曾清雨 湯中 李生富 唐云驄

年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）是一種常見的致盲性眼病，其通過影響視網(wǎng)膜的黃斑區(qū)域引起老年人嚴(yán)重和永久性視力障礙及失明，發(fā)生率較高，且至今無有效治療方法，極大影響患者生活質(zhì)量［1-2］。目前研究認(rèn)為視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細(xì)胞功能障礙在AMD發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，在外源性刺激或內(nèi)源性病理變化作用下，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)導(dǎo)致RPE細(xì)胞損傷，細(xì)胞凋亡增加［3-4］。

多個(gè)lncRNA和miRNA已被證實(shí)參與調(diào)控AMD發(fā)生發(fā)展，可作為AMD的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)［5-6］。其中l(wèi)ncRNA MEG3可通過靶向調(diào)控miR-93或miR-34a減輕高糖誘導(dǎo)的人RPE細(xì)胞ARPE-19凋亡和炎癥反應(yīng)［7-8］。氧化應(yīng)激也可誘導(dǎo)人RPE細(xì)胞中miR-130a-5p表達(dá)上調(diào)，提示miR-130a-5p可能參與氧化應(yīng)激相關(guān)的AMD發(fā)病機(jī)制［9］。此外，研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA MEG3可靶向調(diào)節(jié)miR-130a-5p表達(dá)［10］。基于此，本研究檢測lncRNA MEG3在AMD患者血清中的表達(dá)情況，并采用H2O2誘導(dǎo)建立人RPE細(xì)胞損傷模型，初步探究lncRNA MEG3對RPE細(xì)胞損傷的可能機(jī)制，以期為AMD研究以及治療靶點(diǎn)的選擇提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣本來源 選取2020年6月至2021年8月永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬醫(yī)院診治的AMD患者38例（38眼）為研究對象，符合《美國眼科學(xué)會年齡相關(guān)性黃斑變性臨床指南（2019）解讀》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)［11］，男20例，女18例，年齡50～80歲，平均（62.38±6.82）歲。另選取同期本院健康體檢者38例作為對照，無眼部疾病及相關(guān)家族史，男21例，女17例，年齡51～80歲，平均（62.59±7.03）歲。本研究均經(jīng)受試者知情同意并簽署知情同意書，且本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（審批號：202005001）。

1.1.2 細(xì)胞來源 人RPE細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19細(xì)胞（AC-2141H）來源于美國ATCC公司，使用含10%胎牛血清和雙抗（青霉素和鏈霉素）的DMEM完全培養(yǎng)基重懸，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每兩天換液一次，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.1.3 主要試劑 過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）（88597）購自美國Millipore公司；lncRNA MEG3過表達(dá)載體（pcDNA3.1-lncRNA MEG3）和空載體對照（pcDNA3.1-NC）、miR-130a-5p模擬物（miR-130a-5p mimics）和陰性對照（miR-NC）由上海吉瑪公司提供；MTT試劑盒（IBO1079G）購自江西艾博因公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒（11402ES60）購自上海翌圣公司；RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation，RIP）試劑盒（RIP-12RXN）購自中國Sigma-aldrich公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒（A003-1-2、A001-3-2）購自南京建成生物工程研究所；白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（EH0201、AQ-H0302-B、FN-EH4494）購自武漢菲恩生物科技有限公司；膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）∕碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡檢測試劑盒（AD10-2）購自日本同仁公司；ROS檢測試劑盒（ab113851）及兔抗人核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）、血紅素氧合酶1（heme oxygenase 1，HO-1）、β-肌動蛋白（β-actin）、Argonaute2（Ago2）、IgG抗體（ab62352、ab52947、ab8227、ab156870、ab109489）購自英國Abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RPE細(xì)胞損傷模型的構(gòu)建 將處于對數(shù)生長期的ARPE-19細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板（5 000個(gè)∕孔），待細(xì)胞貼壁后根據(jù)蘇途等［12］的方法和前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果添加不同濃度的H2O2（0 μmol∕L、100 μmol∕L、200 μmol∕L、400 μmol∕L、600 μmol∕L），另設(shè)僅添加培養(yǎng)液的孔為調(diào)零組，每個(gè)處理設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔添加20 μL MTT溶液（5 mg∕mL），孵育4 h后吸去上層培養(yǎng)液，每孔添加150 μL 二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），使用酶標(biāo)儀檢測各孔在490 nm波長處的吸光度（optical density，OD）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-調(diào)零組OD值）∕（對照組OD值-調(diào)零組OD值）×100%。選取細(xì)胞存活率接近50%的H2O2濃度作為ARPE-19細(xì)胞損傷造模濃度。

1.2.2 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 通過ENCORI數(shù)據(jù)庫（http：∕∕starbase.sysu.edu.cn∕）預(yù)測miR-130a-5p可能是lncRNA MEG3的靶點(diǎn)之一。將預(yù)測的lncRNA MEG3序列片段和突變片段分別插入到pmirGLO熒光素酶載體中，構(gòu)建野生型載體（lncRNA MEG3-WT）和突變型載體（lncRNA MEG3-MUT）。采用脂質(zhì)體法將所構(gòu)建的lncRNA MEG3-WT、lncRNA MEG3-MUT分別與miR-130a-5p mimic或miR-NC共轉(zhuǎn)染至ARPE-19細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行熒光素酶活性檢測，具體操作嚴(yán)格按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒說明執(zhí)行。

1.2.3 RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀實(shí)驗(yàn) 收集轉(zhuǎn)染miR-130a-5p mimic或miR-NC 48 h后的ARPE-19細(xì)胞，采用冷PBS洗滌后添加RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation，RIP）裂解緩沖液裂解。將細(xì)胞裂解物與抗Argonaute2（Ago2）抗體（1%）或IgG抗體（1%）偶聯(lián)的磁珠于4°C下孵育過夜，洗滌磁珠后使用TRIzol試劑提取磁珠結(jié)合的RNA，qRT-PCR檢測lncRNA MEG3表達(dá)水平。

1.2.4 細(xì)胞分組與處理 ARPE-19細(xì)胞分為對照組（常規(guī)培養(yǎng)，不進(jìn)行任何特殊處理）、H2O2組（200 μmol∕L H2O2處理24 h）、Vector組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NC 24 h后200 μmol∕L H2O2處理24 h）、lncRNA MEG3組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-lncRNA MEG3 24 h后200 μmol∕L H2O2處理24 h）、lncRNA MEG3+miR-NC組（共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-lncRNA MEG3和miR-NC 24 h后200 μmol∕L H2O2處理24 h）、lncRNA MEG3+miR-130a-5p組（共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-lncRNA MEG3和miR-130a-5p mimics 24 h后200 μmol∕L H2O2處理24 h），所用轉(zhuǎn)染方法為脂質(zhì)體法。

1.2.5 qRT-PCR檢測血清和細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MEG3、miR-130a-5p表達(dá)水平 分別收集每位AMD患者和健康體檢者清晨空腹靜脈血5 mL，離心后收集血清，超低溫冰箱保存，備用）。TRIzol試劑提取血清和細(xì)胞中總RNA并將其逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后以cDNA為模板配制qRT-PCR反應(yīng)體系，于qRT-PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，獲取循環(huán)閾值（Ct值）。20 μL qRT-PCR反應(yīng)體系：200 ng∕μL cDNA 2 μL，10 μmol∕L上、下游引物各1 μL（引物序列見表1，由上海吉瑪設(shè)計(jì)并合成），SYBR Green Mix 5 μL，無菌ddH2O 11 μL。反應(yīng)程序：95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算血清和細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MEG3相對表達(dá)水平（內(nèi)參基因?yàn)镚APDH），以及細(xì)胞中miR-130a-5p相對表達(dá)水平（內(nèi)參基因?yàn)閁6）。

表1 qRT-PCR所用引物序列

1.2.6 MTT法檢測細(xì)胞活性 將處于對數(shù)生長期的ARPE-19細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板（5 000個(gè)∕孔），待細(xì)胞貼壁后按照1.2.4方法處理細(xì)胞，隨后參照1.2.1中所述步驟檢測各組ARPE-19細(xì)胞存活率。

1.2.7 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 收集處理后的各組ARPE-19細(xì)胞，PBS洗滌后添加195 μL Annexin VFITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，并依次添加5 μL Annexin VFITC和10 μL PI染色液室溫避光孵育15 min，使用流式細(xì)胞儀檢測各組ARPE-19細(xì)胞凋亡率。

1.2.8 細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 收集處理后的各組ARPE-19細(xì)胞，參照ROS檢測試劑盒以及MDA、SOD測定試劑盒說明書操作，采用DCFH-DA熒光探針法檢測細(xì)胞熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長538 nm），根據(jù)熒光強(qiáng)度計(jì)算各組ARPE-19細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen，ROS）水平（標(biāo)準(zhǔn)化為對照組）；分別采用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）法、水溶性四唑鹽1（water soluble tetrazolium salt 1，WST-1）法測定各組ARPE-19細(xì)胞內(nèi)MDA、SOD水平。

1.2.9 細(xì)胞上清液中炎癥因子水平檢測 收集處理后的各組ARPE-19細(xì)胞上清液，參照IL-6、TNF-α、Aβ ELISA試劑盒說明操作，采用ELISA法檢測各組ARPE-19細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α、Aβ水平。

1.2.10 Western blot檢測細(xì)胞中Nrf2∕HO-1通路相關(guān)蛋白表達(dá) 收集處理后的各組ARPE-19細(xì)胞，添加裂解液于冰上充分裂解后離心，吸取上清液（即總蛋白），二辛可寧酸法定量蛋白濃度。各樣品取20 μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后將分離的蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h后加入兔抗人Nrf2（1：1000）、HO-1（1：2000）、β-actin（1：2000）抗體4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液洗滌后加入辣根過氧物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1：2000）室溫孵育30 min，磷酸鹽緩沖液洗滌后電化學(xué)發(fā)光試劑顯色。Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)量（歸一化為內(nèi)參蛋白β-actin）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA MEG3表達(dá)情況 AMD患者血清lncRNA MEG3表達(dá)水平為（0.61±0.16），低于健康體檢者（1.01±0.17），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.562，P＜0.05）。見圖1。

圖1 血清lncRNA MEG3表達(dá)情況

2.2 RPE細(xì)胞存活率及l(fā)ncRNA MEG3表達(dá)情況 與0 μmol∕L比較，100 μmol∕L、200 μmol∕L、400 μmol∕L、600 μmol∕L H2O2處理ARPE-19細(xì)胞后，細(xì)胞存活率依次降低（P＜0.05），細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MEG3表達(dá)水平亦依次下調(diào)（P＜0.05）。見圖2。當(dāng)H2O2處理濃度為200 μmol∕L時(shí)，細(xì)胞存活率最接近50%。

圖2 不同濃度H2O2處理后RPE細(xì)胞存活率和lncRNA MEG3表達(dá)水平

2.3 lncRNA MEG3與miR-130a-5p關(guān)系的驗(yàn)證ENCORI數(shù)據(jù)庫（http：∕∕starbase.sysu.edu.cn∕）預(yù)測顯示lncRNA MEG3與miR-130a-5p存在靶向結(jié)合位點(diǎn)（圖3A）。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染miR-NC比較，同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-130a-5p mimic和lncRNA MEG3-WT的細(xì)胞相對熒光素酶活性降低（P＜0.05），而同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-130a-5p mimic和lncRNA MEG3-MUT的細(xì)胞相對熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3B。RIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染miR-NC的細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染miR-130a-5p mimic的細(xì)胞中Ago2抗體富集更多的lncRNA MEG3（P＜0.05），而轉(zhuǎn)染miR-130a-5p mimic的細(xì)胞中IgG抗體富集的lncRNA MEG3差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3C。

圖3 lncRNA MEG3與miR-130a-5p的靶向關(guān)系

2.4 lncRNA MEG3和miR-130a-5p表達(dá)水平比較與對照組比較，H2O2組ARPE-19細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MEG3表達(dá)水平降低，miR-130a-5p表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與H2O2組、Vector組比較，lncRNA MEG3組ARPE-19細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MEG3表達(dá)水平升高，miR-130a-5p表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與lncRNA MEG3組、lncRNA MEG3+miR-NC組比較，lncRNA MEG3+miR-130a-5p組ARPE-19細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MEG3表達(dá)水平降低，miR-130a-5p表達(dá)水平升高（P＜0.05）；H2O2組和Vector組、lncRNA MEG3組和lncRNA MEG3+miR-NC組ARPE-19細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MEG3、miR-130a-5p表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4。

圖4 各組RPE細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MEG3和miR-130a-5p表達(dá)水平比較

2.5 細(xì)胞活性和凋亡情況比較 與對照組比較，H2O2組ARPE-19細(xì)胞存活率降低，凋亡率升高（P＜0.05）；與H2O2組、Vector組比較，lncRNA MEG3組ARPE-19細(xì)胞存活率升高，凋亡率降低（P＜0.05）；與lncRNA MEG3組、lncRNA MEG3+miR-NC組比較，lncRNA MEG3+miR-130a-5p組ARPE-19細(xì)胞存活率降低，凋亡率升高（P＜0.05）；H2O2組和Vector組、lncRNA MEG3組和lncRNA MEG3+miR-NC組ARPE-19細(xì)胞存活率、凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5、6。

圖5 流式細(xì)胞儀檢測RPE細(xì)胞凋亡

圖6 各組RPE細(xì)胞存活率和凋亡率比較

2.6 氧化應(yīng)激情況比較 與對照組比較，H2O2組ARPE-19細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA水平升高，SOD水平降低（P＜0.05）；與H2O2組、Vector組比較，lncRNA MEG3組ARPE-19細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA水平降低，SOD水平升高（P＜0.05）；與lncRNA MEG3組、lncRNA MEG3+miR-NC組比較，lncRNA MEG3+miR-130a-5p組ARPE-19細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA水平升高，SOD水平降低（P＜0.05）；H2O2組和Vector組、lncRNA MEG3組和lncRNA MEG3+miR-NC組ARPE-19細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA、SOD水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖7。

圖7 各組RPE細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA、SOD水平比較

2.7 炎癥反應(yīng)情況比較 與對照組比較，H2O2組ARPE-19細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α、Aβ水平升高（P＜0.05）；與H2O2組、Vector組比較，lncRNA MEG3組ARPE-19細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α、Aβ水平降低（P＜0.05）；與lncRNA MEG3組、lncRNA MEG3+miR-NC組比較，lncRNA MEG3+miR-130a-5p組ARPE-19細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α、Aβ水平升高（P＜0.05）；H2O2組和Vector組、lncRNA MEG3組和lncRNA MEG3+miR-NC組ARPE-19細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α、Aβ水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖8。

圖8 各組RPE細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α、Aβ比較

2.8 Nrf2∕HO-1通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較 與對照組比較，H2O2組ARPE-19細(xì)胞中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與H2O2組、Vector組比較，lncRNA MEG3組ARPE-19細(xì)胞中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與lncRNA MEG3組、lncRNA MEG3+miR-NC組比較，lncRNA MEG3+miR-130a-5p組ARPE-19細(xì)胞中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；H2O2組和Vector組、lncRNA MEG3組和lncRNA MEG3+miR-NC組ARPE-19細(xì)胞中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖9。

圖9 各組RPE細(xì)胞中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)

3 討論

隨著全球人口老齡化加劇，AMD已成為導(dǎo)致老年群體失明的重要原因之一，為患者和社會帶來了沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，確定AMD的潛在治療靶點(diǎn)、早期規(guī)范治療對于AMD預(yù)后改善至關(guān)重要。研究表明，lncRNA（如lncRNA TUG1、lncRNA MALAT1、lncRNA MEG3）可影響RPE細(xì)胞功能，調(diào)節(jié)正常視覺功能，并可能導(dǎo)致視網(wǎng)膜功能障礙［13］。Sun等［14］發(fā)現(xiàn)lncRNA MEG3可通過miR-7-5p∕Pax6軸維持RPE分化，從而對AMD發(fā)揮保護(hù)作用，表明lncRNA MEG3可能是AMD治療中的一個(gè)保護(hù)性治療靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，lncRNA MEG3在AMD患者血清中低表達(dá)，提示lncRNA MEG3可能在AMD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

RPE介導(dǎo)的氧化應(yīng)激廣泛參與AMD發(fā)病機(jī)理和進(jìn)程，H2O2作為一種強(qiáng)氧化劑，通常在體外實(shí)驗(yàn)中用于誘導(dǎo)RPE細(xì)胞氧化損傷［15-16］。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度H2O2處理ARPE-19細(xì)胞均可降低細(xì)胞存活率，且當(dāng)H2O2處理濃度為200 μmol∕L時(shí)，細(xì)胞存活率最接近50%，故而后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇200 μmol∕L H2O2處理ARPE-19細(xì)胞進(jìn)行造模。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2誘導(dǎo)后細(xì)胞存活率、SOD水平降低，而細(xì)胞凋亡率及ROS、MDA、IL-6、TNF-α、Aβ水平升高。氧化應(yīng)激是ROS大量產(chǎn)生和積累的結(jié)果，且ROS作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)生成MDA，而SOD是抗氧化酶［17］。IL-6、TNF-α是促炎細(xì)胞因子，氧化應(yīng)激可促進(jìn)RPE細(xì)胞分泌更多的IL-6、TNF-α，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷［18］。Aβ亦可作為一種炎癥因子，其在眼內(nèi)大量聚集，可直接損傷RPE細(xì)胞，已被證實(shí)是AMD發(fā)病機(jī)制的重要啟動因子［19］。以上結(jié)果均提示H2O2誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。此外，H2O2處理可下調(diào)ARPE-19細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MEG3表達(dá)水平，上調(diào)lncRNA MEG3可減輕H2O2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞損傷，這進(jìn)一步證實(shí)了lncRNA MEG3在RPE細(xì)胞損傷中的保護(hù)作用［14］。

本研究中，H2O2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MEG3表達(dá)下調(diào)的同時(shí)，發(fā)現(xiàn)miR-130a-5p表達(dá)水平上調(diào)，這與Ayaz等［9］研究結(jié)果一致。推測lncRNA MEG3、miR-130a-5p可能通過某種機(jī)制參與調(diào)控RPE細(xì)胞損傷。經(jīng)ENCORI數(shù)據(jù)庫（http：∕∕starbase.sysu.edu.cn∕）分析以及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和RIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)人RPE細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MEG3與miR-130a-5p存在靶向關(guān)系。此外，上調(diào)H2O2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MEG3表達(dá)可降低miR-130a-5p表達(dá)，且上調(diào)miR-130a-5p表達(dá)可部分減弱上調(diào)lncRNA MEG3表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞損傷的減輕作用。提示上調(diào)lncRNA MEG3可靶向負(fù)調(diào)控miR-130a-5p表達(dá)減輕H2O2誘導(dǎo)的人RPE細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，保護(hù)RPE細(xì)胞免受損傷。

Nrf2∕HO-1通路是重要的抗氧化應(yīng)激通路，氧化應(yīng)激狀態(tài)下，調(diào)節(jié)氧化還原平衡的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Nrf2被活化后與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，上調(diào)下游HO-1等抗氧化因子，提高SOD等抗氧化酶的活性，從而減弱氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，抑制細(xì)胞凋亡［20-21］。本研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)lncRNA MEG3可升高H2O2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平，且上調(diào)miR-130a-5p表達(dá)亦可部分減弱上調(diào)lncRNA MEG3表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平的影響。提示Nrf2∕HO-1通路參與lncRNA MEG3靶向負(fù)調(diào)控miR-130a-5p對H2O2誘導(dǎo)的人RPE細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。Luo等［7］研究顯示，lncRNA MEG3、Nrf2在高糖處理的人RPE細(xì)胞中均降低，lncRNA MEG3通過miR-93∕Nrf2軸抑制高糖誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞凋亡和炎癥。

綜上所述，lncRNA MEG3在AMD患者血清中低表達(dá)，上調(diào)lncRNA MEG3可靶向負(fù)調(diào)控miR-130a-5p表達(dá)，激活Nrf2∕HO-1通路，減輕H2O2誘導(dǎo)的人RPE細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，保護(hù)RPE細(xì)胞免受損傷。本研究為AMD發(fā)病機(jī)制研究以及治療靶點(diǎn)的選擇提供了新的思路。但miR-130a-5p是直接還是間接作用于Nrf2∕HO-1通路尚不清楚；此外，miR-130a-5p下游靶基因眾多，參與人RPE細(xì)胞損傷的lncRNA MEG3∕miR-130a-5p∕mRNA網(wǎng)絡(luò)仍有待挖掘。