呂小波 何水蘭 谷 葉 黃和飛 夏躍蓮 包琳藝

（1 昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南 昆明 650500；2 昆明和合醫(yī)學(xué)檢驗所，云南 昆明 650106）

兒茶酚胺是一種含有兒茶酚和胺基的神經(jīng)類物質(zhì)，是機(jī)體內(nèi)重要的信息傳遞物質(zhì)，包括去甲腎上腺素、腎上腺素、多巴胺3種物質(zhì)及其3種中間代謝物：去甲變腎上腺素、變腎上腺素和3-甲氧基酪胺。腎上腺素和去甲腎上腺素是由腎上腺髓質(zhì)、交感神經(jīng)節(jié)等部位的嗜鉻細(xì)胞分泌，是機(jī)體內(nèi)非常重要的應(yīng)激激素，也是交感神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中去甲腎上腺素能纖維的神經(jīng)介質(zhì)。多巴胺是去甲腎上腺素的前體物質(zhì)，是下丘腦和腦垂體腺中的一種關(guān)鍵神經(jīng)遞質(zhì)。兒茶酚胺是重要的、典型的腎上腺素受體激動劑，在機(jī)體內(nèi)調(diào)節(jié)交感神經(jīng)的興奮性，傳遞生理信號，參與維持心血管系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的基本生理功能，是正常生理過程中重要的信號介質(zhì)。在發(fā)生高血壓、甲狀腺功能亢進(jìn)、嗜鉻細(xì)胞瘤和神經(jīng)母細(xì)胞瘤等內(nèi)分泌相關(guān)疾病時，兒茶酚胺水平會出現(xiàn)明顯異常改變[1-4]。因此，重視兒茶酚胺及代謝物水平的監(jiān)測，對相關(guān)疾病的診斷、治療、預(yù)后具有重要意義。目前，實驗室常用的檢測方法有化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、色譜法等。其中化學(xué)發(fā)光法、ELISA由于靈敏度較低，在疾病早期不能檢測到微量變化，檢測具有一定局限性。而色譜質(zhì)譜法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高的優(yōu)勢，在早期即可檢測ppt數(shù)量級（1/1012）的含量，有利于疾病的早期發(fā)現(xiàn)、盡早干預(yù)，是臨床實驗室檢測維生素、激素等項目的金標(biāo)準(zhǔn)[5-6]。影響兒茶酚胺檢測結(jié)果的因素有采樣時間、采樣部位、采樣體位、反復(fù)凍融、樣本溶血等，而樣本溶血是影響檢測結(jié)果的重要因素，是通過采樣干預(yù)不能解決的問題[7]。本研究建立了6種兒茶酚胺物質(zhì)的質(zhì)譜檢測方法，并對樣本溶血因素進(jìn)行考察，探討不同溶血情況對兒茶酚胺的質(zhì)譜檢測結(jié)果產(chǎn)生的影響，為臨床實驗室檢測血漿兒茶酚胺類物質(zhì)及相關(guān)診斷提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 血液樣本的來源 30名志愿者均為昆明和合醫(yī)學(xué)檢驗所員工，無肝腎功能異常，無基礎(chǔ)疾病，無兒茶酚胺相關(guān)的高血壓等疾病，上午11：00空腹立位采血，綠帽采血管盛裝。

1.1.2 儀器與試劑 LC-MS/MS 8050CL、UV2802紫外-可見分光光度計、XA105電子天平、高速離心機(jī)、正相固相萃取儀、旋渦振蕩器、蒸餾水、甲醇、甲酸、去甲腎上腺素、腎上腺素、多巴胺、去甲變腎上腺素、變腎上腺素、3-甲氧基酪胺及同位素內(nèi)標(biāo)。

1.1.3 溶血模型的建立 按文獻(xiàn)[8]和[9]報道的方法，將取樣后的血液樣本用一次性注射器針頭渦旋攪拌3 min，或劇烈震蕩1 min，使血液樣本發(fā)生溶血。

1.1.4 血液樣本采集 30名健康志愿者，每人用2支5 mL的綠帽管靜脈采血3 mL；然后每人分別取1管血液，共計30管作為溶血對照組，另外30管作為正常對照組。30管正常對照組血液樣本采用臺式高速離心機(jī)，3 000 r/min，離心20 min，離心分離血漿備用。另外30管溶血對照組血液樣本按上述方法用一次性注射器針頭渦旋攪拌3 min，使血液樣本發(fā)生溶血采用臺式高速離心機(jī)3 000 r/min，離心20 min，離心分離血漿備用，分成2份，1份用于檢測溶血率，1份用于兒茶酚胺及代謝物的濃度測定。

1.1.5 樣本制備 ①陽性對照管：取1支正常血液樣本（2 mL），加入等體積的純化水2 mL裂解紅細(xì)胞，制備陽性對照管。②陰性對照管：用0.9%氯化鈉溶液或純化水作為陰性對照。③檢測：用紫外-可見分光光度計于545 nm檢測陽性對照管（3管）、陰性對照（3管）及溶血待測樣本的吸光度，并計算溶血率。溶血率（%）=（溶血液樣本本-陰性對照）/（陽性對照-陰性對照）[10-11]。

1.2 方法

1.2.1 生物樣本前處理 全血液樣本本3 500 r/min離心10 min，收集血漿500 μL，移液槍移取10 μL內(nèi)標(biāo)工作液至1.5 mL塑料離心管→血液樣本200 μL/質(zhì)控品→300 μL甲酸銨溶液→1 000 r/min渦旋混勻60 s→移取500 μL溶液上SPE柱（上樣之前先用200 μL甲醇、200 μL水洗滌SPE柱）→200 μL甲酸銨溶液洗滌SPE柱→200 μL甲醇溶液洗滌SPE柱→100 μL 乙腈洗脫SPE柱→收集洗脫液到2.2 mL96孔板中，上清液20 μL進(jìn)樣。

1.2.2 色譜和質(zhì)譜條件 流速0.35 mL/min，色譜柱：Agilent，C18，2.7 μm，2.1 mm×100 mm；柱溫箱40 ℃，進(jìn)樣體積20 μL，分析時間5.5 min，流動相：有機(jī)相（B）純甲醇，水相（A）（2 mmol/L甲酸銨），進(jìn)行梯度洗脫，梯度程序。見表1。電噴霧電離（ESI源），正離子掃描，采集模式：MRM掃描，儀器參數(shù)分別為：CUR：15；CAD：5；TEM：400；Gas 1：20，DP：65V；EP：12V；CE：23V；離子通道MRM分別為：去甲腎上腺素：m/z 151.7→107.1；去甲腎上腺素-IS：m/z 157.7→111.2；腎上腺素：m/z 183.8→166.2；腎上腺素-IS：m/z 186.8→169.2；多巴胺：m/z 153.7→119.2；多巴胺-IS：m/z 158.7→95.2；去甲變腎上腺素：m/z165.7→134.2；去甲變腎上腺素-IS：m/z 168.7→137.2；變腎上腺素：m/z 179.8→120.2；變腎上腺素-IS：m/z 182.8→151.2；3-甲氧基酪胺：m/z 150.7→119.10；3-甲氧基酪胺-IS：m/z 154.7→95.20。

表1 液相色譜梯度洗脫程序（%）

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以表示，比較采用雙側(cè)配對t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 分別精密稱量兒茶酚胺及代謝物標(biāo)準(zhǔn)品，并根據(jù)SOP制備相對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)系數(shù)見表2。

表2 兒茶酚胺及代謝物的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程

2.2 回收率及精密度 通過方法1.2.1步驟進(jìn)行前處理后上機(jī)分析檢測，經(jīng)分析結(jié)果顯示：兒茶酚胺3種物質(zhì)及3種中間代謝物低、中、高濃度的日內(nèi)、日間精密度RSD%均＜15%，加標(biāo)回收率均在90%～110%之間，見表3、4，均符合《中國藥典》2020版所規(guī)定的生物樣品定量分析方法驗證指導(dǎo)原則。

表3 兒茶酚胺回收率

2.3 溶血對兒茶酚胺及代謝物的影響 溶血后對照組的樣本溶血率平均為46.35%。同一組樣本溶血后，腎上腺素的含量明顯降低，多巴胺的含量明顯升高，與溶血前對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而去甲腎上腺素、去甲變腎上腺素、變腎上腺素、3-甲氧基酪胺的含量無明顯變化，與溶血前對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表5。

表5 溶血對血漿中兒茶酚胺及代謝物濃度的影響

2.4 不同溶血程度對兒茶酚胺及代謝物的影響趨勢 不同程度溶血后，腎上腺素檢測結(jié)果均明顯降低，多巴胺檢測結(jié)果均明顯升高，與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且多巴胺在中、重度溶血時升高尤其明顯，與輕度溶血組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；除了3-甲氧基酪胺在溶血前后均測不出來外，去甲腎上腺素、去甲變腎上腺素和變腎上腺素檢測結(jié)果不受溶血的影響，與正常值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表6、7。

表6 不同溶血程度對兒茶酚胺濃度影響趨勢

表7 不同溶血程度對兒茶酚胺代謝物濃度影響趨勢

3 討論

兒茶酚胺是一種內(nèi)源性的神經(jīng)遞質(zhì)，在高血壓、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、副神經(jīng)節(jié)瘤的診斷及治療中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，采用質(zhì)譜法檢測兒茶酚胺在疾病早期即可發(fā)現(xiàn)微量異常變化，有利于臨床的早期發(fā)現(xiàn)、早期干預(yù)，對相關(guān)疾病的防治具有重要的意義。溶血是在實驗室樣本檢測中比較容易發(fā)生的情況。本試驗發(fā)現(xiàn)，不同程度的溶血對2種兒茶酚胺物質(zhì)的檢測結(jié)果具有明顯影響。腎上腺素在輕、中、重度溶血后，檢測結(jié)果均明顯降低；多巴胺在不同程度溶血后檢測結(jié)果均明顯升高，在中、重度溶血時升高尤其明顯，且與輕度溶血組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義；而除了3-甲氧基酪胺在溶血前后均無法測出外，去甲腎上腺素、去甲變腎上腺素和變腎上腺素3種兒茶酚胺物質(zhì)檢測結(jié)果不受溶血的影響。造成腎上腺素和多巴胺檢測結(jié)果異常的原因分析如下：①過氧化物酶對酚羥基穩(wěn)定性的影響。腎上腺素含有3個酚羥基，極易被氧化，而溶血會導(dǎo)致紅細(xì)胞中的過氧化物酶和超氧化物歧化酶釋放到血清/血漿中，導(dǎo)致腎上腺素含量降低[12]。②溶血液樣本對多巴胺色譜分離的影響。溶血組與正常組在萃取后對比發(fā)現(xiàn)，多巴胺色譜峰略微存在分叉現(xiàn)象，可能有部分內(nèi)源性物質(zhì)與多巴胺一起流出，進(jìn)入質(zhì)譜儀后干擾了待測物質(zhì)的信號，導(dǎo)致多巴胺結(jié)果偏高。③對基質(zhì)效應(yīng)的影響。溶血會產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，可能引起離子抑制或增強(qiáng)，進(jìn)而影響物質(zhì)的定值[13]。

綜上所述，溶血對于檢測腎上腺素、多巴胺有較大影響，因此在后續(xù)臨床應(yīng)用及疾病篩查檢測過程中，需要注意實際樣本發(fā)生溶血后，及時排查并通知臨床醫(yī)師重新采樣，避免出現(xiàn)檢測結(jié)果與臨床診斷不一致的情況，為臨床兒茶酚胺的檢測和相關(guān)疾病診斷提供參考。該試驗暫未對溶血機(jī)制進(jìn)行研究，后續(xù)將進(jìn)一步試驗分析，提高臨床兒茶酚胺檢測及診斷效率。