崔 筱，胡素娟，劉 芹，吳 杰，師子文，張玉亭，孔維麗

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所 鄭州 450002）

玉米芯是黃淮海地區(qū)栽培平菇的主要原料，秋季收獲后的玉米芯存放不當(dāng)易產(chǎn)生黃曲霉毒素。黃曲霉毒素（aflatoxins，AFT）是一組由曲霉屬（Aspergillus）的一些霉菌產(chǎn)生的具有強(qiáng)毒性和致癌性的次級(jí)真菌代謝產(chǎn)物[1-3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，曲霉屬中有28個(gè)種的霉菌可產(chǎn)生黃曲霉毒素，其中最重要及最廣為人知是黃曲霉（A.flavus）、寄生曲霉（A.parasiti-cus）和紅綬曲霉（A.nomius）[4]。目前已分離鑒定出20 余種黃曲霉毒素異構(gòu)體，其中最常見的包括B1、B2、G1、G2、M1、M2。

黃曲霉毒素具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，通過物理（臭氧、微波、高壓、紫外照射、吸附劑等）或化學(xué)方法（堿處理法、氧化法等）僅能降低黃曲霉毒素的含量，很難將其完全去除。熟料栽培的金針菇菌渣中檢測(cè)出黃曲霉毒素，其殘留影響了食用菌菌渣飼料化及基質(zhì)化的應(yīng)用[5]。生物降解法是利用微生物產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物或者所分泌的酶降解黃曲霉毒素，該方法由于其反應(yīng)條件溫和、底物專一性強(qiáng)、不易破壞營(yíng)養(yǎng)成分等特點(diǎn)成為了近幾年研究的熱點(diǎn)[6]。目前，國(guó)內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)多種細(xì)菌、真菌能夠降解黃曲霉毒素。孫然然[7]從土壤中篩選分離出一株纖維菌屬（Cellulosimicrobium）的芬氏纖維微菌（C.funkei），該菌株降解黃曲霉毒素B1 的能力可達(dá)到94.16%。Risa 等[8]發(fā)現(xiàn)，紅球菌屬（Rhodococcus）的紅平紅球菌（R.erythropolis）NI1 和紫紅紅球菌（R.rhodochrous）NI2 菌株對(duì)黃曲霉毒素B1 的降解率可分別達(dá)到80% 和84%。Risa 等[8]發(fā)現(xiàn)，紅球菌屬的R.erythropolis可有效降解黃曲霉毒素B1。Eshelli等[9]發(fā)現(xiàn)，鏈霉菌屬（Streptomyces）的S.lividansTK24 和S.aureofaciensATCC10762 對(duì)AFB1 的降解率分別為86%和88%。于麗娜等[10]發(fā)現(xiàn)，假單胞菌屬（Pseudomonas）的M8 菌株可降解黃曲霉毒素B1。Akocak 等[11]發(fā)現(xiàn)，熒光假單胞菌（P.fluorescens）PB27 對(duì)黃曲霉菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)具有抑制效果。劉長(zhǎng)宇[12]研究發(fā)現(xiàn)藤黃單胞菌屬（Luteimonas）的菌株L.sp.CW574 對(duì)AFB1 的降解率可達(dá)到67.0%。李俊霞等[13]發(fā)現(xiàn)寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）的嗜麥芽窄食單胞菌（S.maltophilia）對(duì)AFB1 的降解率達(dá)85.7%。Hormisch 等[14]發(fā)現(xiàn)分枝桿菌屬（Mycobacterium）的M.fluoranthenivorans可有效去除黃曲霉毒素AFB1。宮小明等[15]研究表明，芽孢桿菌屬（Bacillus）的枯草芽孢桿菌（B.subtilis）和地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）在抑制黃曲霉孢子的萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)、分解毒素3 個(gè)方面都有顯著作用。吉小鳳等[16]從肉雞腸道糞便中篩選到一株乳桿菌屬脫毒菌株LAB-10，發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)AFB1的脫毒率達(dá)到63.4%。Line 等[17]通過C-14 標(biāo)記黃曲霉毒素B1 來(lái)追蹤黃桿菌屬（Flavobacterium）的橙色黃桿菌（F.aurantiacum）對(duì)其降解的情況，發(fā)現(xiàn)該菌的活細(xì)胞和死細(xì)胞都可以吸收一定量的黃曲霉毒素。鄒盼盼等[18]發(fā)現(xiàn)類芽胞桿菌屬（Paenibacillus）的飼料類芽孢桿菌（P.pabuli）E1 菌株有高效降解黃曲霉毒素的能力。李平[19]發(fā)現(xiàn)擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsis）的菌株海洋擬諾卡氏菌N.sp.MA03有高效抑制黃曲霉毒素合成的能力。Biernasiak等[20]研究發(fā)現(xiàn)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）具有降解AFB 的能力，在大麥、小麥和玉米粉的混合發(fā)酵試驗(yàn)中，釀酒酵母菌能有效地降低AFB1、B2、G1 和G2 的含量，降解率達(dá)到30%以上。施翠娥等[21]采用氮離子注入黑曲霉（A.niger）后獲得一株黑曲霉突變株90A，發(fā)現(xiàn)其可以抑制合成或降解糧油作物中的黃曲霉毒素。Liu 等[22]利用假蜜環(huán)菌屬（Armillariella）的發(fā)光假密環(huán)菌（A.tabescens）E-20 的提取液可使樣品中的AFB1 含量減少80%。Wang 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，原毛平革菌屬（Phanerochaete）的乳白原毛平革菌（P.sordida）YK-624 菌株可降解黃曲霉毒素B1。Motomura 等[24]發(fā)現(xiàn)，側(cè)耳屬（Pleurotus）的糙皮側(cè)耳（P.ostreatus）其發(fā)酵液具有降解黃曲霉毒素的功效。Das 等[25]利用側(cè)耳屬的平菇發(fā)酵液降解玉米秸稈中的AFB1。

前期研究表明，在平菇發(fā)酵料制備過程中，變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）等大量的微生物參與其中，發(fā)酵微生物在不同階段基因豐度此消彼長(zhǎng)，將物料分解成容易被平菇菌絲吸收的小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[26]。這些菌群是否含有能夠降解玉米芯中的黃曲霉毒素的菌類，黃曲霉毒素含量是否變化尚未有分析報(bào)道。鑒于此，筆者利用前期以玉米芯為原料發(fā)酵制備平菇培養(yǎng)料進(jìn)行的宏基因組和代謝組檢測(cè)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，通過采用非度量多維尺度排序法（non-metric multidimensional scaling，NMDS）研究不同發(fā)酵階段發(fā)酵料中微生物種群基因豐度變化情況，通過進(jìn)一步分析不同階段相關(guān)微生物基因豐度的變化與黃曲霉毒素含量的相關(guān)性，闡明發(fā)酵培養(yǎng)料制備過程中菌群變化與黃曲霉毒素合成和降解的相關(guān)規(guī)律，挖掘出平菇發(fā)酵培養(yǎng)料制備過程中合成、抑制/降解黃曲霉毒素的潛在菌群，為食用菌培養(yǎng)料的安全制備提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 發(fā)酵原料及配方 發(fā)酵原料按照玉米芯84%、麩皮10%、尿素1%、石灰5% 的比例混勻，含水量68%。玉米芯、麩皮、石灰和尿素購(gòu)自新鄉(xiāng)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.1.2 試劑 LC-MC 級(jí)甲醇、水、甲酸、醋酸銨、FastDNA SPIN Kit for Soil（MP，USA）和AxyPrepDNA Purification Kit（AXYGEN，Inc.）購(gòu)自索萊寶公司。

1.2 方法

試驗(yàn)于2018 年11 月在河南省新鄉(xiāng)市進(jìn)行。按照Kong 等[26]的發(fā)酵方法，將攪拌均勻的培養(yǎng)料堆疊成高60 cm、頂部寬80 cm、底部寬120 cm 的梯形堆，長(zhǎng)度不限，每組培養(yǎng)料干料質(zhì)量為250 kg，堆好后，用直徑30 cm 的木棍從上往下打孔，孔間距為30 cm，試驗(yàn)進(jìn)行10 d，從第3 天開始翻堆，每隔1 d 翻1 次堆，至發(fā)酵結(jié)束共翻堆4 次，每翻堆1 次取1 次樣品。以建堆第1 天的培養(yǎng)料為對(duì)照（T1），另4 次取樣分別標(biāo)記為T2、T3、T4、T5。按照料堆形狀分別從左中右、上中下9 個(gè)位點(diǎn)各取樣1 kg，然后均勻混合為1 份樣品[27]，平均分成6 份，?80℃保存，用于發(fā)酵料微生物基因豐度及黃曲霉毒素含量分析。參照劉皓皓等[28]對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)料進(jìn)行的代謝組學(xué)檢測(cè)數(shù)據(jù)，測(cè)定黃曲霉毒素含量。采用Kong等[26]所做的發(fā)酵培養(yǎng)料宏基因組測(cè)定數(shù)據(jù)，對(duì)發(fā)酵料微生物進(jìn)行分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS（version 20.0）進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，采用單因素方差分析法（One-way ANOVA）比較不同發(fā)酵時(shí)期微生物多樣性及黃曲霉毒素含量的差異性，用最小差異顯著分析法（LSD）進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)結(jié)果用平均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵階段的黃曲霉毒素含量、曲霉屬相對(duì)基因豐度變化及相關(guān)性分析

以p<0.05 和VIP（variable importance in the projection）>1 為條件篩選出具有差異性表達(dá)的化合物，對(duì)在T1、T2、T3、T4、T5 時(shí)期檢測(cè)到的黃曲霉毒素進(jìn)行分析。結(jié)果如圖1-A 所示，共檢測(cè)到兩類黃曲霉毒素，分別為AFM1、AFG2，且在T1 期含量均極顯著低于T2 期，在T1 和T2 時(shí)期AFM1 和AFG2 峰面積分別為704 621.885、107 624.797 和2 271 682.524、694 248.663，而在T3、T4、T5 階段未檢測(cè)到黃曲霉毒素。采用NMDS 分析了不同發(fā)酵階段曲霉屬相對(duì)基因的豐度變化，結(jié)果如圖1-B 所示，在T2 期，曲霉屬相對(duì)基因豐度最高，為2.00%，T1期最低，為0.01%，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，在T3～T5期，曲霉屬相對(duì)基因豐度極顯著降低，分別為0.60%、0.30%和0.06%，表明發(fā)酵初期的升溫過程有利于曲霉繁殖，導(dǎo)致黃曲霉毒素含量增加。

圖1 不同發(fā)酵階段黃曲霉毒素含量及曲霉屬相對(duì)基因豐度Fig.1 Aflatoxin content and relative gene abundance of Aspergillus at different fermentation stages

為了探究黃曲霉毒素含量與曲霉屬間的關(guān)系，對(duì)在T1、T2、T3、T4、T5 時(shí)期檢測(cè)到的黃曲霉毒素含量與各階段的曲霉屬基因豐度進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析。結(jié)果表明，AFM1 和AFG2 含量與曲霉屬基因豐度呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.489、0.530（表1），說(shuō)明曲霉屬是合成黃曲霉毒素AFM1和AFG2 的種屬。

表1 不同發(fā)酵階段黃曲霉毒素含量與曲霉屬基因相對(duì)豐度變化相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis between aflatoxin content and relative abundance changes of Aspergillus genes at different fermentation stages

2.2 不同發(fā)酵階段發(fā)酵料中微生物種群基因豐度變化情況

為了確定發(fā)酵培養(yǎng)料制備過程中微生物種群的遺傳信息，推測(cè)這些微生物菌群是否與降解黃曲霉毒素有關(guān)，對(duì)不同階段的發(fā)酵料樣品進(jìn)行了宏基因組測(cè)序和分析研究。采用非度量多維尺度排序法分析了不同發(fā)酵階段微生物種群的基因豐度變化。筆者將文獻(xiàn)報(bào)道的抑制/降解黃曲霉毒素相關(guān)的菌群和本研究中相對(duì)豐度較高的優(yōu)勢(shì)屬作為研究對(duì)象，結(jié)果表明，在本研究中，僅富集到纖維菌屬、紅球菌屬、鏈霉菌屬、假單胞菌屬、分枝桿菌屬、芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、黃桿菌屬等細(xì)菌，并未檢測(cè)到假密環(huán)菌屬、原毛平革菌屬、側(cè)耳屬等屬的真菌（圖2）。在屬水平上，不同階段有不同的優(yōu)勢(shì)屬。在發(fā)酵前期（T1 期），不動(dòng)桿菌屬、假單胞菌屬、鞘氨醇桿菌屬、谷氨酰胺桿菌屬、嗜麥芽窄食單胞菌屬豐度較高，在嗜熱階段（T2、T3 期），芽孢桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、假黃色單胞菌屬、類芽胞桿菌屬、直絲菌屬豐度較高；在發(fā)酵后期（T4、T5 期），假黃色單胞菌屬、藤黃單胞菌屬、高溫雙岐菌屬、假單胞菌屬、黃單胞菌屬等豐度較高。其中，不動(dòng)桿菌屬在T1、T2、T3 期豐度較高，且在T2 期達(dá)到最高（37.18%），高于發(fā)酵料制備整個(gè)時(shí)期的所有菌群，但到T4、T5期豐度分別降至0.25%、0.20%；假單胞菌屬在發(fā)酵前期豐度較高（11.48%），T2 期降至最低（0.32%），在T3、T4、T5 期豐度提高，分別為1.65%、2.92%、2.66%；假黃色單胞菌屬在T1、T2 階段豐度較低，在T3、T4、T5 期豐度逐漸提高，在T5 期達(dá)到最高（13.59%）；類芽胞桿菌屬、芽孢桿菌屬在整個(gè)時(shí)期豐度一直較高，在嗜熱階段（T3 期）均為最高（3.76%、12.62%）（表2）。

表2 不同發(fā)酵階段基于屬水平的種群基因豐度Table 2 Communities gene abundance based on the genus level at different fermentation stages %

圖2 不同發(fā)酵階段基于屬水平的微生物種群結(jié)構(gòu)變化Fig.2 Microbial communities changes at the genus level at the different fermentation stages

2.3 黃曲霉毒素含量與不同階段相關(guān)微生物基因豐度變化的相關(guān)性分析

為了進(jìn)一步探究黃曲霉毒素含量與優(yōu)勢(shì)菌群之間的關(guān)系，對(duì)在T1、T2、T3、T4、T5 時(shí)期檢測(cè)到的黃曲霉毒素含量與各階段相對(duì)豐度較大的優(yōu)勢(shì)屬基因豐度進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析。由表3 可知，AFM1 含量與不動(dòng)桿菌屬、乳酸桿菌屬均呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.961、0.765；AFG2 含量與不動(dòng)桿菌屬、乳酸桿菌屬均呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.960、0.764；AFM1 和AFG2 含量與高溫雙岐菌屬、假黃色單胞菌屬、海洋擬諾卡氏菌屬、類芽胞桿菌屬、藤黃單胞菌屬、直絲菌屬、黃單胞菌屬呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)。

表3不同生長(zhǎng)時(shí)期黃曲霉毒素含量與微生物種群基因豐度的相關(guān)性分析Table 3 Correlation between aflatoxin content and gene abundance of microbial communities during different growth periods

對(duì)藤黃單胞菌屬、嗜麥芽窄食單胞菌屬、分枝桿菌屬、芽孢桿菌屬、類芽胞桿菌屬等可有效去除黃曲霉毒素的種屬進(jìn)行進(jìn)一步分析。結(jié)果見圖3，在T1～T3 階段，類芽孢桿菌屬基因豐度呈增加趨勢(shì)，在T4～T5 階段，其基因豐度呈降低趨勢(shì)，在T3期，基因豐度最高；T3～T5 階段，假黃色單胞菌屬、高溫雙岐菌屬為優(yōu)勢(shì)屬，且假黃色單胞菌屬呈增加趨勢(shì)，高溫雙岐菌屬在T4 期基因豐度達(dá)到最高，在T5 期大幅下降，但是這幾種屬未見有降解黃曲霉毒素的報(bào)道。

圖3 不同發(fā)酵階段降解黃曲霉毒素相關(guān)屬種群結(jié)構(gòu)變化Fig.3 Histogram of communities changes of aflatoxin-related genera at different fermentation stages at the genus level

3 討論與結(jié)論

筆者研究發(fā)現(xiàn)，在平菇發(fā)酵培養(yǎng)料制備過程中T1、T2、T3、T4、T5 時(shí)期共檢測(cè)到兩類黃曲霉毒素，分別為AFM1、AFG2，含量在發(fā)酵初期較高，發(fā)酵中后期檢測(cè)含量為0。李亞莉等[29]接種產(chǎn)毒黃曲霉進(jìn)行模擬普洱茶發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果表明，發(fā)酵初期，黃曲霉在茶葉中生長(zhǎng)較快，至發(fā)酵4 d 時(shí)，茶葉中已有大量的黃曲霉生長(zhǎng)，但到發(fā)酵后期（8 d 以后）長(zhǎng)勢(shì)變?nèi)?，發(fā)酵終止時(shí)，未檢測(cè)到黃曲霉毒素，與筆者的研究結(jié)果基本一致。

通過對(duì)黃曲霉毒素含量與不同階段曲霉屬基因相對(duì)豐度變化的相關(guān)性分析，表明AFM1 和AFG2 含量與曲霉屬呈顯著正相關(guān)，與不動(dòng)桿菌屬、乳酸桿菌屬呈極顯著正相關(guān)；與高溫雙岐菌屬、假黃色單胞菌屬、海洋擬諾卡氏菌屬、類芽胞桿菌屬、藤黃單胞菌屬、直絲菌屬、黃單胞菌屬呈極顯著負(fù)相關(guān)，推測(cè)呈負(fù)相關(guān)的這些菌群可能與抑制/降解黃曲霉毒素AFM1、AFG2 有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)藤黃單胞菌屬的Luteimona ssp.CW574、類芽胞桿菌屬有高效地降解黃曲霉毒素的能力[12,18]，但高溫雙岐菌屬、假黃色單胞菌屬、直絲菌屬、黃單胞菌屬是否能降解黃曲霉毒素尚未見報(bào)道，可推測(cè)類芽胞桿菌屬、藤黃單胞菌屬是降解平菇發(fā)酵培養(yǎng)料制備過程中黃曲霉毒素AFM1 和AFG2 的主要菌群。

黃曲霉毒素的污染主要在溫度高、濕度大、通風(fēng)透氣條件不良等條件下產(chǎn)生[29]，在平菇發(fā)酵培養(yǎng)料制備過程中，T2 期料溫由30 ℃升至55 ℃，含水量68%，且在T2 期，曲霉屬相對(duì)基因豐度最高，為2.00%，導(dǎo)致黃曲霉毒素含量增加。盡管在T1～T2期，存在類芽胞桿菌屬、黃單胞菌屬菌群，但由于其基因豐度較低，并未發(fā)揮作用。T3～T5 期，料溫升至70 ℃左右，不利于黃曲霉菌群的繁殖，曲霉屬相對(duì)基因豐度極顯著降低，同時(shí)類芽胞桿菌屬、藤黃單胞菌屬、海洋擬諾卡氏菌屬基因豐度均增加，藤黃單胞菌屬為優(yōu)勢(shì)屬，但海洋擬諾卡氏菌屬基因豐度較低，這些菌群均具有降解黃曲霉毒素的功能，因此推測(cè)平菇發(fā)酵培養(yǎng)料發(fā)酵過程中藤黃單胞菌屬和類芽胞桿菌屬是主要的黃曲霉毒素降解菌。

綜上所述，藤黃單胞菌屬和類芽胞桿菌屬是平菇發(fā)酵培養(yǎng)料發(fā)酵過程中降解黃曲霉毒素AFM1和AFG2 的主要降解菌，后續(xù)還需要進(jìn)一步分離相關(guān)菌株進(jìn)行驗(yàn)證。