施二榮，胡能兵，隋益虎，袁友志，來喜月，王 勃

（1.安徽科技學(xué)院農(nóng)學(xué)院 安徽鳳陽 233100；2.安徽金泰種業(yè)有限公司 合肥 230031）

辣椒（Capsicum）為茄科辣椒屬一年生草本植物[1]。目前，全球共有5 個辣椒栽培種（Capsicum annuumL.、Capsicum chinenseL.、Capsicum frutescensL.、CapsicumpubescensL.、CapsicumbaccatumL.）和20 多個野生種[2]，其中我國種植面積最大的是C.annuum，該栽培種具有產(chǎn)量高、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，但抗性差異較大；C.frutescens和C.chinense兼具辣度高、抗性強(qiáng)等特點(diǎn)，但其栽培條件受區(qū)域限制較大且產(chǎn)量很低。有研究表明，各辣椒栽培種種間雜交均存在不同程度的生殖障礙[3-4]。

種間雜交是拓寬辣椒栽培種遺傳基礎(chǔ)和創(chuàng)制種質(zhì)資源的有效方式[5-6]。為了能有效創(chuàng)制新的辣椒種質(zhì)資源，聚合更多的有益性狀，前人結(jié)合胚胎拯救技術(shù)導(dǎo)入外源基因，拓寬主要栽培種的遺傳背景。Sui 等[7]通過C.annuum7033×C.chinense7020獲得F1雜種，并自交獲得大量分離后代；Yoon 等[8]將炭疽病抗性從C.baccatum滲入到C.annuum，在C.annuum回交后代中篩選出了大量高抗炭疽病的改良植株。

近年來高辣、高抗已成為辣椒育種的重要方向之一[9]。辣度較高、抗逆性較強(qiáng)的C.chinense、C.frutescens由于產(chǎn)量低而在我國栽培面積始終較小。為了把高辣度、強(qiáng)抗逆和高產(chǎn)量相結(jié)合，筆者利用3 個栽培種辣椒進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，通過對雜交坐果率、胚萌發(fā)率、拯救時期以及F1幼胚生根效果等指標(biāo)的觀測，旨在建立一套系統(tǒng)的胚胎拯救技術(shù)體系，提高遠(yuǎn)緣雜交的成功率。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料包含3 個辣椒栽培種（圖1），即8 份C.annuumL.、8 份C.chinenseL.和1 份C.frutescensL.共17 份試驗(yàn)材料（表1），均來自于安徽科技學(xué)院辣椒種質(zhì)資源庫，于2022 年3 月種植于安徽科技學(xué)院種植科技園3 號溫室，四周覆蓋30 目防蟲網(wǎng)，栽培期間進(jìn)行正常的生產(chǎn)管理。

表1 用于遠(yuǎn)緣雜交的辣椒親本信息Table 1 Capsicum parental information for distant hybridization

圖1 3 個辣椒栽培種的典型圖片F(xiàn)ig.1 Typical pictures of three Capsicum species

1.2 方法

1.2.1 種間雜交 不同辣椒材料進(jìn)入盛花期后選配了18 對正反交組合（表2）。雜交授粉時選擇適齡花蕾徒手去雄，授粉在晴天07：00 至10：30、15：30 至18：00 進(jìn)行，授粉后掛牌標(biāo)記，第2 天重復(fù)授粉1 次，授粉后14 d 統(tǒng)計(jì)坐果率。

表2 3 個栽培種辣椒種間雜交的正反交組合Table 2 Reciprocal interspecific hybridization combinations of Capsicum species

1.2.2 消毒及拯救（萌發(fā)）培養(yǎng)基篩選 授粉后第34 d，選取Ca4×Cc5 未成熟的F1幼胚在無菌組培室的潔凈操作臺上進(jìn)行消毒處理，流水沖洗表面灰塵后用75% 的酒精進(jìn)行果實(shí)表面消毒1 min，剖開果實(shí)內(nèi)腔胎座及幼胚消毒30 s，再用0.1% 的氯化汞浸泡3 min，無菌水清洗3～5 次。將剝離的幼胚分別接種到MF0（MS+30 g·L-1蔗糖+6 g·L-1瓊脂，pH 6.0）、MF1、MF2、MF3、MF4、MF5、MF6培養(yǎng)基上（表3），從而篩出最優(yōu)萌發(fā)培養(yǎng)基。每個處理6 次重復(fù)，每瓶接種5 個幼胚，置于（25±1）℃條件下培養(yǎng)，光照度為2500 lx，光周期為12 h/12 h（光照/黑暗），接種30 d 后統(tǒng)計(jì)胚萌發(fā)率。

表3 胚胎萌發(fā)及幼苗生根培養(yǎng)基Table 3 The medium of embryonic germination and seedling rooting

1.2.3 不同胚拯救時期篩選 試驗(yàn)設(shè)置了5 個處理時期，即在授粉后30、32、34、36、38 d 時剪下幼果，放入篩選出的最佳培養(yǎng)基中進(jìn)行胚胎拯救。具體操作為：在對應(yīng)時間分別從每個雜交組合植株上取2 個青果，取出內(nèi)部全部F1幼胚，消毒及培養(yǎng)條件同1.2.2，每個處理均接種3 瓶，每瓶2～9 個幼胚（視果實(shí)內(nèi)幼胚多少而定）。培養(yǎng)30 d 后統(tǒng)計(jì)胚萌發(fā)率。

1.2.4 生根培養(yǎng)基篩選 試驗(yàn)共設(shè)10 個處理組合，以不加激素的SG0（MS+30 g·L-1蔗糖+6 g·L-1瓊脂，pH 6.0）為對照，用萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）、吲哚乙酸（IAA）3 種生長類激素各3 個濃度水平進(jìn)行搭配（表3）。將拯救成功的高2～4 cm 的Ca4×Cc5 幼苗轉(zhuǎn)接至SG 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同1.2.2。每個處理設(shè)置4 次重復(fù)，每次重復(fù)接種3 株幼苗，接種30 d 后統(tǒng)計(jì)生根莖段數(shù)、生根率、每莖段生根數(shù)及平均根長。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 坐果指標(biāo)測定 授粉后記錄各組合授粉總花數(shù)，于第14 天調(diào)查坐果情況，計(jì)算坐果率。

1.3.2 胚萌發(fā)指標(biāo)測定 將幼胚接入培養(yǎng)基后，于第30 天觀察幼胚的萌發(fā)情況，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)幼胚數(shù)，幼胚萌發(fā)以長出子葉為標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.3 根系各指標(biāo)測定 將莖段接入不同的SG 培養(yǎng)基后，于第30 天對各處理的生根數(shù)、生根率、平均每莖段生根數(shù)、平均根長進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Microsoft Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表制作，采用DPS7.05 進(jìn)行完全隨機(jī)單因素試驗(yàn)方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種間雜交組合的坐果率與種子數(shù)統(tǒng)計(jì)

由表4 可知，18 個正反交組合，共授粉花數(shù)1451 朵，平均坐果率總體較低，僅為7.58%，平均每果種子數(shù)為14.82 粒。但不同栽培種做母本時，坐果數(shù)（坐果率）存在差異。C.annuum做母本時共授粉899 朵花，坐果數(shù)為72 個，平均坐果率為8.01%，共獲得種子1336 粒，平均每果種子數(shù)18.56 粒；C.chinense為母本時共授粉520 朵花，坐果數(shù)為28個，平均坐果率為5.38%，共獲得種子223 粒，平均每果種子數(shù)7.96 粒；C.frutescens做母本時，共授粉32 朵花，坐果數(shù)為10 個，坐果率31.25%，獲得種子數(shù)為71 粒，平均每果種子數(shù)7.10 粒。3 個栽培種分別做母本時，C.frutescens的坐果率最高，但其產(chǎn)生的種子數(shù)最少；C.annuum做母本時坐果率次之，其產(chǎn)生種子數(shù)最多；C.chinense做母本時，坐果率最低，所產(chǎn)生的種子數(shù)介于C.frutescens和C.annuum之間。

表4 正反交授粉及坐果統(tǒng)計(jì)Table 4 Pollination and fruit-setting of reciprocal interspecific

同時，不同的雜交組合，正反交坐果率也不同。雜交組合Ca1×Cc3、Ca2×Cc1 正交時均能產(chǎn)生雜交果實(shí)，坐果率分別為18.18%、14.29%，反交時無果實(shí)產(chǎn)生；Ca8×Cc6、Cc7×Cf1、Ca7×Cc4 正交時均無果實(shí)，反交則有果實(shí)，坐果率分別為32.50%、31.25%、11.54%。Ca6×Cc2、Ca4×Cc5、Ca3×Cc8、Ca5×Cc2 正反交時均有少數(shù)雜交果實(shí)產(chǎn)生，正交坐果率為3.13%～11.57%，反交坐果率為1.67%～5.00%。

2.2 胚胎拯救的萌發(fā)培養(yǎng)基篩選

將Ca4×Cc5 授粉后34 d 的幼胚分別接種于7種培養(yǎng)基上，結(jié)果如表5 所示，幼胚在MF0、MF1、MF2及MF4上萌發(fā)率相同，MF5次之，MF6的胚發(fā)育率較低，MF3胚萌發(fā)率為0，推測可能是激素濃度過高，抑制了胚的萌發(fā)。因此，從試驗(yàn)成本方面考慮，選擇MF0作為最適合幼胚萌發(fā)的培養(yǎng)基，即不需要添加激素，胚胎拯救在MF0培養(yǎng)基上萌發(fā)情況見圖2。

表5 培養(yǎng)基對辣椒幼胚胚胎拯救的影響Table 5 Effect of culture medium on embryo rescue of Capsicum

圖2 不同發(fā)育時期的辣椒胚胎拯救Fig.2 Embryo germination and plantlet growth in different development stages

2.3 辣椒不同胚齡對胚胎拯救的影響

由于該部分試驗(yàn)對果實(shí)數(shù)量有要求，故選擇了果實(shí)數(shù)量大于等于10（每個拯救時期需要2 個青果）的5 個雜交組合進(jìn)行試驗(yàn)。由表6 可知，除Ca6×Cc2 組合外，其他4 個組合胚的萌發(fā)率在胚胎拯救期間隨時間的延長均呈先上升后下降的趨勢，34 d 的幼胚萌發(fā)率最高，為45.45%，38 d 有3 個雜交組合的幼胚萌發(fā)率為0，其原因可能為取材時間過晚，胚已死亡。在Ca1×Cc3、Ca6×Cc2、Cc6×Ca8、Ca4×Cc5 雜交組合中，34 d 胚齡的胚萌發(fā)率均最高，分別為31.58%、34.62%、45.45%、36.00%，僅在Cf1×Cc7 雜交組合中，34 d 胚齡的幼胚萌發(fā)率比32 d 胚齡低20.83%。可見，C.annuum或C.chinense做母本時，34 d 胚齡的幼胚最適合于拯救；而當(dāng)C.frutescens做母本時，32 d 胚齡的幼胚最適合拯救。雜交組合Cf1×Cc7 整個幼胚拯救期間的胚平均萌發(fā)率最低，為11.43%，不同栽培種做母本時，其胚的萌發(fā)率有所不同。

表6 不同胚齡對辣椒胚胎拯救的影響Table 6 Effects of different embryo ages on embryo rescue of Capsicum

2.4 生根培養(yǎng)基篩選

由表7 可知，以SG0為基本培養(yǎng)基，添加3 個不同種類3 種不同濃度的生長類激素的培養(yǎng)基，其生根效果均存在差異。生根莖段數(shù)、生根率、平均每莖段生根數(shù)和平均根長均以SG3表現(xiàn)最優(yōu)，平均每莖段生根數(shù)和平均根長顯著高于其他處理。由圖3可知，添加相同濃度不同種類的激素誘導(dǎo)的根形態(tài)也存在差異。添加0.5 mg·L-1NAA 的SG3表現(xiàn)為根多且粗壯，添加0.5 mg·L-1IBA 的SG6根較細(xì)且生根率低，添加0.5 mg·L-1IAA 的SG9表現(xiàn)為根少且長短不均，以MS 為培養(yǎng)基時，SG0表現(xiàn)為根少且細(xì)長。綜上所述，添加0.5 mg·L-1NAA 的SG3培養(yǎng)基為辣椒組培苗生根最理想的培養(yǎng)基。

表7 不同濃度激素對辣椒組培苗生根影響Table 7 Effects of different concentrations of hormones on rooting of Capsicum tissue culture seedlings

3 討論與結(jié)論

胚敗育是辣椒種間雜交的一個共同特征[10]。在多數(shù)遠(yuǎn)緣雜交中，通常會收獲到癟的或退化的種子，這一現(xiàn)象被認(rèn)為是受精后發(fā)育障礙導(dǎo)致的[11]。Martins 等[4]從C.annuum×C.baccatum組合中得到了9 粒種子，但有7 粒沒有發(fā)育成完整植株；Yoon等[12]觀察到C.annuum×C.baccatum雜交后胚敗育發(fā)生在授粉后15 d，另一個現(xiàn)象是種子在成熟前便開始干燥失去活力。筆者試驗(yàn)中的18 對雜交組合，部分授粉后不能坐果，故無法對其進(jìn)行胚胎拯救。另一部分授粉后可坐果，但因不同栽培種間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，且存在雜交障礙，為防止果實(shí)內(nèi)部幼胚在發(fā)育后期死亡而無法獲得雜種植株，故選擇在特定時間對其進(jìn)行胚胎拯救。此外，筆者還觀察到多數(shù)辣椒材料雜交后只有微小的種皮，部分種子中途褐化失去活力或沒有種子，但果實(shí)仍能正常生長。Pickersgill[13]認(rèn)為，受精后胚敗育的合子障礙問題可以通過植物組織培養(yǎng)，特別是胚胎拯救技術(shù)來解決。

基因型不同，種間雜交、胚胎拯救技術(shù)難易程度不同。程志芳等[14]采用常規(guī)授粉技術(shù)對5 個辣椒栽培品種進(jìn)行了種間正反交，僅從一小部分的辣椒雜交組合中獲得了雜種植株。筆者的研究中總體種間雜交平均坐果率低，但不同栽培種做母本時仍有相對較大的差異。C.annuum為母本時，坐果率為0～18.18%，平均每果種子數(shù)為0～20.84 粒；C.chinense為母本時，坐果率為0～32.50%，平均每果種子數(shù)0～9.92 粒；C.frutescens為母本時，坐果率為31.25%，平均每果種子數(shù)7.10 粒。試驗(yàn)中正反交結(jié)實(shí)率差異較大，可見坐果率、果實(shí)內(nèi)種子數(shù)與父母本的基因型有關(guān)。此外，筆者的試驗(yàn)在溫度較高的溫室內(nèi)進(jìn)行，推測高溫可能會影響父本的花粉活力。

胚萌發(fā)是胚拯救的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。培養(yǎng)基成分對幼胚萌發(fā)和存活有直接影響。據(jù)報(bào)道6-BA、NAA、GA3、ZT、IAA 對不同作物的幼胚萌發(fā)具有促進(jìn)作用[15-18]，在辣椒胚胎拯救中常用的激素有IAA、GA3

[13，19]。但筆者研究發(fā)現(xiàn)不添加任何激素的MF0與添加IAA、6-BA 的處理無顯著差異，推測該階段導(dǎo)致幼胚敗育的關(guān)鍵是營養(yǎng)虧缺，而不是激素水平的高低。

適宜的胚齡是胚胎拯救成功與否的最重要的影響因子之一。一般情況下，在雜種胚敗育之前將胚取出進(jìn)行離體培養(yǎng)可避免胚的早衰，而胚發(fā)育的越完全，拯救的成功率越高[20]。筆者的試驗(yàn)以30～38 d 胚齡的幼胚進(jìn)行離體培養(yǎng)，其中C.annuum×C.chinense、C.chinense×C.annuum的雜交組合中34 d胚齡的胚萌發(fā)率最高，C.frutescens×C.chinense的雜交組合中32 d 的胚萌發(fā)率最高，而38 d 的胚萌發(fā)率普遍較低，主要表現(xiàn)為幼胚褐化，其主要原因推測為不同栽培種種間的雜交果實(shí)熟性有差異，導(dǎo)致酚類物質(zhì)積累不同，故胚胎拯救效果不佳。因此，針對不同的辣椒栽培種，仍需要探究適合幼胚培養(yǎng)的最佳胚齡。

綜上所述，試驗(yàn)中不同辣椒栽培種正反交組合坐果率整體較低但仍有差異。最佳胚萌發(fā)培養(yǎng)基選擇低成本的MF0（MS+30 g·L-1蔗糖+6 g·L-1瓊脂，pH 6.0），胚平均萌發(fā)率可達(dá)到20%。胚拯救適宜的取材時期應(yīng)在授粉后32～34 d，此時胚拯救成功率最高。生根培養(yǎng)基應(yīng)選擇SG3（MS+30 g·L-1蔗糖+6 g·L-1瓊脂＋0.5 mg·L-1NAA，pH 6.0）。該體系適合本試驗(yàn)中3 個栽培種種間雜交幼胚的培養(yǎng)，研究結(jié)果為加快辣椒新品種選育進(jìn)程奠定了基礎(chǔ)。