陳曉佳 林金海 丁友玲

（福州新北生化工業(yè)有限公司 福州 350101）

細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分之一，具有高致熱性，會引起敗血癥、休克等疾病，是藥品生產(chǎn)上必須嚴(yán)格控制的有害物質(zhì)[1-3]。鱟試劑是從鱟的血液中提取的凍干試劑，用于檢測藥品中細(xì)菌內(nèi)毒素。光度測定法分濁度法和顯色基質(zhì)法，具有定量檢測、簡便、快捷、靈敏度高等優(yōu)點[4-6]。動態(tài)濁度法是通過儀器測定鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中的濁度變化，即檢測反應(yīng)混合物的濁度到達(dá)某一預(yù)先設(shè)定的吸光度或透光率所需要的反應(yīng)時間、制備標(biāo)準(zhǔn)曲線后檢測樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素的定量檢測法。

2021 年2 月5 日，國家林業(yè)和草原局、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒布公告，將中國鱟及圓尾鱟列為國家二級保護(hù)野生動物。為了保護(hù)鱟資源、節(jié)約鱟血細(xì)胞，在符合2020 版《中華人民共和國藥典》四部通則1143“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”中“光度法”要求基礎(chǔ)上，改進(jìn)動態(tài)濁度法的測定方法，鱟試劑用量由原來100 μL/次（份）減少至50 μL，比較分析樣品用量分別為50、100、150 μL 時，哪一種比例的線性和檢測范圍能達(dá)到主試劑100 μL 樣品量的水平，并通過實際樣品檢測驗證改進(jìn)后的測定方法，更好地保護(hù)鱟資源和保持細(xì)菌內(nèi)毒素檢測的可持續(xù)發(fā)展[7-9]。

1 材料和方法

1.1 試劑

細(xì)菌動態(tài)濁度法鱟試劑（批號22101512，規(guī)格：0.5 mL/支，檢測范圍：10～0.01 EU/mL；批號22090312，規(guī)格：0.5 mL/支，檢測范圍：10～0.03 EU/mL；批號22022612，規(guī)格：0.5 mL/ 支，檢測范圍：10～0.005 EU/mL）、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（批號21100105，規(guī)格：5 mL/支，細(xì)菌內(nèi)毒素含量＜0.005 EU/mL），均源自福州新北生化工業(yè)有限公司；細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品（批號150800-201601，效價：9 000 EU/支，中國食品藥品檢定研究院）；硫酸慶大霉素注射液（批號200707，規(guī)格：2 mL ∶8 萬單位，福建匯天生物藥業(yè)有限公司）；0.9%氯化鈉注射液（批號G20040704A，四川科倫藥業(yè)有限公司）；10%葡萄糖注射液（批號2012072724，辰欣藥業(yè)股份有限公司）；鹽酸林可霉素注射液（批號21110901，規(guī)格：2 mL ∶0.6 g，山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)賽特有限責(zé)任公司）。

1.2 儀器設(shè)備

Multiskan FC 酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific Inc.）；ZH-2 混合器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）；微量移液器（北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司）；96 孔板（美國康寧）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查器具（福州新北生化工業(yè)有限公司）；其他試驗玻璃器具均經(jīng)250 ℃干熱滅菌0.5 h 以上除去熱原。

1.3 方法

1.3.1 3 批鱟試劑細(xì)菌內(nèi)毒素動態(tài)濁度法標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗

依照2020 版《中華人民共和國藥典》四部通則1143“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”中“光度測定法中標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗”[10]，分析標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性。試驗根據(jù)所使用動態(tài)濁度法鱟試劑的檢測范圍，分別選擇3 個連續(xù)的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)濃度（3 個濃度點均在鱟試劑檢測范圍內(nèi)，同時包含最低檢測限，且相鄰濃度點間的稀釋倍數(shù)為10），用細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品分別制成這3 個濃度的稀釋液，每一濃度做3 個平行孔，同時做2 個陰性對照。加樣量按原來100 μL/支主試劑+100 μL/支細(xì)菌內(nèi)毒素溶液（或樣品），實驗結(jié)果根據(jù)線性回歸分析，計算標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)r值。

1.3.2 不同反應(yīng)體系對動態(tài)濁度法鱟試劑的影響

1）不同反應(yīng)體系對標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性的影響 設(shè)置3組實驗反應(yīng)體系：50+50、50+100、50+150 的反應(yīng)液，按文獻(xiàn)[10]分析3 組實驗反應(yīng)體系標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性。實驗結(jié)果根據(jù)線性回歸分析，計算標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)r值。

2）不同濃度內(nèi)毒素反應(yīng)時間的比較 通過對比鱟試劑檢測不同濃度內(nèi)毒素時達(dá)到預(yù)設(shè)吸光度0.02 的時間差異，來分析50+50、50+100、50+150 的反應(yīng)液相比于對照（100+100 反應(yīng)液）對鱟試劑檢測靈敏性的顯著性影響。

1.3.3 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢測比較

按文獻(xiàn)[7]對比50+150、100+100 的反應(yīng)液檢測鹽酸林可霉素、硫酸慶大霉素、葡萄糖、氯化鈉注射液中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量。

2 結(jié)果

2.1 3 批鱟試劑細(xì)菌內(nèi)毒素動態(tài)濁度法標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗

根據(jù)線性回歸分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)r的絕對值均≥0.980。動態(tài)濁度法鱟試劑批號22090312、22101512、22022612 標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗，均符合中國藥典規(guī)定（表1）。

表1 3批鱟試劑細(xì)菌內(nèi)毒素動態(tài)濁度法標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗結(jié)果a)

2.2 不同反應(yīng)體系對動態(tài)濁度法鱟試劑的影響

2.2.1 不同反應(yīng)體系對標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性的影響

根據(jù)線性回歸分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)r的絕對值均≥0.980，表明3 組實驗反應(yīng)體系均不影響鱟試劑（22090312、22101512、22022612）標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性（表2）。

表2 不同反應(yīng)體系對標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性的影響a)

2.2.2 不同濃度內(nèi)毒素反應(yīng)時間的比較

對于不同濃度內(nèi)毒素反應(yīng)，相對于對照（100+100 反應(yīng)液）反應(yīng)達(dá)到預(yù)設(shè)吸光度的時間有延長的情況。50+150反應(yīng)液的反應(yīng)時間沒有顯著性延長的差異。50+100、50+50 反應(yīng)液的反應(yīng)時間有顯著性延長的差異（圖1）。

圖1 不同反應(yīng)液和不同細(xì)菌內(nèi)毒素濃度對反應(yīng)時間的影響

2.3 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢測比較

實驗結(jié)果顯示，采用50+150 的反應(yīng)液檢測鹽酸林可霉素、硫酸慶大霉素、葡萄糖、氯化鈉注射液中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量，回收率均符合中國藥典規(guī)定（50%～200%），細(xì)菌內(nèi)毒素含量均符合中國藥典規(guī)定（表3）。

表3 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢測比較

3 討論

本研究將鱟試劑的減量用于動態(tài)濁度法方法改進(jìn)，成倍減少鱟資源消耗。實驗中發(fā)現(xiàn)，在預(yù)設(shè)吸光度值（0.02）下檢測低內(nèi)毒素含量時，該方法改進(jìn)反應(yīng)時間明顯比文獻(xiàn)方法短，而稍高內(nèi)毒素含量其反應(yīng)時間變化不明顯。我們結(jié)合內(nèi)毒素與鱟試劑進(jìn)行的一系列酶反應(yīng)過程分析，內(nèi)毒素濃度高鱟試劑酶反應(yīng)快、時間短，反之，反應(yīng)慢、時間長。那么在鱟試劑半量情況下，要使反應(yīng)終點達(dá)到固定吸光度的時間不出現(xiàn)延長，就需要相應(yīng)增加反應(yīng)物的量（50+150）。改進(jìn)后的方法有利于反應(yīng)物激活鱟試劑酶反應(yīng)，顯著提高低濃度內(nèi)毒素測定的靈敏性。而在高濃度內(nèi)毒素的反應(yīng)中考慮到操作及設(shè)備誤差、酶反應(yīng)快、時間短，而使結(jié)果無明顯差異，更穩(wěn)定。表明改進(jìn)的方法既可保持動態(tài)濁度法原有的優(yōu)點，也可提高細(xì)菌內(nèi)毒素測定的靈敏性。

改進(jìn)的動態(tài)濁度法，其測定結(jié)果與傳統(tǒng)動態(tài)濁度法一致，但可減少鱟試劑的使用量，提高鱟資源的利用率，易于在實踐中運用。進(jìn)一步可著眼于其他替代檢測方法的研究及反應(yīng)器具的改進(jìn)等，以便在測定細(xì)菌內(nèi)毒素的同時能更好地實現(xiàn)鱟資源的保護(hù)。