林祺英，李 芳，蔡汝鵬，張 蕾，黎 瑤，李煥苓，王家保

（1. 海南大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/熱帶農(nóng)林生物災(zāi)害綠色防控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?，570228; 2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 環(huán)境與植物保護(hù)研究所，?？?，571101; 3. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶作物品種資源研究所，?？?，571101）

荔枝（Litchi chinensisSonn.）為無患子科荔枝屬果樹，海南是荔枝起源地之一，具有豐富的種質(zhì)資源，栽培品種以妃子笑、三月紅、白糖罌等早熟品種為主，輔以紫娘喜、無核荔枝、桂早荔等品種[1-2]。近年來對海南荔枝種質(zhì)資源鑒定評價的研究已見多項(xiàng)報道，如李松剛等對海南實(shí)生野生荔枝品種果實(shí)的主要性狀進(jìn)行了鑒定評價[3]，發(fā)現(xiàn)海南荔枝品種的果實(shí)性狀上存在豐富的遺傳多樣性。莊光輝等對60份海南原生荔枝種質(zhì)資源的多個花果性狀進(jìn)行評價[4]，發(fā)現(xiàn)11 份種質(zhì)綜合表現(xiàn)較好，具有推廣應(yīng)用前景。李煥苓等[5]依據(jù)獲得的荔枝EST 序列和基因組序列開發(fā)了一批SSR和In Del標(biāo)記，利用這些標(biāo)記對 232 份荔枝種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性研究，并將這些資源分為 15 類，海南 11 份野生荔枝資源分別聚類在 5 個類群中。但已有的研究中對荔枝葉片表型性狀分析的相關(guān)研究鮮有報道。

近年來，海南省省級荔枝種質(zhì)資源（儋州）收集了300余份海南荔枝種質(zhì)資源，本研究擬以其中的多份資源為材料，從部分葉片性狀的變異出發(fā)，探討海南荔枝資源的多樣性特點(diǎn)及葉片特征，分析這些荔枝種質(zhì)之間的變異類型，以期為進(jìn)一步鑒定評價海南荔枝資源提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 供試材料選自位于儋州市寶島新村的海南省省級荔枝種質(zhì)資源圃（儋州）（19°31′N，109°34′E）。資源圃管理水平中等。資源清單見表1、2。

表1 質(zhì)量性狀與數(shù)量性狀聚類分類不同資源對應(yīng)名稱及編號

表2 抗病性數(shù)據(jù)聚類分類不同資源對應(yīng)名稱及編號

1.2 方法

1.2.1 葉片質(zhì)量性狀評價 根據(jù)中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T2329-2013[6]中的方法，評價入圃資源小葉著生方向、小葉形狀、葉基形狀、葉尖形狀、葉姿、葉緣姿態(tài)（表3）；某一特定資源的性狀特征以該性狀最高比例的類型來描述。統(tǒng)計不同性狀各種類型的資源分布比例。依據(jù)不同性狀的分級分布頻率計算Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（H）[7]。

表3 荔枝葉片質(zhì)量性狀描述與賦值

1.2.2 葉片數(shù)量性狀評價 取末次秋梢中部健康復(fù)葉和單葉，按照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T2329-2013[6]和文獻(xiàn)中的方法[8]，測量葉片的復(fù)葉主軸長、葉柄長、葉面積、葉長、葉寬、葉片鮮重和葉片干重，計算葉形指數(shù)和比葉重。

用毫米刻度游標(biāo)卡尺測量復(fù)葉主軸長和葉柄長，每20個復(fù)葉或單葉為一個重復(fù)，重復(fù)3次，取平均值。

用植物圖像分析儀系統(tǒng)（杭州萬深檢測科技有限公司，LA-S）測量葉長、葉寬和葉面積，每20張單葉為一重復(fù)，重復(fù)3次，取平均值。

用千分之一天平測量單葉鮮質(zhì)量，相應(yīng)葉片放置在恒溫烘箱中105 ℃進(jìn)行殺青30 min，之后75 ℃烘干至恒重后測量單葉干質(zhì)量。每20張單葉為一重復(fù)，重復(fù)3次，取平均值。

葉形指數(shù)=葉片長度/葉片寬度，計算每一張單葉的葉形指數(shù)，每20張單葉為一重復(fù)，重復(fù)3次，取平均值。

比葉重（mg·cm-2）=葉片干質(zhì)量/葉片面積，計算每一張單葉的比葉重，20張單葉為一重復(fù)，重復(fù)3次，取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理 利用Excel2007軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理，計算出平均值、變異系數(shù)、極小值、極大值、極差、中位數(shù)。使用DPS軟件[9]進(jìn)行性狀間的相關(guān)性分析。使用R語言對193份資源的9個葉片數(shù)量性狀與6個質(zhì)量性狀的數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，聚類采用的遺傳距離為歐式距離，聚類方法為最長距離法。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)量性狀評價 從表4數(shù)據(jù)中可以看出，193份荔枝葉片質(zhì)量性狀多樣性指數(shù)介于1.32～2.09之間，平均值為1.66。所有質(zhì)量性狀的多樣性指數(shù)均大于1，說明資源間葉片質(zhì)量性狀變異較大。

表4 荔枝葉片質(zhì)量性狀分布頻率及其多樣性指數(shù)

對6個葉片質(zhì)量性狀進(jìn)行比例分析，發(fā)現(xiàn)在測定的資源中，小葉形狀以長橢圓形最多，卵圓形最少；小葉著生方向占比較高的主要為立面對生和平面對生的資源； 葉基形狀以楔形為主；葉尖形狀以長尾尖為主；葉姿以淺內(nèi)卷為主；葉緣姿態(tài)主要為平直和微波浪的資源（表4）。

2.2 數(shù)量性狀評價 193份荔枝資源的9個葉片數(shù)量性狀中葉面積變異系數(shù)最大為21.74%，變化幅度為8.56～0.41 cm2，極差21.85 cm2，中位數(shù)19.39 cm2；緊接著為復(fù)葉主軸長，變異系數(shù)21.58%，變化幅度為35.56～110.58 cm，極差75.02 cm，中位數(shù)57.84 cm；再次為葉片鮮質(zhì)量，變異系數(shù)21.24%，變化幅度0.20～0.74 g。變異系數(shù)最小的是比葉重，僅為11.31%，變化幅度7.01～14.48 mg·cm-2。變異系數(shù)越高，資源的離散程度越高，多樣性也越豐富。從數(shù)據(jù)中可以得出，9個數(shù)量性狀的變異系數(shù)均值為16.43%（表5），說明本研究所選資源群體具有較高程度的變異，具有較豐富的多樣性。

表5 193份荔枝資源9個葉片數(shù)量性狀的統(tǒng)計分析

2.3 葉片性狀的相關(guān)分析 對193份資源的質(zhì)量性狀與數(shù)量性狀進(jìn)行相關(guān)性分析（表6），結(jié)果顯示葉基形狀與小葉形狀、葉尖形狀呈顯著正相關(guān)關(guān)系；葉緣姿態(tài)、復(fù)葉主軸長、葉柄長、葉長、葉片鮮質(zhì)量、葉片干質(zhì)量、葉面積之間兩兩呈顯著正相關(guān)關(guān)系；葉寬與復(fù)葉主軸長、葉柄長、葉長、葉片鮮質(zhì)量、葉片干質(zhì)量、葉面積之間成顯著正相關(guān)；葉形指數(shù)與復(fù)葉主軸長、葉柄長、葉長呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與葉寬呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；比葉重與葉片干質(zhì)量呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與復(fù)葉主軸長、葉寬、葉面積呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。

對葉片性狀間相關(guān)系數(shù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，葉基形狀與小葉形狀、葉尖形狀，葉尖形狀與葉柄長，葉緣姿態(tài)與葉姿、復(fù)葉主軸長、葉柄長、葉長、葉片鮮質(zhì)量、葉片干質(zhì)量、葉面積，復(fù)葉主軸長與葉緣姿態(tài)、葉柄長、葉形指數(shù)、比葉重，葉柄長與葉尖形狀、葉緣姿態(tài)、復(fù)葉主軸長、葉寬、葉形指數(shù)、葉面積，比葉重與復(fù)葉主軸長、葉寬、葉片干質(zhì)量、葉面積、均屬弱相關(guān)，因?yàn)橄嚓P(guān)性雖然顯著，但相關(guān)系數(shù)較?。蝗~寬與葉片鮮質(zhì)量、葉片干質(zhì)量、葉面積，葉長與葉面積，葉片鮮質(zhì)量與葉片干質(zhì)量、葉面積，葉面積與葉長、葉寬、葉片鮮質(zhì)量、葉片干質(zhì)量，均屬強(qiáng)相關(guān)（表6）。

2.4 基于葉片性狀的聚類分析 通過最長距離法進(jìn)行聚類之后，193份資源被分為了4大類。第1大類有7份資源聚為一類，第2大類有40份資源，第3大類有10份資源，第4大類有136份資源（圖1）。

圖1 193份荔枝資源品種聚類分析圖

第1類資源的復(fù)葉主軸長、葉柄長、葉寬、葉片鮮質(zhì)量、葉片干質(zhì)量、葉面積在幾大類中是最高的指標(biāo)，其葉長同樣是所有大類中最高的指標(biāo)，故而第1大類是屬于葉片較厚實(shí)寬大的資源。同時其葉緣姿態(tài)區(qū)別于其他資源，呈深內(nèi)卷形態(tài)的占多數(shù)（表7、表8）。第2類資源的指標(biāo)中比葉重最低，其余指標(biāo)大小僅次于第1類指標(biāo)。同時其葉基形狀、葉姿、葉緣姿態(tài)區(qū)別于其他資源，分別為楔形、平展、微波浪占多數(shù)（表7、表8）。第3類資源的復(fù)葉主軸長、葉柄長、葉長、葉寬、葉形指數(shù)、葉片鮮質(zhì)量、葉片干質(zhì)量、葉面積是幾大類中最低的指標(biāo)，而比葉重是最高的指標(biāo)，這說明，該類資源是屬于葉片薄且窄小的指標(biāo)。其小葉著生方向是以立面對生和平面對生各占比50%，區(qū)別于其余幾類。9個性狀的變異系數(shù)相較其他幾類普遍較高，說明該類種質(zhì)的多樣性水平是較高的（表7、表6）。第4類資源是處于中間態(tài)的資源，9個性狀的極差相較其余幾類，多數(shù)具有最大的極差，說明其變異的范圍較大（表7）。同時其葉基形狀以偏斜形占比最高（表8）。

表7 193份資源5類別9數(shù)量性狀統(tǒng)計分析

表8 193份資源5類別6質(zhì)量性狀統(tǒng)計分析

3 討 論

葉片是植物最重要的器官，能夠反映植物大部分生長發(fā)育的狀況，目前對各種作物的葉片表型的研究層出不迭，如左絲雨等[10]對7個地處蒙陜邊界的長柄扁桃天然居群的葉片表型進(jìn)行研究；王謝等[11]研究了在霧化栽培技術(shù)控制環(huán)境條件下新生桑枝的葉片性狀之間的關(guān)系；張瑩等[12]對548份梨種質(zhì)資源的23個枝葉表型性狀進(jìn)行表型多樣性及變異特點(diǎn)的研究；胡安華等[13]對82份柚類種質(zhì)資源的26個表型性狀進(jìn)行多樣性分析、差異分析及綜合評價等。這些研究結(jié)果均表明多數(shù)種質(zhì)資源葉片的表型性狀變異豐富，具有遺傳差異，從中可以挖掘出大量的差異遺傳信息，而這些研究結(jié)果均可用于種質(zhì)資源的保護(hù)以及優(yōu)良育種中。本文研究亦發(fā)現(xiàn)，荔枝葉片性狀具有豐富的變異，與上述研究結(jié)論相似。

本研究發(fā)現(xiàn)，荔枝質(zhì)量性狀多樣性指數(shù)均大于1，故認(rèn)為在本群體中的多樣性豐富，變異程度高，以小葉形狀為長橢圓形、小葉著生方向?yàn)榱⒚鎸ι推矫鎸ι?、葉基形狀為楔形、葉尖形狀為長尾尖、葉姿為淺內(nèi)卷、葉緣姿態(tài)為平直和微波浪的資源占比最高。各質(zhì)量性狀之間多不存在相關(guān)關(guān)系。在郭燕等[14]對燕山板栗149份種質(zhì)的葉片質(zhì)量性狀多樣性分析中的結(jié)果顯示，燕山板栗種質(zhì)的5個葉片質(zhì)量性狀的平均多樣性指數(shù)（H′）為1.24，說明燕山板栗葉片質(zhì)量性狀變異豐富，該結(jié)果與本研究結(jié)果相似，說明本研究中所測量的193份荔枝資源具有豐富的遺傳信息，可為荔枝的品種選育提供大量的材料。

荔枝葉片數(shù)量表型性狀分析表明， 193份海南荔枝實(shí)生資源品種的葉面積、復(fù)葉主軸長、葉片鮮質(zhì)量、葉片干質(zhì)量的變異類型較為豐富，變異系數(shù)分別為21.74%、21.58%、21.24%、20.92%；且9個性狀的變異系數(shù)均在10%以上，變異系數(shù)均值為16.43%，數(shù)量性狀之間多存在顯著或極顯著相關(guān)關(guān)系，與李昕蔓等[15]在對新疆野蘋果的多樣性分析中的結(jié)果基本一致，說明這193份荔枝資源的葉形變異豐富，為后期選育類型種質(zhì)提供了理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持。

系統(tǒng)聚類法又稱層次聚類，是統(tǒng)計學(xué)中聚類分析的一個重要方法，其目的在于盡可能使類簇內(nèi)對象相似，類簇間對象相異[16]，以此來摸清某些內(nèi)在規(guī)律。本研究采用聚類分析的層次聚類中的最長距離法將193份荔枝資源分為了4大類。通過數(shù)據(jù)分析，可以認(rèn)為該分類是按照葉片大小程度由第1大類為葉片最寬大厚實(shí)的資源分類，緊接著是第2大類，第3大類為葉片最為窄小且薄的種質(zhì)。有研究表明，比葉重與光合速率呈顯著正相關(guān)關(guān)系[17]。在陳華蕊等[18]對同為熱帶果樹的芒果的研究中同樣顯示光合速率與比葉重達(dá)到極顯著正相關(guān)。從而推測，第3大類應(yīng)為光合速率最高的一組分類，在今后的研究中可以沿著該推測進(jìn)行補(bǔ)充。根據(jù)尚帥斌等[19]對海南青梅的研究可知，葉柄長增大，有助于減少青梅個體內(nèi)部葉片對光能的相互遮擋，提高其光能利用。由此可以推測第1類資源是高光能利用率類型的資源。

總之，本研究系統(tǒng)研究了部分海南荔枝種質(zhì)資源的葉片表型性狀，探討了這些性狀的遺傳變異特點(diǎn)及相互關(guān)系，研究結(jié)果為進(jìn)一步鑒定評價海南荔枝資源提供了基礎(chǔ)，并為進(jìn)一步研究應(yīng)用這些資源提供了數(shù)據(jù)支撐。