張倩

龜甲可作為保健食品原料使用，龜甲提取物也已成為天然保健品市場上的重要原料。本實驗以龜甲提取物為研究對象，通過小鼠急性經(jīng)口毒性試驗、90天經(jīng)口毒性試驗探究龜甲提取物的安全性，為龜甲原料的開發(fā)和利用提供數(shù)據(jù)基礎。

一、材料與方法

1.主要材料。樣品龜甲提取物是以水為溶劑提取制得的，成人（體重60kg）推薦劑量為1.0g/天，1.0g提取物相當于10g龜甲原料。

2.實驗動物。SPF級昆明種小鼠、SD大鼠由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，雌雄分籠飼養(yǎng)于溫度為20℃-24℃、濕度為40%-70%RH的SPF級實驗室。

3.實驗方法。參照GB 15193.1《食品安全國家標準 食品安全性毒理學評價程序》、GB 15193.3《食品安全國家標準 急性經(jīng)口毒性試驗》、GB 15193.13《食品安全國家標準 90天經(jīng)口毒性試驗》規(guī)定的方法，進行急性經(jīng)口毒性試驗及90天經(jīng)口毒性試驗。

（1）急性經(jīng)口毒性試驗。取20只SPF級昆明種小鼠，試驗開始前禁食5h，自由飲水。按照限量法，設置龜甲提取物灌胃劑量為15.0g/kg·bw，將龜甲提取物用水做溶劑配置成濃度為0.25g/mL的受試液，以20mL/kg灌胃容量灌胃三次，連續(xù)灌胃小鼠14天，觀察動物一般情況，記錄生存狀態(tài)及是否出現(xiàn)中毒表現(xiàn)、死亡情況等。實驗結(jié)束，每只小鼠均處死大體解剖后進行病理組織學檢查，并記錄觀察結(jié)果。

（2）90天經(jīng)口毒性試驗。取120只SPF級SD大鼠，實驗設置龜甲提取物高、中、低（5.00g/kg·bw、3.33g/kg·bw、1.67g/kg·bw）三個劑量組，分別相當于成人推薦劑量的300、200、100倍。另設陰性對照組，每組20只，雌雄各半。陰性對照組和高劑量組均設實驗中期及實驗恢復期衛(wèi)星組，每組10只，雌雄各半。采用灌胃給予的方式，灌胃體積為10mL/kg，各劑量組灌胃給予相應受試物，陰性對照組、陰性對照衛(wèi)星組灌胃等體積蒸餾水，高劑量衛(wèi)星組給予5.00g/kg·bw劑量受試物。實驗大鼠單籠飼養(yǎng)，不干涉進食、飲水，連續(xù)灌胃90天，恢復期衛(wèi)星組繼續(xù)灌胃28天。在實驗期間，每日觀察并詳細記錄大鼠生長情況，每周稱重，記錄攝食量，以此計算大鼠食物利用率。在實驗前期及實驗末期，對龜甲提取物高劑量組、陰性對照組進行眼部檢查；在實驗中期，取衛(wèi)星組大鼠進行尿常規(guī)檢測，夜間禁食，采血進行血液學和血液生化指標檢測；進入實驗末期及恢復期，陰性對照組、各劑量組、恢復期衛(wèi)星組大鼠均進行尿常規(guī)檢測、血液學和血液生化檢查，大鼠解剖后觀察各臟器的大體改變，摘取心、肝等臟器進行稱重，計算臟/體比，取臟器、腺體并固定、切片后進行組織病理學檢查。

二、結(jié)果與分析

1.急性經(jīng)口毒性試驗。以經(jīng)口灌胃劑量為15.0g/kg·bw的龜甲提取物，雌雄小鼠灌胃后未見明顯中毒癥狀，全部小鼠無一例死亡。實驗結(jié)束后，小鼠大體解剖結(jié)果未見任何異常，LD50>15.0g/kg·bw。根據(jù)GB 15193.3《食品安全國家標準 急性經(jīng)口毒性試驗》中急性毒性（LD50）劑量分級，屬實際無毒級。

2.90天經(jīng)口毒性試驗。（1）龜甲提取物對大鼠體重、進食量、食物利用率的影響。在90天喂養(yǎng)實驗期間及28天恢復期間，各劑量組大鼠生長情況正常，未見異樣，均未出現(xiàn)中毒表現(xiàn)，實驗動物無死亡。在整個實驗過程中，龜甲提取物各劑量組雌雄大鼠體重、進食量、食物利用率與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。說明龜甲提取物各劑量對雌雄大鼠體重、進食量、食物利用率無影響。

（2）龜甲提取物對血液學指標的影響。由表1-2可知，龜甲提取物各劑量組雌雄大鼠血液學指標均在實驗室歷史正常值范圍內(nèi)，且與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。在實驗中期及恢復期，高劑量衛(wèi)星組雌雄大鼠血液學指標也均在實驗室歷史正常值范圍內(nèi)，且與對照衛(wèi)星組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。說明龜甲提取物各劑量對雌雄大鼠血常規(guī)指標無影響。

（3）龜甲提取物對血生化指標的影響。由表3-6可知，龜甲提取物各劑量組雌雄大鼠血生化指標均在實驗室歷史正常值范圍內(nèi)，且與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。在實驗中期及恢復期，高劑量衛(wèi)星組雌雄大鼠血生化指標也均在實驗室歷史正常值范圍內(nèi)，且與對照衛(wèi)星組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。說明龜甲提取物各劑量對雌雄大鼠血生化指標無影響。

（4）龜甲提取物對實驗大鼠眼部、尿常規(guī)的影響。在實驗前和實驗末期，對龜甲提取物高劑量組、陰性對照組雌雄大鼠進行眼部檢查，結(jié)果表明，晶狀體未見渾濁，眼部角膜、虹膜清晰，球結(jié)膜無水腫和充血，說明龜甲提取物對大鼠眼部無影響。在實驗中期、實驗末期及恢復期，分別檢測各組大鼠尿常規(guī)，結(jié)果表明，各組大鼠尿液外觀正常，潛血、葡萄糖、尿蛋白、尿液pH及密度均未見異常。

（5）龜甲提取物對大鼠臟器重量及臟/體比值的影響。各劑量組雌雄大鼠的腦、心臟、胸腺、腎上腺、肝臟、腎臟、脾臟、睪丸/卵巢、附睪/子宮重量及臟體比與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

（6）龜甲提取物對大鼠病理學的影響。處死動物后，肉眼觀察大鼠體表、外觀未見異常改變，被毛光滑，無脫落，肛門周圍無膿腫及分泌物，體內(nèi)未見出血、積液等，主要臟器位置均無異常，亦無明顯病變。通過系統(tǒng)解剖及鏡下觀察，劑量組雌雄大鼠部分臟器有輕微變化，但病變程度非常輕微，認為是大鼠自發(fā)性組織病理學改變，劑量組與陰性對照組中的病變程度和情況相似，與龜甲提取物沒有相關性。28天恢復期結(jié)束，衛(wèi)星組大鼠大體解剖亦未見異常，結(jié)果認為龜甲提取物不會引起大鼠臟器病理學改變和損傷。

三、結(jié)論

急性經(jīng)口毒性實驗以15.0g/kg·bw劑量龜甲提取物，14天觀察期內(nèi)未見異常，LD50＞15.0g/kg·bw，屬實際無毒級。

在90天經(jīng)口毒性試驗過程中，各組大鼠生存狀態(tài)良好，龜甲提取物對體重、進食量、食物利用率無影響，對大鼠血液學、血生化指標的變化沒有影響，眼部及尿常規(guī)檢查未發(fā)現(xiàn)異樣，通過肉眼觀察及大體解剖鏡下觀察，未見與受試龜甲提取物相關的病理學改變。長期服用龜甲提取物安全無毒，可長期食用。