薛藝佳，白 雪，付 應(yīng)，周海龍

（海南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，海口 570228）

近年來，由于人類活動(dòng)頻繁，二氧化碳排放量居高不下導(dǎo)致全球氣候變暖和環(huán)境污染，這兩大誘因?qū)е潞Ｑ笾械脱醅F(xiàn)象頻發(fā)[1]。低氧通常是指水中溶解氧濃度低于2 mg·L-1[2]。凡納濱對(duì)蝦具有抗逆性強(qiáng)、生長(zhǎng)快、繁殖期長(zhǎng)、對(duì)養(yǎng)殖條件要求低、便于運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，成為世界對(duì)蝦養(yǎng)殖的三大品種之一[3]。水體中的溶解氧是影響凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素。目前對(duì)甲殼類動(dòng)物應(yīng)激的研究主要集中在其對(duì)行為、代謝、免疫等方面。甲殼動(dòng)物對(duì)低氧脅迫的分子調(diào)控機(jī)制主要是通過在HIF-1信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路及細(xì)胞凋亡信號(hào)通路上發(fā)揮作用[4]。HIF-1作為參與低氧反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，是由HIF-1α和HIF-1β兩個(gè)亞基組成的，但HIF-1α亞基在常氧狀態(tài)下表達(dá)受到抑制，只有在生物體處于低氧環(huán)境中，HIF-1α才被激活；該亞基與β亞基共同調(diào)控低氧應(yīng)答部分基因的轉(zhuǎn)錄[5]。目前的研究成果主要是圍繞HIF-1α參與調(diào)節(jié)低氧條件下凡納濱對(duì)蝦葡萄糖代謝途徑中一些基因的表達(dá)及其相應(yīng)的生理響應(yīng)和抗病毒能力[6-13]。

無脊椎動(dòng)物缺乏特異性免疫系統(tǒng)，只能依靠血淋巴這一非特異性免疫實(shí)現(xiàn)[14]。血淋巴中的血細(xì)胞和各種免疫因子在體內(nèi)共同發(fā)揮免疫作用；其中血細(xì)胞在吞噬、包囊和結(jié)節(jié)形成等方面均發(fā)揮重要作用[15]；血藍(lán)蛋白（Hemocyanin，HC）是節(jié)肢動(dòng)物中重要的呼吸蛋白，還在酚氧化酶和抗菌抗病毒等方面發(fā)揮免疫作用[16]。在血細(xì)胞中，有許多基因調(diào)控血細(xì)胞的增殖穩(wěn)態(tài)和免疫，造血激素（Astakine，AST）通過降低細(xì)胞外TGase活性從而刺激了血細(xì)胞的釋放，在甲殼動(dòng)物中造血的重要性已被證實(shí)[17]；血細(xì)胞穩(wěn)態(tài)相關(guān)蛋白（ Hemocyte homeostasis-associated protein ，HHAP）在維持血細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，該基因表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致血細(xì)胞數(shù)減少[18]；鐵蛋白（Ferritin，F(xiàn)T）作為一種鐵清除蛋白，可以通過抑制鐵含量從而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，最終阻礙病原體的存活[17]。在蝦類血清中，酸性磷酸酶（Acid phosphatase，ACP ）和堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP）是甲殼動(dòng)物體內(nèi)吞噬溶酶體的重要組成部分，能促進(jìn)血細(xì)胞的吞噬和包裹；酚氧化酶（Phenoloxidase，PO）活化后可快速吸附在體外異物上，從而進(jìn)行識(shí)別和調(diào)節(jié) ，對(duì)于血細(xì)胞的吞噬和包裹及識(shí)別消滅體外異物發(fā)揮積極作用[19]。然而，在低氧條件下HIF-1α對(duì)凡納濱對(duì)蝦的免疫性能的影響尚不清楚，且血細(xì)胞作為無脊椎動(dòng)物重要的免疫系統(tǒng)，特別是在低氧脅迫條件下，凡納濱對(duì)蝦血淋巴中HIF-1α對(duì)各項(xiàng)免疫指標(biāo)的影響有待深入研究[20]。因此，本研究著重探討了HIF-1α在低氧脅迫下對(duì)凡納濱對(duì)蝦血淋巴在免疫反應(yīng)中的影響，旨在為凡納濱對(duì)蝦的免疫性能研究及其健康養(yǎng)殖提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 凡納濱對(duì)蝦（ L. vannamei）于2022年3月份取自海南省東方市海南中正水產(chǎn)科技有限公司，選擇質(zhì)量為（13.0 ± 2.0）g的健康對(duì)蝦作為實(shí)驗(yàn)對(duì)蝦。實(shí)驗(yàn)前，在100 L的水族箱中馴養(yǎng)7 d，水體鹽度、溫度和pH分別為（35.0 ± 1.0）‰、（25.0 ± 0.5）℃和 7.9 ± 0.2，水體溶氧濃度為（6.5 ± 0.5） mg·L-1。馴養(yǎng)結(jié)束后，在水族箱中隨機(jī)挑選72尾凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑和儀器 試劑：TRIzol? 試劑購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；PrimeSTAR?HS DNA Polymerase、TB Green? Premix Ex Taq?II（Tli RNaseH Plus）、PrimeScript? 1st Strand cDNA Synthesis Kit、PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、in vitro Transcription T7 Kit（for siRNA Synthesis）均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。SanPrep 柱式 DNA膠回收試劑盒、PBS購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；酶活試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所有限公司。儀器：高通量組織研磨器（Scientz-48），低溫離心機(jī)（Eppendorf），微量分光光度計(jì)（Thermo nanodrop 2000），PCR儀（Bio-rad T100），電泳儀（Bio-rad），凝膠成像分析系統(tǒng)（Biorad Gel Doc XR+），熒光定量PCR儀（AnalytikqTOEWER3），恒溫水浴鍋，溶氧儀（ HANNA，HI 9146），pH 計(jì)（ HANNA，HI 8424），鹽度計(jì)，溫度計(jì)，氮?dú)夤蕖?/p>

1.3 引物合成 本實(shí)驗(yàn)的qRT-PCR引物（表1）通過primer5.0設(shè)計(jì)，并全部由合成生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 實(shí)驗(yàn)用引物

1.4 dsRNAHIF-1α的合成 利用T7 RNA Polymerase進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，以含有T7 Promoter序列的HIF-1α雙鏈DNA為模板，可以對(duì)Promoter下游的DNA序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，高效合成單鏈RNA。并按照說明書通過 DNase I 降解 DNA 模板和純化轉(zhuǎn)錄RNA。使用 NanoDrop 微量分光光度計(jì)和 1% 瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)dsRNA 的純度和濃度，并將一部分送去生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序驗(yàn)證片段的正確性，剩余純化 dsRNA儲(chǔ)存在 -20 ℃?zhèn)溆?。用于體外轉(zhuǎn)錄的PCR 片段來源于文獻(xiàn)[8]，1個(gè) 580 bp 片段對(duì)應(yīng)于編碼序列的位置 243～822，GenBank 登錄號(hào) FJ807918。

1.5 注射dsRNA和采集樣品 將合成的dsRNA溶于1×PBS，每100 μL PBS中含有13 μg dsRNA。將制備好的dsRNA溶液注射至凡納濱對(duì)蝦腹部肌肉，保證1 g蝦注射1 μg dsRNA，為干擾組；將注射100 μL 1×PBS的凡納濱對(duì)蝦作為對(duì)照組。注射后，為了使dsRNA充分發(fā)揮作用，且盡可能讓對(duì)蝦消除注射應(yīng)激效應(yīng)，將2組對(duì)蝦放回常氧水體中觀察24 h，再進(jìn)行常氧組的血淋巴采集。實(shí)驗(yàn)設(shè)置常氧組[（6.5 ± 0.5） mg·L-1]和低氧組[（2.0 ±0.5 ）mg·L-1]，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。低氧脅迫實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，先向缸中通入大量氮?dú)鈦韺?shí)現(xiàn)急性低氧，待溶氧濃度到達(dá)2.0 mg·L-1時(shí)，減少氮?dú)獾妮斎肓?，再通過調(diào)節(jié)水體中充入氮?dú)夂涂諝獾谋壤S持溶氧濃度，并且每隔30 min使用HANNA溶氧儀監(jiān)測(cè)溶解氧濃度。低氧脅迫實(shí)驗(yàn)持續(xù)12 h，分別在3、6、12 h進(jìn)行低氧組血淋巴的采集，用提前加入抗凝劑（30 mmol·L-1檸檬酸三鈉，0.34 mol·L-1氯化鈉，10 mmol·L-1EDTA，0.115 mol·L-1葡萄糖）的注射器從蝦圍心腔中采集血淋巴樣品，置于冰上備用，每組采集3尾實(shí)驗(yàn)蝦。

1.6 血細(xì)胞計(jì)數(shù)以及血藍(lán)蛋白濃度測(cè)定 血細(xì)胞計(jì)數(shù)使用血球計(jì)數(shù)板，在血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室中加10 μL的血淋巴，然后用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)。將血淋巴在4℃，352 r·min-1條件下離心10 min，取100 μL上清液并添加2 900 μL緩沖液（50 mmol·L-1Tris）。用紫外分光光度計(jì)（1 cm光通）在335 nm處測(cè)定其OD值，根據(jù)公式E335nm（ g·L-1）= 2. 3×OD 值（式中，E335nm為血藍(lán)蛋白濃度，2. 3 為消光系數(shù)）計(jì)算血藍(lán)蛋白濃度。

1.7 RNA的提取及熒光定量 PCR 檢測(cè) 向1.6實(shí)驗(yàn)中血淋巴離心后的沉淀中加入Trizol試劑提取凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞的總RNA，并按說明書用反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備 cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 擴(kuò)增體系：TB Green Premix ExTaqII（Tli RNaseH Plus）（2×） 10.0 μL, 上、下游引物（10 μmol·L-1）各0.8 μL，cDNA模板1.0 μL，滅菌水7.4 μL，總體系共20.0 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃，30 s; 40個(gè)（95℃, 5 s; 60 ℃，30 s）循環(huán)；繪制融解曲線。選擇L8作為內(nèi)參基因，基因表達(dá)水平采用 2 -ΔΔCt 法進(jìn)行計(jì)算[21]。

1.8 ACP、AKP、PO酶活的測(cè)定 ACP、AKP、PO酶活的測(cè)定均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測(cè)定，具體操作按其說明書進(jìn)行。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析 用 SPSS Statistics 23 軟件進(jìn)行方差分析，并利用 GraphPad Prism 9.0 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 低氧條件下凡納濱對(duì)蝦HIF-1α的表達(dá) 在低氧脅迫第0、3、6、12 h，通過 RT-qPCR 檢測(cè)凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá)水平(圖1)。在低氧0 h（常氧狀態(tài)）時(shí)，干擾組較對(duì)照組HIF-1α的表達(dá)水平下降了80.1%，這說明實(shí)驗(yàn)中HIF-1α的敲低對(duì)凡納濱對(duì)蝦有顯著的影響（P＜ 0.05）。隨著低氧持續(xù)時(shí)間的增加，對(duì)照組HIF-1α的表達(dá)水平呈升高的趨勢(shì)。低氧0 h（常氧狀態(tài)）和低氧持續(xù)12 h組之間有顯著性差異（P＜ 0.05）；干擾組HIF-1α的表達(dá)水平在低氧過程中無顯著性差異（P＞ 0.05）。

圖1 敲低HIF-1α后低氧脅迫下凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞HIF-1α的相對(duì)表達(dá)量

2.2 低氧條件下凡納濱對(duì)蝦的血細(xì)胞數(shù)和血藍(lán)蛋白濃度 圖2表明，凡納濱對(duì)蝦的血細(xì)胞數(shù)在低氧0 h（常氧狀態(tài)）時(shí)干擾組較對(duì)照組顯著降低（P＜0.05），說明HIF-1α的敲低對(duì)血細(xì)胞數(shù)有顯著的影響；對(duì)照組隨著低氧時(shí)間的增加血細(xì)胞數(shù)顯著下降（P＜ 0.05），而干擾組無顯著差異（P＞ 0.05）。對(duì)照組血藍(lán)蛋白含量在低氧脅迫下較干擾組有著顯著升高（P＜ 0.05）；對(duì)照組血藍(lán)蛋白的濃度隨著低氧持續(xù)時(shí)間的增加而上升（P＜ 0.05），干擾組無顯著差異（P＞ 0.05）。

圖2 敲低HIF-1α后低氧脅迫下凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞數(shù)和血藍(lán)蛋白濃度

2.3 低氧條件下凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞免疫相關(guān)基因的表達(dá)情況 圖3表明了低氧條件下敲低HIF-1α基因后，其免疫相關(guān)基因AST、HHAP和FT的表達(dá)情況。對(duì)照組AST基因的表達(dá)在低氧脅迫下無顯著性變化，干擾組基本呈先升后降的趨勢(shì)（P＜0.05），在低氧持續(xù)3 h時(shí)到達(dá)頂點(diǎn)。在低氧脅迫下HHAP基因的表達(dá)對(duì)照組差異不顯著，而干擾組基本呈上升后小幅度下降的趨勢(shì)（P＜ 0.05），且在低氧持續(xù)3h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高；FT基因的表達(dá)在低氧脅迫下對(duì)照組和干擾組無顯著差異（P＞0.05），兩組在低氧脅迫初期就顯著降低（P＜0.05），后期有小幅度恢復(fù)的趨勢(shì)（P＞ 0.05）。

圖3 敲低HIF-1α后低氧脅迫下凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞AST、HHAP和FT的相對(duì)表達(dá)量

2.4 低氧條件下凡納濱對(duì)蝦的免疫相關(guān)酶活力的變化 圖4表明了低氧脅迫下凡納濱對(duì)蝦血清的ACP、AKP、PO酶活力變化情況。對(duì)照組在血清中ACP活力變化的趨勢(shì)呈先升高后降低的趨勢(shì)（P＜ 0.05），在低氧持續(xù)6 h到達(dá)頂點(diǎn)，而干擾組無顯著性差異（P＞ 0.05）；對(duì)照組和干擾組在血清中AKP活力先升高后降低，在低氧持續(xù)6 h到達(dá)頂點(diǎn)，兩組間無顯著性差異（P＞ 0.05）；對(duì)照組在血清中PO活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)（P＞ 0.05），而干擾組的PO活力在低氧脅迫也有降低的趨勢(shì)（P＞ 0.05），在低氧持續(xù)6 h時(shí)，對(duì)照組的PO活力較干擾組有顯著提高（P＜ 0.05）。

圖4 敲低HIF-1α后低氧脅迫下凡納濱對(duì)蝦血淋巴ACP、AKP和PO的活力影響

3 討 論

凡納濱對(duì)蝦作為無脊椎動(dòng)物不具備完善的免疫系統(tǒng)，只能依靠非特異性免疫防御，包括細(xì)胞防御和體液防御2種類型，且此2種防御體系緊密聯(lián)系[22]。細(xì)胞防御包括血細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬、結(jié)節(jié)形成和包裹，而體液防御涉及酚氧化酶原激活系統(tǒng)、凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)和免疫相關(guān)蛋白（如抗菌肽、抗病毒肽、蛋白酶和蛋白酶抑制劑）的活性[23]。

根據(jù)HIF-1α的表達(dá)水平，結(jié)合凡納濱對(duì)蝦的血細(xì)胞和血淋巴的生理指標(biāo)可以綜合評(píng)判HIF-1α在低氧脅迫中發(fā)揮的免疫調(diào)控作用。在低氧和注射dsHIF-1α的雙重作用處理下12 h后，雙鏈RNA 成功抑制了凡納濱對(duì)蝦中HIF-1α的表達(dá)水平。對(duì)蝦血細(xì)胞可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞和體液反應(yīng)（包括凝血和溶解病原體以及傷口愈合）來抵抗病原體[22]。有研究表明低氧脅迫會(huì)減少凡納濱對(duì)蝦的血細(xì)胞數(shù)[24]，而實(shí)驗(yàn)中干擾組的血細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組顯著降低，證明敲低HIF-1α基因可以通過調(diào)控凡納濱對(duì)蝦的血細(xì)胞數(shù)量，且比低氧脅迫的影響更為明顯。血藍(lán)蛋白是重要的呼吸蛋白，在結(jié)合和運(yùn)輸氧的過程中發(fā)揮著重要作用[25]，且血藍(lán)蛋白作為無脊椎動(dòng)物血淋巴的主要蛋白質(zhì)，在非特異性免疫尤其是抗病毒例如對(duì)蝦白斑綜合征病毒（WSSV）發(fā)揮著重要作用[26]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明低氧脅迫會(huì)促進(jìn)凡納濱對(duì)蝦血藍(lán)蛋白濃度的升高[27]，而敲低HIF-1α基因使低氧脅迫下血藍(lán)蛋白濃度無顯著變化（P＞0.05）。結(jié)果表明，低氧脅迫下HIF-1α的敲低對(duì)于血細(xì)胞和血藍(lán)蛋白免疫功能具有抑制作用。

此外，AST和HHAP作為免疫相關(guān)基因在實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出顯著的差異表達(dá)，而對(duì)照組和干擾組的FT基因表達(dá)無顯著差異。當(dāng)生物體被外界病原體感染后會(huì)導(dǎo)致造血細(xì)胞數(shù)量急劇下降，AST對(duì)于維持甲殼類動(dòng)物的免疫功能至關(guān)重要[28]，本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，干擾組中AST的表達(dá)水平顯著升高，這與在擬穴青蟹中的結(jié)果一致[29]。因AST基因具有促進(jìn)血細(xì)胞增殖分化的作用，干擾組AST基因的顯著升高可能與血細(xì)胞數(shù)降低有直接關(guān)系。除了AST基因，在對(duì)蝦中還發(fā)現(xiàn)有HHAP基因參與造血調(diào)控，該蛋白在造血組織中高表達(dá)[30]，通過注射特異性雙鏈RNA敲低黑虎蝦的HHAP基因30 h導(dǎo)致100%的死亡率，血細(xì)胞的數(shù)量顯著減少且發(fā)生了嚴(yán)重?fù)p傷，表明HHAP基因在血細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[18,31]。本實(shí)驗(yàn)中凡納濱對(duì)蝦HIF-1α基因的敲低導(dǎo)致血細(xì)胞數(shù)的大幅降低或是提高HHAP表達(dá)的誘因之一，結(jié)果表明凡納濱對(duì)蝦HIF-1α的表達(dá)影響其造血功能。鐵蛋白是一種細(xì)胞溶質(zhì)鐵儲(chǔ)存蛋白，它可以在其內(nèi)核中隔離多達(dá) 4 500 個(gè)鐵離子，以保護(hù)細(xì)胞免受鐵的毒性作用[32]。通過注射鐵蛋白可以提高凡納濱對(duì)蝦的血細(xì)胞數(shù)、PO活力和呼吸爆發(fā)[33]，而且敲低FT也會(huì)導(dǎo)致WSSV的感染率增加[34]，表明FT參與了其免疫功能。對(duì)照組和干擾組的FT表達(dá)雖無顯著差異，但低氧脅迫會(huì)導(dǎo)致FT表達(dá)的顯著下降從而影響凡納濱對(duì)蝦的免疫功能。

ACP作為溶酶體中的標(biāo)志酶，在酸性環(huán)境下ACP能夠通過水解表面帶有磷酸酯的異物從而預(yù)防感染，還可以通過修飾外來異物的表面識(shí)別系統(tǒng)從而增強(qiáng)血細(xì)胞對(duì)體內(nèi)外來病原體的識(shí)別[35]，從而提高吞噬細(xì)胞消滅體內(nèi)異物的速度[36]。AKP參與磷酸基團(tuán)的代謝，在鈣吸收和磷酸鈣沉積過程中發(fā)揮重要作用，可以加速物質(zhì)的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)[37]。本研究結(jié)果表明，敲低凡納濱HIF-1α基因在低氧持續(xù)6 h時(shí)發(fā)現(xiàn)血清中的ACP的活力有明顯的下降，而AKP的活力則無顯著變化。PO 以酶原的形式存在于大顆粒細(xì)胞和小顆粒細(xì)胞的顆粒中，在無脊椎動(dòng)物中有愈合傷口、參與非特異性免疫的功能[38]。本實(shí)驗(yàn)中敲低HIF-1α基因在低氧條件下會(huì)使PO活力降低，在低氧持續(xù)6 h時(shí)有顯著差異。3種免疫相關(guān)酶在低氧條件下對(duì)照組整體上有升高的趨勢(shì)，這與文獻(xiàn)[39]研究結(jié)果一致。由此可見，低氧脅迫下敲低HIF-1α基因降低了部分免疫相關(guān)酶的活力。