韋信暖 楊衛(wèi)遠(yuǎn) 張麗琴 周俊香 江文星

（1 寧德師范學(xué)院附屬寧德市醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，福建 寧德 352100；2 寧德師范學(xué)院附屬寧德市醫(yī)院病理科，福建 寧德 352100）

運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)，是指反復(fù)短暫的間歇性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)能夠增強(qiáng)心臟對(duì)長(zhǎng)時(shí)間缺血缺氧的耐受性，是減輕心肌缺血損傷的有效途徑之一。一磷酸鞘氨醇（sphingosine 1-phosphate，S1P）于缺血預(yù)適應(yīng)和缺血后適應(yīng)中對(duì)心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用[1-4]。但目前關(guān)于運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)心肌保護(hù)機(jī)制尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)和力竭運(yùn)動(dòng)動(dòng)物模型，從而探討和分析運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)對(duì)大鼠心肌S1P含量的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量200～220 g。常規(guī)分籠飼養(yǎng)，5只/籠。飼養(yǎng)條件：自由飲水飲食，室溫20～22 ℃，相對(duì)濕度45%～50%，每日光照12 h。SD大鼠及其飼料由福建省吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證：SCXK（滬）2018-0006。實(shí)驗(yàn)對(duì)動(dòng)物的處理方法符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》[5]。

1.2 主要試劑 S1P、S1P1抑制劑W-146、MAPK阻滯劑PD98059以及P13K阻滯劑LY-294002均為美國(guó)GlpBio公司產(chǎn)品。原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記（TUNEL）、AnnexinV-FITC／PI試劑盒均為德國(guó)Roche公司產(chǎn)品。

1.3 分組和長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)大鼠模型的建立 將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，每日進(jìn)行15 min無(wú)負(fù)重游泳運(yùn)動(dòng)。1周后將50只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（C組5只）、運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)組（EP組5只）、運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)+S1P受體阻滯劑W146組（EP+W146組6只），運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)+P13K阻滯劑LY-294002組（EP+LY294002組6只）。C組常規(guī)飼養(yǎng)3周，其余各組大鼠以尾部負(fù)重的方式進(jìn)行間歇性游泳運(yùn)動(dòng)，負(fù)重為3%體質(zhì)量，參照Margonato等[6]的方法建立長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)動(dòng)物模型：每日進(jìn)行15 min無(wú)負(fù)重游泳運(yùn)動(dòng)，1周后以尾部負(fù)重的方式進(jìn)行間歇性游泳運(yùn)動(dòng)，泳池深40 cm，直徑50 cm，水溫（37±2）℃，尾部負(fù)重為3%體質(zhì)量，運(yùn)動(dòng)持續(xù)3周，每周6 d，逐漸增加運(yùn)動(dòng)時(shí)間，第1周運(yùn)動(dòng)30 min/d，第3周2 h/d。EP+W146組在每日運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)前10 min，腹腔注射S1P受體阻滯劑W146（20 mg/kg）；EP+LY294002組在每日運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)前10 min，腹腔注射P13K阻滯劑LY294002（10 mg/kg）。余處理同EP組。3周后，C組、EP組、EP+W146組、EP+LY294002組大鼠進(jìn)行一次性力竭游泳運(yùn)動(dòng)，負(fù)重為3%體質(zhì)量，3組大鼠力竭判斷標(biāo)準(zhǔn)為大鼠游泳動(dòng)作明顯失調(diào)，劃水頻率極其緩慢，連續(xù)下沉，不能再堅(jiān)持。

1.4 指標(biāo)測(cè)定方法 建模結(jié)束后30 min，將各組大鼠以體積分?jǐn)?shù)0.4%戊巴比妥鈉（10 μl/g）腹腔麻醉后，呈仰臥位固定，迅速開(kāi)胸取心臟，吸干血液，進(jìn)行稱重，經(jīng)預(yù)冷的滅菌生理鹽水清洗后，研磨成漿后一部分用S1P ELISA試劑盒檢測(cè)大鼠心肌組織S1P的含量，采用TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞調(diào)亡改變。

采用酶聯(lián)免疫法按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)大鼠心肌S1P的含量，試劑盒購(gòu)于武漢云克隆公司，測(cè)定儀器為美國(guó)博騰公司的BioTek檢測(cè)儀。心肌細(xì)胞凋亡的測(cè)定：心肌細(xì)胞凋亡測(cè)定采用脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL），實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)流程進(jìn)行。光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)凋亡心肌細(xì)胞的胞核呈熒光綠，正常心肌細(xì)胞的胞核呈藍(lán)色。每組隨機(jī)取切片5張，每張切片隨機(jī)取視野5個(gè)（×400），在光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)算心肌細(xì)胞的凋亡指數(shù)。心肌凋亡指數(shù)=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)數(shù)據(jù)以表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同干預(yù)后各組大鼠心臟重量比較 與C組相比，EP+LY294002組大鼠心臟重量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；EP組也較C組減輕，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與EP組相比，EP+W146組，大鼠心臟重量增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。EP+W146組大鼠心臟重量高于EP組、EP+LY294002組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 不同干預(yù)后大鼠心臟重量、心肌S1P含量及心肌細(xì)胞凋亡比較

2.2 不同干預(yù)后大鼠心肌S1P含量比較 與C組相比，EP組S1P含量升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；EP組、EP+PD98059組、EP+LY294002組心肌S1P含量均高于C組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

2.3 不同干預(yù)后大鼠心肌細(xì)胞凋亡染色結(jié)果 心肌細(xì)胞凋亡染色：C組可見(jiàn)廣泛分布的大量凋亡心肌細(xì)胞；EP組可見(jiàn)凋亡心肌細(xì)胞散在分布；EP+W146組可見(jiàn)少量的凋亡心肌細(xì)胞；EP+LY294002組可見(jiàn)較多的凋亡心肌細(xì)胞。見(jiàn)圖1。心肌凋亡指數(shù)圖像分析顯示：與C組相比，EP組、EP+W146組、EP+LY294002組心肌凋亡指數(shù)下降（P＜0.05）；與EP組相比，EP+W146組、EP+LY294002組心肌凋亡指數(shù)上升（P＜0.05）；與EP+W146組相比，EP組心肌凋亡指數(shù)下降（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

圖1 不同干預(yù)后大鼠心肌細(xì)胞凋亡染色結(jié)果

3 討論

心血管系統(tǒng)疾病患病率逐年上升，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量，對(duì)于有效的預(yù)防心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展顯得極為重要，心臟康復(fù)任重道遠(yuǎn)，而運(yùn)動(dòng)處方作為心血管康復(fù)的五大處方之一，具有極為關(guān)鍵的作用。運(yùn)動(dòng)處方中最主要的就是有氧運(yùn)動(dòng)，有關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究表明，有氧運(yùn)動(dòng)可增加骨骼肌細(xì)胞S1P釋放，細(xì)胞外的S1P可通過(guò)激活骨骼肌的衛(wèi)星細(xì)胞刺激成肌細(xì)胞的分化，且SIP具有促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞修復(fù)的功能及維持骨骼肌細(xì)胞應(yīng)對(duì)運(yùn)動(dòng)等刺激時(shí)的正常生理功能[7]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EP+W146組與EP組相比力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心肌S1P含量明顯減少、心臟重量明顯增加，且EP組力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心肌細(xì)胞凋亡較EP+W146組力竭運(yùn)動(dòng)大鼠明顯減少，均提示S1P對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠的心肌起保護(hù)作用。其機(jī)制可能是通過(guò)促進(jìn)骨骼肌的S1PR的表達(dá)發(fā)揮肌肉的生物學(xué)作用，如興奮-收縮偶聯(lián)、增強(qiáng)線粒體的功能從而促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞的對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的適應(yīng)能力從而發(fā)揮保護(hù)作用[8]。體外大鼠的實(shí)驗(yàn)也表明，外源性S1P可促進(jìn)體外培養(yǎng)的大鼠骨骼肌成肌細(xì)胞增殖，而其作用可能與細(xì)胞內(nèi)SphK活性增加引起細(xì)胞內(nèi)S1P生成增多相關(guān)[9]。而運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致S1P含量升高的機(jī)制可能是，通過(guò)運(yùn)動(dòng)增加血漿中S1P含量增加，進(jìn)而導(dǎo)致骨骼肌中S1P含量增加，以及由于運(yùn)動(dòng)促進(jìn)了血管內(nèi)皮細(xì)胞S1P的釋放[8,10-11]。

既往文獻(xiàn)報(bào)道，S1P可影響JAK2/STAT3信號(hào)通路[12]、PI3K/Akt信號(hào)通路[13]等從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。亦有研究報(bào)道，可通過(guò)誘導(dǎo)心肌Nrf2/Keap1通路增加抗氧化酶含量，來(lái)改善力竭所致心功能降低及缺血損傷，從而發(fā)揮保護(hù)心肌的作用[14]。亦有研究表明，S1P可能是通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)，來(lái)有效抑制冠心病大鼠心肌細(xì)胞凋亡[15]。本研究結(jié)果提示，EP+PI3K抑制劑LY294002ZU組力竭運(yùn)動(dòng)大鼠S1P含量少于EP組，且細(xì)胞凋亡也明顯高于EP組，提示PI3K/Akt通路參與了運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)對(duì)力竭大鼠心肌的保護(hù)作用。但運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)是否可能通過(guò)上述信號(hào)通路從而影響S1P的合成，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)可提高力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心肌S1P含量，其機(jī)制可能通過(guò)P13K/Akt信號(hào)通路發(fā)揮心肌保護(hù)作用。