王志紅 李紅培 邢佳 李宇霄 呂麗佳 王一帆 王嘉麟

良好的睡眠是身心健康和生活質(zhì)量的保證。而在現(xiàn)代社會(huì),睡眠不足成為了普遍現(xiàn)象。大量研究表明,睡眠不足會(huì)導(dǎo)致包括神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等各類(lèi)疾病的發(fā)生[1]。失眠屬于長(zhǎng)期睡眠不足,包括入睡困難和維持睡眠困難,因睡眠困難、睡眠時(shí)間短或睡眠質(zhì)量不佳而影響白天社會(huì)功能,呈一種病理性主觀體驗(yàn),其較睡眠不足危害更大。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示,我國(guó)失眠普遍患病率為15%,老年人失眠率高達(dá)50%[2-3]。隨著人們生活節(jié)奏加快,社會(huì)、工作壓力不斷增加,失眠人群愈發(fā)趨于年輕化。失眠作為常見(jiàn)的睡眠障礙之一,嚴(yán)重影響患者身心健康和生活質(zhì)量,但只要及時(shí)適當(dāng)采取干預(yù)措施,大部分患者癥狀可有所改善[4]。

臨床上通過(guò)中醫(yī)特色診療手段(如湯藥、針灸等)改善睡眠的有效案例不勝枚舉。筆者于臨床多以柴胡加龍骨牡蠣湯化裁治療失眠,大多收獲滿(mǎn)意療效[5]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察柴胡加龍骨牡蠣湯化裁方對(duì)失眠小鼠的短期干預(yù)探討其改善睡眠的神經(jīng)調(diào)節(jié)機(jī)制,擬從客觀指標(biāo)上對(duì)其做出療效評(píng)價(jià),以期為臨床推廣提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)昆明種雄性小鼠40只,體質(zhì)量20～22 g,采購(gòu)自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(京)2016-0002。按照中華動(dòng)物倫理學(xué)要求飼養(yǎng)和處理動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,予統(tǒng)一飼養(yǎng)條件并適應(yīng)環(huán)境3天。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

柴胡加龍骨牡蠣湯化裁方:柴胡10 g、黃芩9 g、清半夏9 g、黨參10 g、酸棗仁30 g、川芎6 g、知母6 g、生龍骨15 g、生牡蠣15 g、磁石30 g、茯苓12 g、大黃3 g、生姜9 g、大棗9 g、桂枝5 g,由北京康仁堂藥業(yè)有限公司制作配方顆粒。

酒石酸唑吡坦片[賽諾菲(北京)制藥有限公司,10 mg/片,批號(hào):5T006]。

1.3 主要試劑、儀器與設(shè)備

對(duì)氯苯丙氨酸(Selleck,500 mg/支,批號(hào):S4586);戊巴比妥鈉(P3761 Sigma,USA,批號(hào):P12149);鼠斷頭器(XYC北京哲成科技有限公司);小鼠5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、5-羥基吲哚乙酸(5-hydroxyindole acetic acid,5-HIAA)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutanoic acid,GABA)ELISA試劑盒(AMEKO公司);Sunrise酶標(biāo)儀(TECAN公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物分組 給小鼠自然晝夜節(jié)律及光照、自由飲水、攝食,適應(yīng)性飼養(yǎng)3天。3天后通過(guò)隨機(jī)數(shù)字表法將40只小鼠分為空白對(duì)照組、模型組、柴胡組(柴胡加龍骨牡蠣湯治療)、唑吡坦組(酒石酸唑吡坦片治療),每組10只。

1.4.2 模型建立 實(shí)驗(yàn)組(包括模型組、 柴胡組、 唑吡坦組)小鼠腹腔注射對(duì)氯苯丙氨酸(300 mg/kg,10 g/0.1 mL),空白對(duì)照組小鼠腹腔注射等量生理鹽水。每日1次,共3日。

1.4.3 給藥方法 根據(jù)人鼠給藥劑量體表面積折算公式:鼠給藥劑量=人給藥劑量×0.9×(人體重/鼠體重)×1/3,柴胡組給予柴胡加龍骨牡蠣湯化裁顆粒3 g/kg灌胃,唑吡坦組給予酒石酸唑吡坦片5 mg/kg灌胃,模型組與空白對(duì)照組分別給予生理鹽水灌胃,共給藥7天,每日1次。給藥期間,除柴胡組1只小鼠死亡外,其余小鼠全部存活。

1.5 取材與指標(biāo)檢測(cè)

最后一次給藥12小時(shí)后將全部小鼠處死:2%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)腹腔注射麻醉,鼠斷頭器迅速斷頭,冰上快速剝離完整腦組織,隨即放入培養(yǎng)皿(置于冰上)中,分離腦干和前腦,置于-80℃冰箱待用。檢測(cè)時(shí),樣品室溫解凍,按照每100 mg組織加入1 mL生理鹽水的標(biāo)準(zhǔn),進(jìn)行研磨和反復(fù)凍融,待細(xì)胞膜完全破壞后,將組織勻漿于4℃ 5 000 r/min條件下離心5分鐘,取上清液,按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。利用全自動(dòng)酶標(biāo)儀,測(cè)定各孔的OD值,并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算對(duì)應(yīng)的濃度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 造模結(jié)果

小鼠為晝伏夜出型生物,在第3日腹腔注射對(duì)氯苯丙氨酸后24小時(shí),測(cè)量實(shí)驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量較空白對(duì)照組輕4～6 g,且更易受驚嚇,并觀察到實(shí)驗(yàn)組小鼠均出現(xiàn)不同程度晝夜節(jié)律紊亂,表現(xiàn)為白天興奮,說(shuō)明造模成功。見(jiàn)表1。

表1 造模成功后各組小鼠體質(zhì)量情況

2.2 各組小鼠腦干中5-HT含量比較

造模后,模型組小鼠腦干中5-HT含量較空白對(duì)照組顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給藥后,唑吡坦組、柴胡組小鼠腦干中5-HT含量高于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);柴胡組與唑吡坦組小鼠腦干中5-HT含量無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠腦干中5-HT含量比較

2.3 各組小鼠腦干中5-HIAA含量比較

造模后,模型組小鼠腦干中5-HIAA含量較對(duì)空白照組顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給藥后,唑吡坦組、柴胡組小鼠腦干中5-HIAA含量高于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);柴胡組與唑吡坦組小鼠腦干中5-HIAA含量無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠腦干中5-HIAA含量比較

2.4 各組小鼠腦干中GABA含量比較

造模后,模型組小鼠腦干中GABA含量較對(duì)照組顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給藥后,唑吡坦組、柴胡組小鼠腦干中GABA含量高于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);柴胡組與唑吡坦組小鼠腦干中GABA含量無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組小鼠腦干中GABA含量的比較

3 討論

睡眠—覺(jué)醒是確保機(jī)體正常運(yùn)作所必需的。充足的睡眠能夠保證身體充分參與體內(nèi)的晝夜節(jié)律,為各項(xiàng)身體機(jī)能的順利發(fā)揮提供能量?jī)?chǔ)備。當(dāng)今社會(huì)百態(tài)的壓力造就了失眠人群的激增和年輕化,患者常表現(xiàn)為不同程度的睡眠—覺(jué)醒節(jié)律紊亂。失眠可以作為單一病癥出現(xiàn),也可能是其它疾病的伴隨或繼發(fā)癥狀。嚴(yán)重的失眠會(huì)影響患者認(rèn)知功能和情緒狀態(tài),繼而加重失眠,這些神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的惡性循環(huán)與氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)、單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的分泌改變存在一定關(guān)系[6]。

5-HT能神經(jīng)元可以對(duì)睡眠—覺(jué)醒進(jìn)行雙相調(diào)控[7-8],它既可以通過(guò)促進(jìn)下丘腦有催眠效應(yīng)的肽類(lèi)物質(zhì)累積,同時(shí)也能夠協(xié)同去甲腎上腺素、多巴胺等其余單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì),共同調(diào)控大腦睡眠。腦干中縫核內(nèi)存在大量5-HT能神經(jīng)元,若腦干功能遭到破壞,可引發(fā)完全性失眠。5-HIAA作為5-HT的代謝產(chǎn)物,可間接反映5-HT的含量與功能,5-HT和5-HIAA之間呈正相關(guān)關(guān)系。單胺氧化酶(5-HT轉(zhuǎn)化成5-HIAA的限速酶)活性在24小時(shí)睡眠剝奪后顯著增高,而隨著剝奪時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減少[9]。在短期睡眠剝奪后,5-HIAA的含量也會(huì)隨之下降。

實(shí)驗(yàn)證明,通過(guò)藥物干預(yù)激活5-HT能系統(tǒng)可以促進(jìn)睡眠[10]。腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)協(xié)同氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)構(gòu)成的睡眠—覺(jué)醒神經(jīng)調(diào)節(jié)回路,對(duì)睡眠—覺(jué)醒的運(yùn)作和維持起著至關(guān)重要的影響。GABA約占腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)所有神經(jīng)元含量的三分之一,是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì),能夠?qū)λ{(lán)斑、中縫核以及中腦腹側(cè)被蓋區(qū)的單胺能促覺(jué)醒系統(tǒng)產(chǎn)生抑制,從而發(fā)揮促眠作用[11-12]。失眠患者普遍存在GABA含量下降[13]。

諸多證據(jù)表明,中草藥及其活性成分或可通過(guò)調(diào)控中樞單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)、氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)而發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用[14-16]。失眠屬于中醫(yī)“不寐”范疇,古名“目不瞑”“不得眠”。該病首載于《足臂十一脈灸經(jīng)》,時(shí)稱(chēng)“不臥”“不得臥”“不能臥”。直至《難經(jīng)·四十六難》首先提出“不寐”之名:“老人臥而不寐,少壯寐而不寤者,何也?然:經(jīng)言少壯者,血?dú)馐?肌肉滑,氣道通,營(yíng)衛(wèi)之行不失于常,故晝?nèi)站?夜不寤也。老人血?dú)馑?肌肉不滑,營(yíng)衛(wèi)之道澀,故晝?nèi)詹荒芫?夜不能寐也,故知老人不能寐也”“老人之寤而不寐,少壯之寐而不寤,系乎營(yíng)衛(wèi)血?dú)庵杏嗖蛔阋病?并對(duì)其病因病機(jī)做了初步論述?！鹅`樞·大惑論》則更為詳盡地闡釋了該病的發(fā)病病機(jī):“衛(wèi)氣不得入于陰,常留于陽(yáng)。留于陽(yáng)則陽(yáng)氣滿(mǎn),陽(yáng)氣滿(mǎn)則陽(yáng)蹺盛;不得入于陰則陰氣虛,故目不瞑矣?！彪m后世諸多醫(yī)家對(duì)于失眠癥的理解有了更細(xì)化的發(fā)揮和更精準(zhǔn)的理解,但失眠的發(fā)生總歸于《內(nèi)經(jīng)》所說(shuō)之陽(yáng)不入陰、營(yíng)衛(wèi)失和、臟腑失衡。

柴胡加龍骨牡蠣湯出自張仲景《傷寒論》第107條“傷寒八九日,下之,胸滿(mǎn)煩驚,小便不利,譫語(yǔ),一身盡重,不可轉(zhuǎn)側(cè)者,柴胡加龍骨牡蠣湯主之”。此類(lèi)病機(jī)以少陽(yáng)樞機(jī)失運(yùn)、三焦不暢為主的病證,當(dāng)以柴胡加龍骨牡蠣湯和解少陽(yáng)、通陽(yáng)瀉熱、重鎮(zhèn)安神[17]。小柴胡湯去甘草加龍骨、牡蠣、鉛丹、大黃、桂枝、茯苓而成的柴胡加龍骨牡蠣湯方,方中柴胡、黃芩二者合用既紓解肝氣又可除濕退熱,桂枝通陽(yáng)化氣,解表同時(shí)可助柴芩之效,龍骨、牡蠣共奏重鎮(zhèn)安神之功,合墜痰下氣者鉛丹,安神鎮(zhèn)驚效果更著,半夏、生姜和胃降逆順氣,使臥安眠好,茯苓利小便,大黃通腑,二便調(diào)和則納寐自佳,再添人參、大棗二味補(bǔ)氣養(yǎng)營(yíng)而安神,去有甘緩留邪之嫌的甘草,遂成此集升降、補(bǔ)瀉、溫清并存方,可解表里錯(cuò)雜之邪。

現(xiàn)代人或壓力過(guò)大、精神過(guò)度緊張,或暴飲暴食、飲食不合理,或久坐久臥、缺少運(yùn)動(dòng),多表現(xiàn)為情志煩躁、脾胃失和、大便不通、失眠多夢(mèng)等少陽(yáng)樞機(jī)失運(yùn)、三焦不暢之象,辨證為此之內(nèi)傷雜病皆可用去鉛丹(鉛丹由于其毒性,以類(lèi)效的磁石替代)加磁石的柴胡加龍骨牡蠣湯加減化裁。肝氣郁結(jié)或痰熱內(nèi)擾,均可引起少陽(yáng)樞機(jī)不利出現(xiàn)失眠,這是現(xiàn)代人失眠的主導(dǎo)因素。現(xiàn)代醫(yī)家也多用該方治療因氣機(jī)阻滯兼見(jiàn)情志不遂的失眠,皆有確切療效[18-22]?？紤]到現(xiàn)代人多有因工作、生活學(xué)習(xí)壓力大而致飲食不合理,以致脾胃多虛的情況,筆者在運(yùn)用柴胡加龍骨牡蠣湯原方基礎(chǔ)上,常常以黨參代人參,加大健脾力度,并稍佐酸棗仁、川芎、知母,旨在合酸棗仁湯之意兼以疏肝養(yǎng)血安神、清心除煩,從而增強(qiáng)其安神功效。

本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,柴胡加龍骨牡蠣湯化裁方確可改善小鼠的失眠現(xiàn)象,可能與其能夠促進(jìn)小鼠腦干中5-HT、5-HIAA、GABA的分泌,從而調(diào)節(jié)睡眠—覺(jué)醒有關(guān),其短期療效和酒石酸唑吡坦相當(dāng)。故臨床可據(jù)患者四診辨證,以此方化裁應(yīng)用。正常睡眠—覺(jué)醒受不同腦區(qū)多種神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)控。因大腦生理結(jié)構(gòu)的特殊性,關(guān)于失眠發(fā)生的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制大部分仍局限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究層面。本實(shí)驗(yàn)雖從神經(jīng)遞質(zhì)入手對(duì)柴胡加龍骨牡蠣湯化裁方調(diào)節(jié)失眠的可能機(jī)制進(jìn)行了初步驗(yàn)證,但仍存在一定局限性,該方的作用靶點(diǎn)是否與其余腦區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)的含量改變存在相關(guān)性尚未可知,后續(xù)還需要深層次全面化的探索。