曹建剛 李存玲 劉 陽(yáng) 毛儀楠 陳再民 陳鵬博

（陜西省商洛市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，陜西 商洛 726000）

黑木耳又稱(chēng)木耳、光木耳、云耳、樹(shù)耳、木娥等，為擔(dān)子菌門(mén)、木耳目、木耳科、木耳屬真菌[1]。陜西省商洛市一直將食用菌產(chǎn)業(yè)列為脫貧攻堅(jiān)、鄉(xiāng)村振興的重點(diǎn)特色產(chǎn)業(yè)，2022 年以來(lái)更是將食用菌產(chǎn)業(yè)列為“菌果藥畜茶酒”六大特色產(chǎn)業(yè)之首，食用菌作為助推商洛市鄉(xiāng)村振興的“大產(chǎn)業(yè)”，發(fā)展黑木耳產(chǎn)業(yè)是重中之重。商洛市2020年袋栽木耳1.05億袋，干品產(chǎn)量5 270 t，產(chǎn)值5.2 億元；2021 年栽培木耳1.41億袋，干品產(chǎn)量5 600 t，產(chǎn)值5.4億元；2022年栽培木耳1.55 億袋，干品產(chǎn)量7 600 t，產(chǎn)值7.3 億元。商洛市現(xiàn)有規(guī)模化木耳生產(chǎn)基地87處，木耳生產(chǎn)大棚3600 個(gè)，年產(chǎn)1 000 萬(wàn)袋以上的菌包生產(chǎn)線7 條，木耳生產(chǎn)企業(yè)20 多家，合作社35 個(gè)，木耳產(chǎn)業(yè)從業(yè)人員5 000 多人。以柞水縣、山陽(yáng)縣、商州縣、鎮(zhèn)安縣為主，輻射全市的木耳產(chǎn)業(yè)布局已基本形成，商洛木耳產(chǎn)業(yè)得到高質(zhì)量快速發(fā)展，“小木耳”切實(shí)做成“大產(chǎn)業(yè)”，為商洛市鞏固脫貧攻堅(jiān)成果與推動(dòng)鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略全面實(shí)施發(fā)揮重要作用。

商洛市要做大做強(qiáng)黑木耳產(chǎn)業(yè)，推動(dòng)商洛市木耳產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展，加快黑木耳種質(zhì)創(chuàng)新，做強(qiáng)農(nóng)業(yè)“芯片”（黑木耳優(yōu)良新品種選育）為首要任務(wù)。商洛市地處秦嶺腹地，野生黑木耳種質(zhì)資源豐富，采集馴化黑木耳野生菌株，既可以快速解決商洛市主栽黑木耳品種短缺、依賴(lài)外省品種的問(wèn)題，也可以為黑木耳雜交育種提供有效的種質(zhì)資源[2]。為此筆者對(duì)采自陜西省商洛市丹鳳縣、山陽(yáng)縣的兩株秦嶺野生黑木耳進(jìn)行組織分離、分子生物學(xué)鑒定及栽培試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

（1）供試菌株：丹鳳野生黑木耳菌株，采自商洛市丹鳳縣巒莊鎮(zhèn)老林溝林場(chǎng)（圖1）；山陽(yáng)野生黑木耳菌株，采自山陽(yáng)縣小河口鎮(zhèn)小河口街村山坡；對(duì)照菌株為黑威15，商洛市主栽品種，商洛市農(nóng)科所食用菌研究室保存。

圖1 野生黑木耳（拍攝地丹鳳縣）生態(tài)照

（2）供試培養(yǎng)基：①綜合馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）為馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，KH2PO43 g，MgSO41.5 g，自來(lái)水定容至1 000 mL。②原種（栽培種）培養(yǎng)料配方為木屑85%，麩皮12%，白糖1%，石膏1%，石灰1%。料含水量58%～60%。③栽培袋培養(yǎng)料配方為木屑80%，麩皮15%，豆粕3%，石膏1%，石灰1%。料含水量58%～60%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 子實(shí)體形態(tài)觀察

取完整子實(shí)體部分，觀察并描述其表面性狀、結(jié)構(gòu)、顏色，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征初步鑒定[3]。

1.2.2 野生菌株的組織分離及菌種的制備

取干耳泡24 h，用75%酒精浸泡2～3 min，用無(wú)菌水反復(fù)清洗干凈后，再用濾紙吸干表面水分，用剪刀將耳片剪成小耳片，用接種針挑取小耳片至PDA 平板，26 ℃培養(yǎng)，待分離組織長(zhǎng)出菌絲后純化1～2 次轉(zhuǎn)入PDA 斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，即可獲得母種。母種接種到原種培養(yǎng)基上發(fā)菌后至長(zhǎng)滿(mǎn)袋即可獲得原種（栽培種）。

1.2.3 野生黑木耳菌株ITS全序列分析

將丹鳳野生黑木耳菌株、山陽(yáng)野生黑木耳菌株分別轉(zhuǎn)管培養(yǎng)，挑選純化、生長(zhǎng)健壯的兩株野生黑木耳菌株送往上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行ITS全序列分析與分子生物學(xué)鑒定。

1.2.4 拮抗試驗(yàn)

將兩株野生黑木耳菌株與對(duì)照菌株黑威15 兩兩拮抗培養(yǎng)試驗(yàn)（26 ℃下黑暗培養(yǎng)），觀察拮抗反應(yīng)。3次重復(fù)。

1.2.5 野生黑木耳菌株菌絲培養(yǎng)特性觀察

1.2.5.1 PDA平板培養(yǎng)菌絲觀察

將供試菌株分別接至PDA 平板（直徑9 cm），26 ℃下黑暗培養(yǎng)，測(cè)定菌絲生長(zhǎng)速度及記錄長(zhǎng)勢(shì)。母種菌絲生長(zhǎng)速度（cm/d）=菌絲培養(yǎng)皿內(nèi)直線生長(zhǎng)量（cm）/菌絲生長(zhǎng)天數(shù)（d）。母種（栽培袋）菌絲生長(zhǎng)速度采用Microsoft Excel 2021 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SAS 8.0進(jìn)行方差分析和Duncan檢測(cè)。

1.2.5.2 原種料袋菌絲生長(zhǎng)觀察

將供試菌株母種接種至原種料袋，26 ℃下黑暗培養(yǎng)，每個(gè)菌株各15袋。觀察并記錄菌絲長(zhǎng)勢(shì)及抗雜能力。

1.2.5.3 栽培料袋菌絲生長(zhǎng)觀察

將供試菌株原種接種至栽培料袋（塑料袋規(guī)格為16 cm×37 cm×0.0036 cm），26 ℃下黑暗培養(yǎng)，每個(gè)菌株各100袋。測(cè)定菌絲生長(zhǎng)速度，記錄長(zhǎng)勢(shì)、抗雜能力。栽培袋內(nèi)菌絲生長(zhǎng)速度（cm/d）=菌絲生長(zhǎng)量（cm）/菌絲滿(mǎn)袋用時(shí)（d）。

1.2.6 出耳試驗(yàn)

栽培袋菌絲滿(mǎn)袋經(jīng)過(guò)后熟，刺孔后移至大棚內(nèi)地栽出耳。觀察記錄比較各菌株現(xiàn)芽情況、出耳表現(xiàn)，觀察子實(shí)體外觀、顏色，統(tǒng)計(jì)產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩株秦嶺野生黑木耳菌株ITS全序列分析

采用試劑盒提取基因組DNA，擴(kuò)增兩株秦嶺野生黑木耳菌株ITS 序列，可發(fā)現(xiàn)均有大小約600 bp的單一條帶，測(cè)序結(jié)果兩株秦嶺野生黑木耳菌株的ITS 序列大小均為576 bp（圖2）。通過(guò)BLAST 分析，丹鳳野生黑木耳菌株（Genbank 登錄號(hào)SUB13797248）與陜西理工大學(xué)Qian X T（2015）發(fā)現(xiàn)的黑木耳（KT964887.1）相似性達(dá)99.65%，為木耳屬，黑木耳；山陽(yáng)野生黑木耳菌株（Genbank 登錄號(hào)SUB13797271）與西北農(nóng)林科技大學(xué)Yu Z（2008）發(fā)現(xiàn)的黑木耳（EU520194.1）相似性達(dá)99.83%，為木耳屬，黑木耳。

圖2 兩株野生菌株ITS-PCR瓊脂糖電泳圖

2.2 拮抗試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，丹鳳野生黑木耳菌株、山陽(yáng)野生黑木耳菌株與對(duì)照菌株黑威15均有明顯的拮抗線，丹鳳野生黑木耳菌株與山陽(yáng)野生黑木耳菌株也有明顯的拮抗線，三者之間互有拮抗反應(yīng)（圖3），說(shuō)明他們親緣較遠(yuǎn)。

表1 拮抗試驗(yàn)結(jié)果

圖3 供試黑木耳菌株拮抗反應(yīng)（左為平板正面，右為平板反面）

2.3 不同基質(zhì)菌絲培養(yǎng)特性觀察結(jié)果

由表2 可知，丹鳳野生黑木耳菌株平板培養(yǎng)菌絲潔白、濃密、整齊，山陽(yáng)野生黑木耳菌株菌絲潔白、絨毛狀、整齊；菌絲生長(zhǎng)速度，山陽(yáng)野生黑木耳菌株與黑威15差異顯著；丹鳳野生黑木耳菌株與山陽(yáng)野生黑木耳菌株、丹鳳野生黑木耳菌株與黑威15母種菌絲生長(zhǎng)速度之間的差異均不顯著。

表2 供試黑木耳菌株平板培養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)特性

由表3 可知，原種料袋內(nèi)供試黑木耳菌株菌絲顏色、長(zhǎng)勢(shì)差異不大，但丹鳳野生黑木耳菌株抗雜能力強(qiáng)，山陽(yáng)野生黑木耳菌株抗雜能力弱。

表3 供試黑木耳菌株原種培養(yǎng)結(jié)果

由表4可知，丹鳳野生黑木耳菌株、黑威15抗雜能力強(qiáng)，山陽(yáng)野生黑木耳菌株抗雜能力一般（同原種培養(yǎng)結(jié)果一致）；山陽(yáng)野生黑木耳菌株菌絲生長(zhǎng)速度顯著快于丹鳳野生黑木耳菌株及黑威15菌株。

表4 供試黑木耳菌株栽培料袋菌絲培養(yǎng)結(jié)果

2.4 出耳試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 供試黑木耳菌株催芽結(jié)果

供試黑木耳菌株栽培袋菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)袋經(jīng)過(guò)后熟，刺孔進(jìn)棚開(kāi)始集中催芽，催芽時(shí)保持溫度15～25 ℃，空氣相對(duì)濕度70%～90%，視天氣情況通風(fēng)，做到“保溫保濕小通風(fēng)”[4]。

由表5可知，山陽(yáng)野生黑木耳菌株耳基、耳芽形成快、早，整齊；丹鳳野生黑木耳菌株耳基、耳芽形成快、居中（較山陽(yáng)野生黑木耳菌株晚3～5 d），較整齊；對(duì)照黑威15菌株耳基、耳芽形成慢、晚，較整齊。

表5 供試黑木耳菌株催芽情況

2.4.2 供試黑木耳菌株產(chǎn)量及子實(shí)體性狀

由表6可知，丹鳳野生黑木耳菌株單片、耳大耳薄，顏色黃、產(chǎn)量高，抗高溫，少筋或無(wú)筋，早熟；山陽(yáng)野生黑木耳菌株單片、耳中等薄，產(chǎn)量低，不耐大水、高溫，無(wú)筋，早熟；黑威15菌株（對(duì)照）單片、個(gè)大肉厚，產(chǎn)量一般，大筋，中熟（圖4、圖5）。

表6 供試黑木耳菌株產(chǎn)量及子實(shí)體性狀

圖4 試驗(yàn)黑木耳菌株出耳狀態(tài)[自左至右為山陽(yáng)野生菌株、丹鳳野生菌株、黑威15（CK）]

圖5 人工栽培的丹鳳野生黑木耳菌株子實(shí)體（左為耳片腹面，右為耳片背面）

山陽(yáng)野生黑木耳菌株耳片腹面黑褐色，背面瓦灰色（圖6），耳狀，邊緣不規(guī)則，無(wú)筋，單耳質(zhì)量（干）0.61 g。

圖6 人工栽培的山陽(yáng)野生黑木耳菌株子實(shí)體（左為耳片腹面，右為耳片背面）

黑威15 菌株耳片腹面黑色，背面深瓦灰色（圖7），耳狀，邊緣規(guī)則，大筋，單耳質(zhì)量（干）1.01 g。

圖7 黑威15菌株子實(shí)體（左為耳片腹面，右為耳片背面）

丹鳳野生黑木耳菌株耐高溫，抗逆性強(qiáng)；黑威15 抗逆性較強(qiáng)；山陽(yáng)野生黑木耳菌株不耐高溫，抗逆性弱。

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，采自秦嶺的兩株野生黑木耳菌株經(jīng)分子生物學(xué)鑒定均為木耳屬，黑木耳。袋料栽培結(jié)果，丹鳳野生黑木耳菌株比對(duì)照黑威15 早熟、產(chǎn)量高、抗雜抗逆性強(qiáng)、耐高溫，有望成為一株性狀優(yōu)良、適于生產(chǎn)應(yīng)用的黑木耳菌株，缺點(diǎn)是顏色偏黃；山陽(yáng)野生黑木耳菌株與對(duì)照黑威15 相比，雖產(chǎn)量低、抗雜抗逆性弱、不耐大水和高溫，但其耳芽形成快、早、整齊，早熟，顏色黑，可以用作雜交選育優(yōu)良菌株親本。