劉子嶺，石耀華，鄭 興，顧志峰

（1. 海南大學(xué) 海洋學(xué)院，海口 570228; 2. 海南大學(xué) 南海海洋資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?570228）

方斑東風(fēng)螺（Babylonia areolata）隸屬蛾螺科（Buccinidae）、東風(fēng)螺屬（Babylonia），是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的海洋腹足類動(dòng)物，廣泛分布于印度洋-太平洋的熱帶和亞熱帶海域[1-2]。在我國，方斑東風(fēng)螺養(yǎng)殖區(qū)主要分布于福建、廣東和海南等[3]。由于其經(jīng)濟(jì)價(jià)值高、生長速度快，方斑東風(fēng)螺深受水產(chǎn)養(yǎng)殖從業(yè)者的青睞，并被認(rèn)為是具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ酿B(yǎng)殖品種。目前，我國的方斑東風(fēng)螺年產(chǎn)量已超過1.25萬t[4]。近年來，由于其自然資源被過度開發(fā)，人們開始不斷探索方斑東風(fēng)螺的育苗和養(yǎng)成技術(shù)，其產(chǎn)業(yè)規(guī)模也隨之不斷擴(kuò)大。目前，方斑東風(fēng)螺的養(yǎng)殖方式主要為水泥池流水養(yǎng)殖，這種養(yǎng)殖方式雖然簡單高效，但是依然伴隨著養(yǎng)殖水質(zhì)不穩(wěn)定和病害多發(fā)的問題[5-6]，而采用工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖模式進(jìn)行方斑東風(fēng)螺的養(yǎng)殖可以加強(qiáng)對(duì)養(yǎng)殖水質(zhì)和養(yǎng)殖動(dòng)物的疾病管控，還可以進(jìn)行高密度養(yǎng)殖，提高單位面積的產(chǎn)量[7-8]。利用循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)進(jìn)行方斑東風(fēng)螺的養(yǎng)殖，主要是通過物理過濾、生物過濾、曝氣和泵吸等方式實(shí)現(xiàn)對(duì)養(yǎng)殖用水的循環(huán)利用。由于在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中，溫度、鹽度、pH和溶解氧等水質(zhì)指標(biāo)可控性較強(qiáng)，可以實(shí)現(xiàn)高密度養(yǎng)殖。在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)與流水養(yǎng)殖系統(tǒng)中，不同規(guī)格的稚螺對(duì)生存空間的需求不相同[9]。因此，選擇合理的養(yǎng)殖密度是關(guān)鍵問題。有研究表明，在流水條件下，一般東風(fēng)螺稚螺的中間培育密度為1.0×104～2.0×104只·m-2[10]。故本實(shí)驗(yàn)以2×104只·m-2的密度為基準(zhǔn)設(shè)置了1.2×104、1.8×104、2.4×104和3.0×104只·m-24個(gè)密度梯度，以探索較為適宜的方斑東風(fēng)螺循環(huán)水中間培育密度，旨在為后續(xù)的方斑東風(fēng)螺循環(huán)水中間培育技術(shù)提供參考。

1 材料方法

1.1 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)及實(shí)驗(yàn)螺 實(shí)驗(yàn)在海南省海洋與漁業(yè)科學(xué)院（瓊海基地）進(jìn)行。方斑東風(fēng)螺循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)由養(yǎng)殖單元和水處理單元組成，水處理單元包括袋式過濾器（過濾精度為10 μm）和生物濾池（濾料為珊瑚骨和細(xì)菌屋）等設(shè)備。

養(yǎng)殖池為正方形玻璃鋼養(yǎng)殖桶（1 m×1 m×0.9 m），底部鋪設(shè)底濾板，在底濾板上方固定0.25 mm的聚乙烯塑料網(wǎng)箱，將網(wǎng)箱3等分為3個(gè)獨(dú)立的養(yǎng)殖單元，每個(gè)養(yǎng)殖單元配備2個(gè)氣石，并在網(wǎng)箱底部鋪設(shè)厚度約為1～2 cm的泥沙。生物濾池為直徑0.6 m，高0.65 m的聚乙烯塑料圓桶，生物濾池濾料為珊瑚骨與細(xì)菌屋，按照1∶1的比例（質(zhì)量比）組成生物濾池。物理過濾設(shè)備為精度10 μm的精密過濾器，養(yǎng)殖單元水體為700 L，生物濾池水體為100 L。日循環(huán)量為7.2 m3。

實(shí)驗(yàn)所用方斑東風(fēng)螺稚螺，購自海南坤田海洋生物科技有限公司，螺苗個(gè)體起始質(zhì)量為（0.023±0.006） g，起始?xì)らL為（4.58±0.75） mm，起始?xì)挒椋?.72±0.48） mm，大小均勻，健康無傷。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)分為4組，依次編號(hào)為D1～D4，分別對(duì)應(yīng)養(yǎng)殖密度為1.2×104、1.8×104、2.4×104和3.0×104只·m-2，每組3個(gè)重復(fù)。

在每天的上午8:00進(jìn)行投喂，投喂的餌料為新鮮的牡蠣（Ostreidae）肉，每日的投喂餌料量約為螺苗體質(zhì)量的30%。在養(yǎng)殖過程中，每4 h用海水將爬出水面的稚螺沖至水面以下，實(shí)驗(yàn)時(shí)長為30 d（2022-09-13—2022-10-13）。

每天觀察稚螺的運(yùn)動(dòng)和攝食情況，每5天取1次養(yǎng)殖池中的水樣和底質(zhì)樣品，并于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)測量稚螺殼長、殼寬、體質(zhì)量和存活率。

1.3 樣品采集 養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束后，將各組的稚螺經(jīng)過24 h饑餓處理后稱重、計(jì)數(shù)，從每個(gè)養(yǎng)殖單元中隨機(jī)取樣10只，將稚螺的殼外泥沙沖洗干凈，敲碎螺殼，取出螺肉，放入凍存管中，立即將其放入液氮中進(jìn)行速凍，然后放入超低溫冰箱中（-80 ℃）保存，用于酶活檢測。

稱取新鮮底質(zhì)10 g（精確至0.1 g）放于250 mL三角瓶中，加100 mL氯化鉀溶液（2 mol·L-1），用橡皮塞塞緊，振蕩30 min，立即過濾于100 mL三角瓶中，用于底質(zhì)銨態(tài)氮（NH4+-N）檢測。

稱取新鮮底質(zhì)10 g放入100 mL三角瓶中，加入0.1 g硫酸鈣和50 mL水，塞蓋后振蕩10 min，靜置5 min，過濾上清液，用于底質(zhì)亞硝態(tài)氮（NO2--N）和底質(zhì)硝酸態(tài)氮（NO3--N）的測定。

1.4 酶活指標(biāo)的測定 稚螺體內(nèi)的α-淀粉酶（α-Amylase, AMS）、脂肪酶（Lipase, LPS）、胃蛋白酶（Pepsin, PPS）、過氧化氫酶（Catalase, CAT）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）和丙二醛（Malondialdehyde, MDA）水平使用南京建成生物技術(shù)研究所生產(chǎn)α-淀粉酶測試盒（Catalog No.C016-1-1）、脂肪酶測定試劑盒（Catalog No. A054-2-1）、胃蛋白酶測定試劑盒（Catalog No. A080-1-1）、過氧化氫酶測定試劑盒（Catalog No. A007-1-1）、總超氧化物歧化酶測定試劑盒（Catalog No.A001-3-2）和丙二醛測定試劑盒（Catalog No.A003-1-2），并按照試劑盒內(nèi)詳細(xì)說明書的檢測步驟進(jìn)行。

1.5 水質(zhì)指標(biāo)的檢測 系統(tǒng)中的水質(zhì)銨態(tài)氮（NH4+-N）、亞硝態(tài)氮（NO2--N）、硝酸態(tài)氮（NO3--N）以及底質(zhì)銨態(tài)氮（NH4+-N）、亞硝態(tài)氮（NO2--N）、硝酸態(tài)氮（NO3--N）的測定均參照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行[11]。

1.6 數(shù)據(jù)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。使用DPS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），設(shè)P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 方斑東風(fēng)螺稚螺在不同密度下的生長性能和存活率對(duì)比 從表1可知，養(yǎng)殖密度對(duì)稚螺的終末殼長有顯著影響（P＜0.05），其中，D1組最高［（11.18±1.08） mm］，D4組最低［（8.91±0.83）mm］。養(yǎng)殖密度對(duì)稚螺的日平均生長速度有顯著影響（P＜0.05），其中，D1組最高［（0.22±0.04）mm·d-1］，D4組最低[（0.14±0.03） mm·d-1］。養(yǎng)殖密度對(duì)稚螺的殼長增長率有顯著影響（P＜0.05），其中，D1組最高［（144.10±24.58）%］，D4組最低［（94.54±18.12）%］。養(yǎng)殖密度對(duì)稚螺的存活率也有顯著影響（P＜0.05），其中，D2組最高[（94.77±2.18）%]，D4組最低［（57.84±1.90）%］。

2.2 不同密度組的水質(zhì)對(duì)比 如圖1所示，養(yǎng)殖密度對(duì)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水質(zhì)的NH4+-N濃度高峰有顯著影響（P＜0.05）。D1、D2、D3組的NH4+-N濃度在第5天時(shí)到達(dá)峰值，D4組的NH4+-N濃度在第10天時(shí)到達(dá)峰值。NH4+-N濃度峰值隨養(yǎng)殖密度的升高而顯著升高（P＜0.05），其中，D4組的NH4+-N濃度峰值最高，為（1.21±0.12）mg·L-1，D1組的NH4+-N濃度峰值最低，為（0.50±0.05）mg·L-1。

圖1 不同密度下銨態(tài)氮濃度變化

如圖2所示，養(yǎng)殖密度對(duì)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水質(zhì)的NO2--N濃度高峰有極顯著影響（P＜0.01）。各實(shí)驗(yàn)組的均在實(shí)驗(yàn)第25天迎來了NO2--N濃度的高峰，且NO2--N濃度的峰值隨養(yǎng)殖密度的升高而顯著升高（P＜0.01）。其中D4組最高，為（1.90±0.18） mg·L-1，D1組最低，為（0.18±0.02） mg·L-1。

圖2 不同密度下的亞硝酸態(tài)氮濃度變化

如圖3所示，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，NO3--N不斷積累，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，D1、D2、D3、D4各組的NO3--N濃度分別為（0.50±0.05）、（0.52±0.05）、（0.54±0.03）和（0.54±0.02）mg·L-1。

圖3 不同密度下的硝酸態(tài)氮濃度變化

如圖4所示，養(yǎng)殖密度對(duì)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)底質(zhì)NH4+-N濃度高峰有極顯著影響（P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)各組在實(shí)驗(yàn)第5天迎來第一次底質(zhì)NH4+-N濃度高峰，其中D3組最高為（0.74±0.06） mg·L-1，D1組最低，為（0.31±0.03） mg·L-1。在實(shí)驗(yàn)第25天，各實(shí)驗(yàn)組迎來第二次底質(zhì)NH4+-N濃度高峰，其中D4組最高，為（1.38±0.14） mg·L-1，D1組最低，為（0.42±0.04） mg·L-1。

圖4 不同密度下中底質(zhì)銨態(tài)氮的濃度變化

如圖5所示，養(yǎng)殖密度對(duì)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)底質(zhì)NO2--N濃度高峰有極顯著影響（P＜0.01）。D2、D3、D4組的底質(zhì)NO2--N濃度于第25天達(dá)到峰值，而D1組的底質(zhì)NO2--N濃度并未出現(xiàn)底質(zhì)NO2--N濃度高峰。其中D3組峰值最高，為（0.15±0.02）mg·L-1，D2組峰值最低，為（0.052±0.005 ）mg·L-1。

圖5 不同密度下底質(zhì)亞硝酸態(tài)氮的濃度變化

如圖6所示，各實(shí)驗(yàn)組中的底質(zhì)NO3--N不斷積累，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，D1、D2、D3、D4各組的底質(zhì)NO3--N濃度分別為（0.034±0.003）、（0.074±0.007）、（0.066±0.007）和（0.084±0.008） mg·L-1。

圖6 不同密度下底質(zhì)硝酸態(tài)氮的濃度變化

2.3 方斑東風(fēng)螺稚螺在不同密度下的消化酶活性對(duì)比 如圖7所示，養(yǎng)殖密度對(duì)稚螺AMS、LPS以及PPS的活力具有極顯著影響（P＜0.01）。稚螺體內(nèi)的AMS活力隨養(yǎng)殖密度的提高而顯著降低（P＜0.01），其中D1組最高，為（10.30±1.02）U，D4組最高，為（3.64±0.61）U。稚螺體內(nèi)的LPS活力隨養(yǎng)殖密度的提高而顯著降低（P＜0.01），其中D1組最高，（4.14±0.28）U，D4組最高，為（1.93±0.31）U。稚螺體內(nèi)的LPS活力隨養(yǎng)殖密度的提高而顯著降低（P＜0.01），其中D1組最高，（13.52±0.70）U，D4組最高，為（3.38±0.99）U。

圖7 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)不同密度下稚螺的消化活性

2.4 方斑東風(fēng)螺稚螺在不同密度下的抗氧化酶活性對(duì)比 如圖8所示，養(yǎng)殖密度對(duì)稚螺SOD、CAT以及MDA的活力具有極顯著影響（P＜0.01）。稚螺體內(nèi)的SOD活力隨養(yǎng)殖密度的提高而顯著提高（P＜0.01），其中D4組最高，為（61.67±1.11）U，D2組最低，為（49.54±2.94）U。稚螺體內(nèi)的CAT活力隨養(yǎng)殖密度的提高而顯著提高（P＜0.01），其中D3組最高，為（70.23±2.6）U，D2組最低，為（56.56±3.94）U。稚螺體內(nèi)的MDA活力隨養(yǎng)殖密度的提高而顯著提高（P＜0.01），其中D3組最高，為（10.12±1.65）nmol·mL-1，D2組最低，為（1.05±0.14）nmol·mL-1。

圖8 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)不同密度下稚螺的（A）抗氧化酶和（B）MDA的活力

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了在相同循環(huán)水系統(tǒng)養(yǎng)殖條件下，方斑東風(fēng)螺稚螺在不同密度下的養(yǎng)殖效果。研究發(fā)現(xiàn)，在循環(huán)水系統(tǒng)下，以D1（1.2×104只·m-2）和D2（1.8×104只·m-2）組的密度養(yǎng)殖的稚螺生長最快，而D3（2.4×104只·m-2）和D4（3.0×104只·m-2）組的密度養(yǎng)殖的稚螺生長較慢，這與在刺參（Apostichopus japonicus Selenka）、高體革鯻（Scortum barcoo）、鋸緣青蟹（Scylla serrata）、大西洋鮭（Salmo salarL.）中的研究結(jié)果一致[12-15]，說明在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中過高的密度會(huì)抑制方斑東風(fēng)螺的生長速度。

在實(shí)驗(yàn)第25天，D1、D2組中的稚螺生存狀態(tài)正常，但D3、D4組的稚螺均出現(xiàn)了食欲不振，行動(dòng)遲緩的現(xiàn)象，且有大量的稚螺“翻背”和死亡。這一現(xiàn)象可能是養(yǎng)殖環(huán)境中過高的NH4+-N和NO2--N濃度導(dǎo)致的。在循環(huán)水養(yǎng)殖過程中，過大的養(yǎng)殖密度會(huì)導(dǎo)致過量的代謝廢物進(jìn)入養(yǎng)殖系統(tǒng)，這些代謝廢物如果無法及時(shí)分解，就會(huì)導(dǎo)致養(yǎng)殖系統(tǒng)產(chǎn)生過高的NH4+-N和NO2--N[16-17]。養(yǎng)殖環(huán)境中的NH4+-N和NO2--N濃度過高會(huì)對(duì)養(yǎng)殖生物的機(jī)體組織造成損傷，甚至?xí)?dǎo)致養(yǎng)殖生物的死亡[18-19]。在這種養(yǎng)殖環(huán)境下，養(yǎng)殖生物會(huì)受到嚴(yán)重的環(huán)境脅迫[20]。在實(shí)驗(yàn)第25天時(shí)，D3組的NO2--N和底質(zhì)NO2--N均達(dá)到了（2.68±0.27）和（0.15±0.02）mg·L-1的峰值，D4組的NO2--N、底質(zhì)NH4+-N和底質(zhì)NO2--N均達(dá)了（1.88±0.19）、（1.38±0.14）和（0.10±0.01）mg·L-1的峰值。

在消化酶活性方面，消化酶是生物消化系統(tǒng)中的關(guān)鍵物質(zhì)，其活性的高低直接關(guān)系到生物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化能力，所以消化酶的活性常用來了解生物的消化能力。在本實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，方斑東風(fēng)螺稚螺體內(nèi)的AMS、LPS和PPS的活性均呈現(xiàn)出隨密度的升高而降低的趨勢。這可能是由于養(yǎng)殖過程中過高的NH4+-N和NO2--N濃度峰值破壞了稚螺的消化系統(tǒng),從而導(dǎo)致稚螺的食欲不振和消化酶活性降低[21-22]。這說明過高的養(yǎng)殖密度會(huì)增加循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的負(fù)荷，從而導(dǎo)致水質(zhì)敗壞，對(duì)方斑東風(fēng)螺的消化系統(tǒng)造成破壞。

在抗氧化酶活性方面，貝類在受到環(huán)境因子脅迫時(shí)，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生超氧陰離子自由基（ROS），并激活抗氧化防御系統(tǒng)，其中SOD首先被激活，將O2·-轉(zhuǎn)化為H2O2和O2，隨后被激活的CAT會(huì)將H2O2分解為HO2和O2，若生物體內(nèi)的ROS不斷積累，生物體內(nèi)的生物膜系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生損傷，并產(chǎn)生MDA[23]。在本研究中，D3、D4組稚螺體內(nèi)的SOD活性和MDA濃度均顯著高于D1、D2組（P＜0.01）。這說明養(yǎng)殖系統(tǒng)中過高的NH4+-N和NO2--N濃度使D3、D4組中的稚螺處于較強(qiáng)的應(yīng)激狀態(tài)。而D4組中的CAT活性顯著低于D1、D2組，可能是因?yàn)閲?yán)重的應(yīng)激使D4組中稚螺的氧化系統(tǒng)遭到了破壞[18]，本實(shí)驗(yàn)中，D3、D4組顯著升高的MDA含量證明了這一點(diǎn)。

綜上所述，從生長速度和提高養(yǎng)殖產(chǎn)量的方面考慮，1.8×104只·m-2的密度是比較適合本研究中循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)下的方斑東風(fēng)螺中間培育的。這對(duì)后續(xù)的循環(huán)水方斑東風(fēng)螺中間培育技術(shù)的進(jìn)一步探究具有一定的參考意義。