鄭雪媚，蔣順進，林 昊，劉宗新

(1 廣東容大生物股份有限公司，廣東 清遠 511500；2 清遠一生自然生物研究院有限公司，廣東 清遠 511500)

地頂孢霉培養(yǎng)物是從野生蟲草中分離得到的地頂孢霉菌株，通過人工發(fā)酵的方式生產(chǎn)出的一種新型綠色的飼料添加劑，富含腺苷、蟲草素、蟲草多糖、蟲草酸、甾醇等多種活性成分，被譽為動物可以食用的“冬蟲夏草”[1-2]。腺苷是一種嘌呤核苷，對動物的心肌具有保護作用，其含量被用作蟲草類產(chǎn)品的質(zhì)控指標，因此建立完善準確的質(zhì)量檢測方法是很有必要的[3]。本研究利用高效液相色譜法測定地頂孢霉培養(yǎng)物中腺苷的含量，旨在為地頂孢霉培養(yǎng)物中腺苷含量的測定及蟲草類產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)控提供技術(shù)支撐。

參照蟲草制品中蟲草素和腺苷的測定高效液相色譜法[4]，根據(jù)腺苷的結(jié)構(gòu)特點，建立測定地頂孢霉培養(yǎng)物中腺苷含量的HPLC法。該方法具有定量檢測準確度高、線性范圍廣、重現(xiàn)性好、分析時間短、樣品處理簡單等特點，為地頂孢霉培養(yǎng)物的質(zhì)量控制提供可靠的依據(jù)。

1 實 驗

1.1 儀器和材料

G7111AAgilent液相色譜儀；CTO-20AC柱溫箱；UPR-5T超純水儀；KQ-500DE超聲波清洗器；METTLER MS105DU天平；腺苷標準品(來源：中國食品藥品檢定研究院(含量99.4%))；地頂孢霉培養(yǎng)物(來源：廣東容大生物股份有限公司提供)，水為超純水(來源：廣東容大生物股份有限公司提供)，乙腈(來源：科魯?shù)禄す煞萦邢薰?。

1.2 色譜條件

流動相：乙腈-水(5∶95)為流動相；

色譜柱：菲羅門 C185 μm，4.6 mm×250 mm；

檢測波長：260 nm；

流速：1.0 mL/min；

柱溫：35 ℃；

進樣量：10 μL。

1.3 溶液的配制

1.3.1 對照品溶液的制備

精密稱取20 mg腺苷對照品，置200 mL容量瓶，加超純水至刻度，搖勻，精密移取上述溶液5 mL，置于100 mL容量瓶，加超純水至刻度，搖勻，過濾，即得。

1.3.2 供試品溶液的制備

精密稱取1 g地頂孢霉培養(yǎng)樣品，置100 mL容量瓶，加適量超純水，超聲30 min后定容至刻度，搖勻，過濾，即得。

1.4 陰性干擾測定

以相同的處方比例，按照地頂孢霉培養(yǎng)物的制備工藝，制得地頂孢霉培養(yǎng)物的陰性制劑。取地頂孢霉培養(yǎng)物的陰性顆粒適量，按1.3.2項下制成地頂孢霉培養(yǎng)物陰性溶液。進樣測試，結(jié)果陰性溶液無干擾。證明本方法用于腺苷的含量測定具有專屬性。

圖1 腺苷對照品Fig.1 Adenosine reference

圖2 地頂孢霉培養(yǎng)物陰性樣品Fig.2 Acremonium terricola culture negative sample

圖3 地頂孢霉培養(yǎng)物樣品Fig.3 Sample of acremonium terricola culture

1.5 標準曲線的制備

表1 腺苷對照品溶液濃度及峰面積Table 1 Adenosine reference solution concentration and peak area

精密稱取腺苷對照品100.4 mg，置1 000 mL容量瓶中，加純化水至刻度使溶解，搖勻，作為對照品貯備液；分別移取對照品貯備液0.5、1、2、5、20、100 mL置100 mL容量瓶中，加純化水至刻度，搖勻，作為對照品溶液。對以上6種對照品溶液進樣測定。記錄色譜圖，測定結(jié)果見表1。

圖4 腺苷的線性關(guān)系圖Fig.4 Linear plot of adenosine

以腺苷濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，見圖4。結(jié)果表明，在0.499 0～99.797 6 μg/mL范圍內(nèi)，腺苷濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程為y=26.144x-1.811 9，R2=1。

1.6 精密度試驗

精密稱取腺苷對照品20.11 mg，按1.3.1項下制成每1 mL含4.997 3 μg腺苷對照品溶液。連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果見表2。

表2 腺苷精密度試驗Table 2 Adenosine precision test

結(jié)果表明，腺苷峰面積RSD為0.3%，證明本方法的精密度良好。

1.7 重復(fù)性試驗

1.7.1 對照品溶液的制備

精密稱定腺苷對照品20.43 mg，按1.3.1項下制成每1 mL含5.076 9 μg腺苷對照品溶液。

1.7.2 供試品溶液的制備

精密稱定地頂孢霉培養(yǎng)，按1.3.2項下制備供試品溶液，平行處理6份，進樣測定。結(jié)果見表3。

表3 腺苷含量測定重復(fù)性試驗Table 3 Repeatability test for determination of adenosine content

結(jié)果表明，腺苷含量RSD為0.2%，證明本測試方法重復(fù)性良好。

1.8 回收率試驗

1.8.1 對照品母液的制備

精密稱取腺苷對照品20.17 mg，置200 mL棕色容量瓶中，加純化水至刻度使溶解，作為腺苷對照品母液。

1.8.2 對照品溶液的制備

取對照品母液5 mL，置100 mL容量瓶中，加純化水至刻度，搖勻，過濾，即得。

精密稱取已知含量的同一批地頂孢霉培養(yǎng)樣品約0.5 g(共9份)置于100 mL容量瓶中，分別加入上述對照品母液1.5 mL、2.5 mL、3.5 mL，加適量超純水，超聲30 min后定容至刻度，過濾，進樣測定。進樣測定，記錄色譜圖，結(jié)果見表4。

表4 腺苷回收率試驗數(shù)據(jù)Table 4 Adenosine recovery test data

結(jié)果顯示，腺苷回收率的平均值為98.70%，RSD值為0.8%，表明本方法回收率較好。

1.9 腺苷測定方法的耐用性研究

本試驗考察色譜柱溫度、流速、波長、不同品牌色譜柱及流動相比例對地頂孢霉培養(yǎng)物中腺苷含量測定的影響。

1.9.1 不同的色譜柱溫度

對照品溶液的制備：精密稱定腺苷對照品20.18 mg，按1.3.1項下制成每1 mL含5.014 7 μg腺苷對照品溶液。

供試品溶液的制備：取地頂孢霉培養(yǎng)物，按1.3.2項下制備地頂孢霉培養(yǎng)物供試品溶液。

在其它色譜條件不變的情況下，色譜柱溫度分別設(shè)定為30、35、40 ℃，對同一樣品進行含量測定，記錄峰面積，計算腺苷含量，結(jié)果見表5。

表5 不同色譜柱溫度對腺苷含量測定的影響Table 5 Effects of different chromatographic column temperatures on the determination of adenosine content

結(jié)果表明，色譜柱溫度的微小變化對腺苷含量測定無明顯影響。

1.9.2 不同的流速

(1)對照品溶液的制備

精密稱定腺苷對照品20.20 mg，按1.3.1項下制成每1 mL含5.019 7 μg腺苷對照品溶液。

(2)供試品溶液的制備

取地頂孢霉培養(yǎng)物，按1.3.2項下制備地頂孢霉培養(yǎng)物供試品溶液。

在其它色譜條件不變的情況下，流動相流速分別設(shè)定為0.8、1.0、1.2 mL/min，對同一樣品進行含量測定，記錄峰面積，計算腺苷含量，結(jié)果見表6。

表6 不同流動相速度對腺苷含量測定的影響Table 6 Effect of the velocity of different mobile phases on the determination of adenosine content

結(jié)果表明，流動相速度的微小變化對腺苷含量測定無明顯影響。

1.9.3 不同的色譜柱

(1)對照品溶液的制備

精密稱定腺苷對照品20.41 mg，按1.3.1項下制成每1 mL含5.071 9 μg腺苷對照品溶液。

(2)供試品溶液的制備：

取地頂孢霉培養(yǎng)物，按1.3.2項下制備地頂孢霉培養(yǎng)物供試品溶液。

在其它色譜條件不變的情況下，使用不同的色譜柱，對同一樣品進行含量測定，記錄峰面積，計算腺苷含量，結(jié)果見表7。

表7 不同品牌色譜柱對腺苷含量測定的影響Table 7 Effect of different brands of chromatographic columns on the determination of adenosine content

結(jié)果證實，不同品牌色譜柱對腺苷的含量測定無明顯影響。

1.9.4 不同的測定波長

(1)對照品溶液的制備

精密稱定腺苷對照品20.25 mg，按1.3.1項下制成每1 mL含5.032 1 μg腺苷對照品溶液。

(2)供試品溶液的制備：

取地頂孢霉培養(yǎng)物，按1.3.2項下制備地頂孢霉培養(yǎng)物供試品溶液。

在其它色譜條件不變的情況下，測定波長分別設(shè)定為257、258、259、260、261、262、263 nm，對同一樣品進行含量測定，記錄峰面積，計算腺苷含量，結(jié)果見表8。

表8 不同測定波長對腺苷含量測定的影響Table 8 Effect of different determination wavelengths on the determination of adenosine content

結(jié)果表明，測定波長的微小變化對腺苷含量測定無明顯影響。

1.9.5 不同的流動相比例

(1)對照品溶液的制備

精密稱定腺苷對照品20.63 mg，按1.3.1項下制成每1 mL含5.126 6 μg腺苷對照品溶液。

(2)供試品溶液的制備

表9 不同流動相比例對腺苷含量測定的影響Table 9 Effect of the proportions of different mobile phases on the determination of adenosine content

取地頂孢霉培養(yǎng)物，按1.3.2項下制備地頂孢霉培養(yǎng)物供試品溶液。

在其他色譜條件不變的情況下，流動相乙腈-水比例分別設(shè)定為2.5∶97.5、5∶95、7.5∶92.5，對同一樣品進行含量測定，記錄峰面積，計算腺苷含量，結(jié)果見表9。

結(jié)果表明，流動相比例的微小變化對腺苷含量測定無明顯影響。

小結(jié)：采用本方法能準確測定地頂孢霉培養(yǎng)物中的腺苷的含量，方法的耐用性較好。

2 結(jié) 論

徐娟娟等[5]建立了測定地頂孢霉培養(yǎng)物中腺苷含量的高效液相色譜法，該方法對地頂孢霉培養(yǎng)物中腺苷含量檢測方法的波長、線性、精密度、回收率等進行了研究，在此基礎(chǔ)上，本方法增加了專屬性、耐用性(色譜柱溫度、流速、波長、不同品牌色譜柱及流動相比例對地頂孢霉培養(yǎng)物中腺苷含量測定的影響)等的研究。劉書余等[6]建立了同時測定地頂孢霉培養(yǎng)物中腺苷、蟲草素和麥角甾醇含量的高效液相色譜法，但該方法采用梯度洗脫，分析時間較長。本研究建立了HPLC法測地頂孢霉培養(yǎng)物中腺苷的含量，測定色譜條件為：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相為乙腈-水(5∶95)；檢測波長為260 nm。本方法定量檢測準確度高、線性范圍廣、重現(xiàn)性好、分析時間短、樣品處理簡單，為地頂孢霉培養(yǎng)物質(zhì)量控制提供了依據(jù)。