謝來延緩糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展［21］。Guo等［22］研究報(bào)道,蒿甲醚能顯著降低空腹血糖水平,抑制胰腺β細(xì)胞凋亡,增加胰島素分泌,對小鼠具有抗糖尿病、抗肥胖的作用,并被認(rèn)為其是治療糖尿病的候選藥物。但此類藥物在DCM治療領(lǐng)域尚缺乏應(yīng)用研究。氯氮平是首個用于治療精神分裂癥的非典型抗精神病藥物［23］,屬神經(jīng)抑制劑,與5-羥色胺受體5-HT1A和5-HT2具有強(qiáng)大的結(jié)合親和力。氯氮平還具有抗組織胺、抗膽堿能和α腎上腺素能拮抗作用,在臨床上被用于治療精神分裂癥,但由于其嚴(yán)重的不良反應(yīng),如粒細(xì)胞缺乏癥,氯氮平的臨床應(yīng)用受到很大限制［24］。本研究結(jié)果顯示,氯氮平作為FKBP5的最強(qiáng)結(jié)合藥物,可能通過調(diào)節(jié)FKBP5的表達(dá)治療DCM,這為DCM的治療提供了新的治療靶點(diǎn)和藥物選擇,但其具體機(jī)制及后續(xù)的改良個性化給藥劑量仍需進(jìn)一步研究。AST-487是一種酪氨酸激酶受體抑制劑,其與RET的關(guān)系已被證實(shí)。AST-487能抑制RET的自磷酸化,從而抑制下游RET介導(dǎo)的信號級聯(lián)反應(yīng)［25-28］。同時(shí),AST-487已被證明對治療各種癌癥疾病有效,如甲狀腺癌和乳腺癌［26-27］。目前,AST-487尚未作為藥物應(yīng)用于臨床,其劑型、給藥途徑、生物利用度仍需進(jìn)一步的藥理及臨床研究作為基礎(chǔ)。但本研究仍存在一些局限性。首先,本研究基于現(xiàn)有的公共數(shù)據(jù)集,結(jié)果在很大程度上是探索性的,應(yīng)謹(jǐn)慎對待;其次,潛在的篩選藥物來源于DGIdb數(shù)據(jù)庫,且數(shù)據(jù)不斷更新,可能有更多的相關(guān)藥物有待發(fā)現(xiàn)。

綜上所述,FKBP5、CYP2B6和RET通過不同的分子途徑在DCM的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用,蒿甲醚、氯氮平和AST-487有望成為治療DCM的新藥物。