于燕燕，夏影影，吳可建，占昭宏，陶 均

（海南大學 熱帶作物學院/海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點實驗室，?？?570228）

稻屬黃單胞菌水稻致病變種（Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo）是水稻白葉枯病病原菌，通過水孔或氣孔進入水稻維管束，并在此大量繁殖、堵塞維管束，嚴重影響了水稻（Oryza sativa）的產(chǎn)量[1]。生命活動的進行依賴于蛋白質(zhì)活性的精細調(diào)控，在此過程中蛋白質(zhì)空間構象不斷改變從而實現(xiàn)蛋白質(zhì)活性變化[2]。蛋白構型變化直接改變蛋白質(zhì)的空間構象和功能，但蛋白質(zhì)的剛性肽鍵不能自由旋轉(zhuǎn)，需要在肽基脯氨酰順反異構酶（peptidyl-prolyl cis-trans isomerase, PPIase）的作用下才能從反式構型轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定性更高的順式構型[3]。PPIase分為三類，即FK506結合蛋白（FK506 Binding Proteins, FKBP）、親環(huán)蛋白和細蛋白[4-5]，它們加速目標蛋白質(zhì)的正確折疊，是蛋白質(zhì)折疊過程中的限速酶[6-8]。由PPIase介導的蛋白折疊變構是生命活動的必需過程，在動物、植物和微生物的生命活動中均起到非常重要作用[9-15]。例如，在幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori）中，PPIase調(diào)控鎳轉(zhuǎn)運蛋白活性，調(diào)節(jié)細胞的鎳穩(wěn)態(tài)[16]；擬南芥（Arabidopsis thaliana）親環(huán)蛋白AtCYP71通過控制蛋白順反異構調(diào)控器官形成過程中的染色質(zhì)重構[17]；免疫親和素CYP28可能通過其PPIase活性調(diào)控由光系統(tǒng)II（PSII）復合體與光捕獲復合體II（LHCII）組成的PSII-LHCII超復合體（SCs）的組裝和積累[18]。在柑橘黃單胞菌（Xanthomonas citri）與柑橘（Citrus reticulata）的互作中，柑橘黃單胞菌TAL效應蛋白PthAs通過抑制柑橘親環(huán)素CsCyp對RNA聚合酶Ⅱ的異構化，激活宿主的轉(zhuǎn)錄，增強柑橘的潰瘍病變[19]。這些結果表明，PPIase在生物體生長發(fā)育和應對外界環(huán)境中發(fā)揮重要作用。但XooPPIase的功能及其在致病過程中的作用尚無報道。因此，筆者通過體外酶活測定分析了XppI是否具有PPIase活性，通過構建xppI突變體及其互補菌株分析了XppI是否調(diào)控Xoo的致病力，還分析了xppI突變是否影響Xoo的胞外酶含量、運動性及抗氧化能力，期望解析XppI調(diào)控病原菌致病力的機制，為白葉枯病害的防治提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 植物、菌株及質(zhì)粒 供試植物是水稻（Oryza sativa）‘TP309’，本實驗所使用的菌株和質(zhì)粒如表1所示。

表1 菌株和質(zhì)粒來源

1.2 引物 實驗所用引物見表2。

表2 實驗引物

1.3 XppI蛋白的體外表達與純化 以Xoo野生型菌株PXO99A基因組為模板，以xppIqeF/xppIqeR為引物，擴增xppI基因片段，BamHI/HindIII酶切后連接到相同酶切的pQE80L載體上，測序驗證正確后獲得XppI-His融合表達載體pQE80L-xppI，然后將pQE80L-xppI轉(zhuǎn)化BL21（DE3）細胞[23]。菌株37 ℃過夜培養(yǎng)后，按1∶100體積比轉(zhuǎn)接到500 mL的新鮮溶菌肉湯（Luria Bertani, LB）液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至OD600達0.6～0.8后，加入250 μL 1 mol·L-1異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropylbeta-D-thiogalactopyranoside, IPTG），并于25 ℃、90 r·min-1條件下誘導培養(yǎng)5～6 h。4 ℃離心收集菌體后進行超聲破碎（超聲功率比40%、超聲5 s、間隙5 s、總時間10 min），取上清，SDS-PAGE電泳觀察蛋白誘導表達情況。將目的蛋白按照BEAVER公司的BeaverBeadsTMIDA-Nickel Kit 試劑盒（Cat. No. 70501-K10）進行純化，SDS-PAGE檢測純化效果。

1.4 XppI蛋白的異構酶活性檢測 通過糜蛋白消化法測定XppI蛋白的異構酶活性。將25 μL XppI-His蛋白（25 μmol·L-1）、25 μL 糜蛋白酶（5 g·L-1）、145 μL 50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液（pH7.5）和10 μL 1 g·L-1的底物N-Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide混勻加入96孔板中，以BSA蛋白作為對照，25 ℃下測量反應液在390 nm處的吸光值變化[24]。

1.5 敲除突變體和互補菌株構建 基因敲除：以PXO99A基因組為模板，擴增xppI基因上下游片段，分別用HindIII/BamHI,BamHI/EcoRI酶切上下游片段，然后再連接到HindIII/EcoRI酶切的pK18mobSacB上，獲得敲除載體pK18-xppI。電擊轉(zhuǎn)化pK18-xppI至PXO99A中，經(jīng)過2步同源重組方法獲得突變體菌株ΔxppI[23]。

基因互補：以PXO99A基因組為模板，擴增xppI基因片段，HindIII/EcoRI酶切后克隆到相同酶切的廣宿主載體pHMⅠ，獲得互補載體pHMⅠ-xppI。電擊轉(zhuǎn)化pHMⅠ和pHMⅠ-xppI進ΔxppI感受態(tài)細胞，獲得ΔxppI-pHMⅠ及互補菌株CΔxppI菌株[23]。

1.6 黃單胞菌的生長表型測定 馬鈴薯蔗糖瓊脂（Potato Saccharose Agar, PSA）培養(yǎng)基中28 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)野生型、突變體和互補菌株36 h，稀釋菌液OD600至0.5±0.005。（1）按1∶1 000(體積比)的比例轉(zhuǎn)接到50 mL新鮮PSA液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)，每隔2.5 h 測OD600值直至穩(wěn)定期；（2）將菌液進行10倍梯度稀釋，點接PSA（蛋白胨 10 g·L-1，蔗糖 10 g·L-1，谷氨酸鈉1 g·L-1，瓊脂 15 g·L-1）與M4M（Na2HPO4.2H2O 7.52 g·L-1，KH2PO43 g·L-1，檸檬酸鈉 0.5 g·L-1，（NH4）2SO41 g·L-1，酶水解干酪素 2 g·L-1，MgSO4.7H2O 0.2 g·L-1，葡萄糖 2 g·L-1，瓊脂 15 g·L-1）固體培養(yǎng)基，28 ℃靜止培養(yǎng)48～72 h，觀察3種菌株之間生長是否有差異。

1.7 致病力分析 野生型、突變體和互補菌株在PSA培養(yǎng)基中28 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)36 h，將菌液OD600調(diào)至1.0，剪葉法接種60 d齡的‘TP309’水稻葉片，每種菌株至少接種10片葉片，14 d 后觀察并測量病斑長度[25]。

1.8 胞外纖維素酶、淀粉酶和蛋白酶活性檢測PSA培養(yǎng)基中28 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)野生型、突變體和互補菌株36 h，調(diào)OD600至1.0，分別取2 μL不同菌液接種到含0.5% 羧甲基纖維素、0.1% 可溶性淀粉或2% 脫脂奶粉的PSA固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3 d。用0.1%剛果紅染色含纖維素的平板30 min，再用1 mol·L-1NaCl的溶液洗2次，每次10 min，觀察水解圈直徑（cm）；用1∶100的 I2/KI（0.08 mol·L-1I2，3.2 mol·L-1KI）溶液染色含淀粉的平板 10 min，觀察水解圈直徑（cm）；直接觀察脫脂奶粉的水解圈（cm）[26]。

1.9 游動性檢測 PSA培養(yǎng)基中28 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)野生型、突變體和互補菌株36 h，調(diào)OD600至1.0，用無菌牙簽分別蘸取菌液10 s后，垂直接種于游動培養(yǎng)基（0.03% 蛋白胨，0.03% 酵母提取物，0.25% 瓊脂）中并立即拔出。在28 ℃培養(yǎng)箱中正置培養(yǎng)4 d，測量菌體游動圈的直徑（cm）[27]。

1.10 蠕動性檢測 取上述稀釋菌液2 μL等間距接種到蠕動性培養(yǎng)基（1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，2%葡萄糖，0.6%瓊脂）表面上，在28 ℃培養(yǎng)箱中正置培養(yǎng)4 d，測量菌圈的直徑（cm）[27]。

1.11 過氧化氫脅迫耐受性分析 PSA培養(yǎng)基中28 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)野生型、突變體和互補菌株36 h，調(diào)OD600至0.5±0.05，分別加入80 mmol·L-1、100 mmol·L-1、120 mmol·L-1（終濃度）的H2O2，混勻后靜置處理30 min。取1 mL處理好的菌液離心并用無菌ddH2O洗2遍后進行梯度稀釋點板。在28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3 d，觀察不同處理菌的生長情況并拍照[28]。

2 結果與分析

2.1 體外分析XppI是否具有肽基脯氨酰順反異構酶（PPIase）活性 為分析Xoo基因組是否編碼PPIase，利用大腸桿菌PPIase SlyD（NP_417808.1）搜索Xoo蛋白組，共獲得了2個同源蛋白，XppI和XopAZ。XopAZ為預測的Ⅲ型效應蛋白，XppI功能未知。為驗證XppI是否為PPIase，首先在大腸桿菌中表達并純化XppI蛋白（圖1-A）；然后利用α-糜蛋白酶耦聯(lián)法[25]測定其PPIase活性。如圖1-B所示，XppI蛋白存在時，反應產(chǎn)物的吸光值（A390）顯著升高；但BSA存在時，吸光值沒有顯著變化，這表明XppI具有PPIase活性。

2.2XppI對Xoo生長的調(diào)控作用 為了分析XppI是否調(diào)控Xoo的生長繁殖與致病力，首先構建了xppI的突變體ΔxppI及其互補菌株C-ΔxppI。為了更好地分析，野生型PXO99A和ΔxppI也轉(zhuǎn)入空載體pHMⅠ。比較3個菌株（PXO99A-pHMⅠ、ΔxppI-pHMⅠ和C-ΔxppI）在PSA液體培養(yǎng)基中生長情況。結果顯示，野生型、突變體及互補菌株生長沒有顯著差異（圖2-A）。由于細菌在不同類型培養(yǎng)基上的生長情況可能不同，將3種菌株梯度稀釋后分別點在豐富性培養(yǎng)基PSA和基本培養(yǎng)基M4M上進行生長對比實驗。結果如圖2-B所示，這3個菌株在PSA和M4M固體培養(yǎng)基上的生長同樣沒有明顯差異。因此，正常情況下XppI不調(diào)控Xoo生長。

圖2 XppI不調(diào)控Xoo的生長

2.3xppI突變對Xoo致病力的影響 PPIase調(diào)控多種蛋白構型變化，可能影響病原菌的致病力。因此將野生型、突變體和互補菌株接種水稻葉片，14 d后的病斑表型如圖3所示。與野生型相比，xppI突變菌株致病力顯著降低，互補xppI后，部分恢復了致病力，說明XppI正調(diào)控Xoo的致病力。

圖3 XppI調(diào)控Xoo致病性

2.4xppI突變對Xoo運動能力的影響 病原菌的運動能力是其致病的重要決定因素，在侵染初期具有重要作用[29-30]。通過細菌游動性和蠕動性實驗分析，發(fā)現(xiàn)野生型、突變體和互補菌株的運動能力均無明顯區(qū)別（圖4），說明XppI并不調(diào)控細菌鞭毛和菌毛的運動能力。

圖4 xppI突變不影響Xoo的運動能力

2.5xppI突變對Xoo胞外酶活性的影響 病原菌分泌的胞外酶可降解植物細胞壁，有利于病原菌的成功入侵[31]。通過比較xppI突變體菌株、互補菌株及野生型菌株各種胞外酶活性發(fā)現(xiàn)，xppI突變并沒有引起這些胞外蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶活性變化（圖5），由此推測XppI并不通過調(diào)控胞外酶的活性或分泌來影響Xoo的致病力。

圖5 xppI突變不影響多種胞外酶的活性

2.6xppI突變對Xoo抗氧化能力的影響 氧化-抗氧化系統(tǒng)在植物與病原菌的互作過程中具有重要作用。活性氧（reactive oxygen species, ROS）在植物的生長和免疫方面均具有重要作用，植物在病原菌入侵的質(zhì)膜附近會產(chǎn)生高濃度的ROS來毒害病原菌，并引發(fā)一系列防御反應，同時病原菌也進化出了降解酶來降低高濃度活性氧的影響[32]。為探究XppI是否參與氧化脅迫響應，分別用0、80 、100 、120 mmol·L-1的H2O2處理菌液，觀察生長情況。隨著H2O2濃度的增強，野生型、突變體和互補菌株的抗氧化脅迫能力均呈現(xiàn)降低的趨勢，但是突變xppI后抗氧化脅迫能力明顯降低，互補xppI后抗氧化脅迫能力有所回升，但仍略低于野生型（圖6）。這說明XppI與病原菌的抗氧化脅迫響應有關。

圖6 xppI突變降低Xoo抗氧化能力

3 討 論

本研究旨在探究XppI在Xoo中的功能。通過生物信息學預測XppI為肽基脯氨酰順反異構酶，并通過糜蛋白消化實驗驗證了XppI具有肽基脯氨酰順反異構酶活性（圖1）。在大腸桿菌中，肽基脯氨酰順反異構酶SlyD影響雙組份調(diào)控系統(tǒng)活性，slyD缺失降低耐酸性和耐滲透壓能力，從而降低了大腸桿菌對環(huán)境的適應能力[33]。在釀酒酵母中，肽基脯氨酰順反異構酶Fpr3與蛋白磷酸酶1相互作用，影響酵母的生長速率[34]。在人細胞中，肽基脯氨酰順反異構酶Pin1是糖尿病血管疾病關鍵通路的共同激活因子，可通過誘導促氧化適配器p66的線粒體易位引起線粒體氧化應激，并參與p66依賴的ROS產(chǎn)生，觸發(fā)有害途徑并導致血管并發(fā)癥[35]。在Xcc8 004中，肽基脯氨酰順反異構酶MipXcc是周質(zhì)折疊因子，負責胞外蛋白酶PrtA的正確折疊，突變mipXcc后Xcc幾乎喪失胞外蛋白酶[36]。此外，延伸因子LepA也具有脯氨酰異構酶活性，通過異構化核糖體L11蛋白、促進GTP的水解[37]。肽基脯氨酰順反異構酶的調(diào)控功能多樣，在細菌生長、抗脅迫、抗氧化和胞外酶合成等方面發(fā)揮重要作用。

為探究Xoo中肽基脯氨酰順反異構酶XppI的具體功能，本研究從細菌的生長、胞外酶活性、抗氧化能力等方面進行了研究，發(fā)現(xiàn)xppI基因缺失對于菌體本身的生長、運動性和胞外酶活性無顯著影響（圖2，圖4和圖5），與Xcc和酵母中的表型不同[35-36]，表明不同PPIases可能調(diào)控不同蛋白的構型變化進而調(diào)控不同的細胞活動。xppI缺失導致Xoo抗氧脅迫能力的降低（圖6），降低Xoo的致病力（圖3），這與Pin的功能類似[35]。因此，XppI可能通過其PPIase活性、調(diào)控Xoo響應宿主活性氧脅迫，從而間接調(diào)控Xoo的致病力。

在植物與病原微生物互作的過程中，植物的免疫系統(tǒng)會響應被入侵部位的活性氧信號，來抑制病原菌的入侵；與此同時植物病原菌需要清除活性氧，來破壞植物防衛(wèi)反應的信號傳遞并降低活性氧對自身的毒害作用[38]?；钚匝醯那宄饕揽砍趸锲缁负瓦^氧化氫酶等清除酶的作用，XppI可能直接或間接調(diào)控這些酶的活性。下一步將尋找XppI的作用靶標，明確XppI的具體調(diào)控通路及作用機制。