邵文秀 盧淑嬌 韓麗林

(麗水市人民醫(yī)院皮膚科,浙江 麗水 323000)

皮膚鱗狀細(xì)胞癌(CSCC)是一種高發(fā)病率的皮膚惡性腫瘤,盡管手術(shù)、放療和光動(dòng)力等治療方案不斷進(jìn)展,但腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是CSCC患者死亡的重要原因〔1〕。了解CSCC進(jìn)展的分子機(jī)制對(duì)開發(fā)有效的治療策略至關(guān)重要。環(huán)狀RNA(circRNA)是豐富、穩(wěn)定、進(jìn)化保守的非編碼RNA,其通過與微小RNA(miRNA)或其他分子結(jié)合,抑制其功能,在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平介導(dǎo)基因表達(dá),circRNA在CSCC等多種類型的癌癥異常表達(dá),參與調(diào)控癌細(xì)胞多種功能,可能作為腫瘤診斷的潛在標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)〔2,3〕。circ_0000337在食管鱗癌組織中表達(dá)明顯上調(diào),敲減circ_0000337通過上調(diào)致癌因子miR-670-5p表達(dá)顯著抑制食管鱗癌細(xì)胞增殖和遷移〔4〕。miR-578是一種抑癌因子,過表達(dá)miR-578可誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡,抑制克隆形成〔5〕。circ_001621通過減弱miR-578對(duì)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)4和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9抑制作用,促進(jìn)骨肉瘤的增殖和遷移〔6〕。生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)到miR-578與circ_0000337存在潛在結(jié)合位點(diǎn),但circ_0000337能否靶向miR-578調(diào)控CSCC進(jìn)展未見報(bào)道。本研究探討circ_0000337靶向miR-578對(duì)CSCC細(xì)胞A431細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1CSCC組織來源 CSCC組織及癌旁組織(鄰近非腫瘤標(biāo)本)取自麗水市人民醫(yī)院41例CSCC患者。男28例,女13例,年齡32～60歲,中位年齡45歲。組織立體后立即置于液氮冷凍,后保存在-80 ℃。本研究符合《赫爾辛基宣言》指導(dǎo)原則,患者均簽署書面知情同意書。

1.2細(xì)胞和試劑 CSCC細(xì)胞A431購自美國ATCC;ReverTra Ace qPCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光染料(SYBR) qPCR混合物(Mix)購自日本TOYOBO公司;Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司;si-NC、si-circ_0000337、miR-NC、miR-578 mimics、pcDNA、pcDNA-circ_0000337、anti-miR-NC、anti-miR-578購自廣州銳博生物公司;Trizol試劑、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)購自南京凱基生物公司;Transwell小室購自美國BD公司;MMP-2兔多抗(ab97779)、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH,ab9485)、羊抗兔IgG(ab205718)、MMP-9兔多抗(ab38898)購自上海艾博抗貿(mào)易公司。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)circ_0000337、miR-578表達(dá) Trizol法提取CSCC組織、癌旁組織的總RNA,用ReverTra Ace qPCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將200 ng RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后用SYBR qPCR Mix進(jìn)行RT-qPCR。以GAPDH和U6分別作為circ_0000337、miR-578的內(nèi)參基因,2-ΔΔCt法計(jì)算其表達(dá)量。circ_0000337引物(上游5′-TCAGGATGCCTTGGGACT-3′,下游5′-TGTGCAGCCGGTCTAACC-3′);GAPDH引物(上游5′-CGCTCT-CTGCTCCTCCTGTTC-3′,5′-ATCCGTTGAC-TCCGACCTTCAC-3′);miR-578引物(上游5′-GTGCAGGGTGTTAGGA-3′,下游5′-GAAGAACACGTCTGGT-3′);U6引物(上游5′-CGAGCACAGAATCGCTTCA-3′,下游5′-CTCGCTTCGGCAGCACATAT-3′)。

1.4A431細(xì)胞培養(yǎng)和分組 A431細(xì)胞采用添加10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、含5% CO2培養(yǎng)箱孵育。將對(duì)數(shù)期A431細(xì)胞(2×104個(gè))接種于24孔板,當(dāng)細(xì)胞40%時(shí)用Lipofectamine2000將40 nmol/L的寡核苷酸或2 μg質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染A431細(xì)胞,共分為si-NC組、si-circ_0000337組、miR-NC組、miR-578組、pcDNA組、pcDNA-circ_0000337組、si-circ_0000337+anti-miR-NC組、si-circ_0000337+anti-miR-578組。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞,RT-qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果后進(jìn)行功能分析。

1.5CCK-8法檢測(cè)A431細(xì)胞活力 將轉(zhuǎn)染的A431細(xì)胞(5×103個(gè))接種在96孔板中,37 ℃培養(yǎng)箱孵育至細(xì)胞貼壁后將10 μl CCK-8 溶液加入每個(gè)孔中。孵育2 h后,酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)量吸光度(OD)值。

1.6克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A431細(xì)胞克隆能力 將轉(zhuǎn)染的A431細(xì)胞(5×102個(gè))接種在6孔板中,37 ℃培養(yǎng)箱孵育12～14 d直至出現(xiàn)細(xì)胞集落。棄去培養(yǎng)液,用4%甲醛固定細(xì)胞集落,用1%結(jié)晶紫染色30 min,光學(xué)顯微鏡拍照,計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的集落數(shù)。

1.7劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A431細(xì)胞遷移能力 將轉(zhuǎn)染的A431細(xì)胞(5×104個(gè))接種于6孔板并在37 ℃培養(yǎng)箱孵育,當(dāng)細(xì)胞融合為一層時(shí),用200 μl吸管尖端劃傷細(xì)胞,磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2次去除非黏附細(xì)胞,加入新鮮培養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng)箱孵育。培養(yǎng)初始時(shí)、培養(yǎng)24 h時(shí)分別將6孔板置于顯微鏡下拍照,記錄劃痕寬度。劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.8Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A431細(xì)胞侵襲能力 用無血清培養(yǎng)基重懸轉(zhuǎn)染的A431細(xì)胞,取200 μl接種到Transwell裝置上腔室,下室加入500 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。在37 ℃培養(yǎng)箱孵育24 h后,用4%多聚甲醛固定膜下表面附著的細(xì)胞20 min,并用0.1%結(jié)晶紫溶液染色。在顯微鏡下對(duì)隨機(jī)選取的5個(gè)視野細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù),取均值表示侵襲數(shù)。

1.9雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 將含有miR-578結(jié)合位點(diǎn)的circ_0000337野生序列或不含該結(jié)合位點(diǎn)的突變序列分別克隆到psiCHECK-2熒光素酶載體中,構(gòu)成重組載體野生型(WT)-circ_0000337、突變型(MUT)-circ_0000337,該步驟由廣州銳博生物公司完成。將WT-circ_0000337+miR-578 mimics、WT-circ_0000337+ miR-NC、MUT-circ_0000337+ miR-578 mimics、MUT-circ_0000337 +miR-NC分別轉(zhuǎn)染A431細(xì)胞。共轉(zhuǎn)染48 h后,用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)分析檢測(cè)相對(duì)熒光素酶活性。

1.10Western印跡檢測(cè)A431細(xì)胞MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá) RIPA裂解液提取總蛋白,取30 μg蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),然后通過電印跡轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上。膜封閉后,4 ℃下孵育MMP-2抗體(1∶2 500稀釋)、MMP-9抗體(1∶2 500稀釋)和內(nèi)參GAPDH抗體(1∶2 500稀釋)12 h。25 ℃下孵育酶標(biāo)二抗(1∶3 000稀釋)2 h?；瘜W(xué)發(fā)光法顯色反應(yīng),Quantity One軟件分析目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad7.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、One-Way ANOVA和LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1circ_0000337和miR-578在CSCC組織中的表達(dá) CSCC組織中circ_0000337表達(dá)(4.37±0.33)顯著高于癌旁組織(1.00±0.07;t=63.966,P=0.000),CSCC組織中miR-578表達(dá)(0.29±0.04)顯著低于癌旁組織(1.00±0.08;t=50.828,P=0.000)。

2.2抑制circ_0000337表達(dá)對(duì)A431細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 si-circ_0000337組細(xì)胞中circ_0000337表達(dá)水平顯著低于si-NC組(P<0.05)。與si-NC組比較,si-circ_0000337組細(xì)胞OD值、克隆形成數(shù)、劃痕愈合率、侵襲數(shù)及MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05),見表1、圖1。

2.3miR-578過表達(dá)對(duì)A431細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 miR-578組細(xì)胞中miR-578表達(dá)水平顯著高于miR-NC組(P<0.05);與miR-NC組比較,miR-578組細(xì)胞OD值、克隆形成數(shù)、劃痕愈合率、侵襲數(shù)及MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05),見圖1、表2。

表1 抑制circ_0000337表達(dá)對(duì)A431細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.4干擾miR-578表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制circ_0000337表達(dá)對(duì)A431細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用 與si-circ_0000337+anti-miR-NC組比較,si-circ_0000337+anti-miR-578組A431細(xì)胞miR-578表達(dá)水平顯著降低,細(xì)胞OD值、克隆形成數(shù)、劃痕愈合率、侵襲數(shù)及MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05),見圖1、表3。

1～6:si-NC組、si-circ_0000337組、miR-NC組、miR-578組、si-circ_0000337+anti-miR-NC組、si-circ_0000337+anti-miR-578組圖1 各組MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)

表2 miR-578過表達(dá)對(duì)A431細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及雙熒光素酶報(bào)告結(jié)果比較

表3 干擾miR-578表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制circ_0000337表達(dá)對(duì)A431細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用

2.5circ_0000337靶向調(diào)控miR-578的表達(dá) 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件顯示circ_0000337可能與miR-578存在結(jié)合位點(diǎn),見圖2。

圖2 circ_0000337的序列中含有與miR-578互補(bǔ)的核苷酸序列

雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明,與WT-circ_0000337和miR-NC共轉(zhuǎn)染比較,共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-circ_0000337和miR-578 mimics的細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性顯著降低(P<0.05),見表2。RT-qPCR檢測(cè)顯示,與pcDNA組(1.00±0.00)比較,pcDNA-circ_0000337組細(xì)胞中miR-578表達(dá)水平(0.43±0.03)顯著降低(P<0.05);與si-NC組(0.98±0.06)比較,si-circ_0000337組細(xì)胞中miR-578表達(dá)水平(2.66±0.23)顯著升高(P<0.05)。表明circ_0000337通過直接與miR-578結(jié)合來調(diào)控miR-578表達(dá)。

3 討 論

circRNA表達(dá)失調(diào)被認(rèn)為與CSCC發(fā)生和發(fā)展有關(guān),研究表明,circ_0067772、circ_0070934、circ_001937等circRNA在CSCC中表達(dá)上調(diào),參與CSCC細(xì)胞過度增殖、凋亡抵抗及遷移侵襲,而敲減其表達(dá)則抑制CSCC細(xì)胞惡性表型〔7～9〕。本研究檢測(cè)到CSCC組織中circ_0000337表達(dá)顯著升高,但circ_0000337在CSCC進(jìn)展中的作用并未闡明。研究顯示,circ_0000337高表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者不良預(yù)后相關(guān),circ_0000337通過靶向miR-942-5p可上調(diào)MAT2A表達(dá),從而誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性表型〔10〕。circ_0000337在骨肉瘤細(xì)胞系表達(dá)上調(diào),沉默circ_0000337顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和遷移能力〔11〕。為探討circ_0000337在CSCC中作用,本研究結(jié)果顯示,抑制circ_0000337表達(dá)通過降低A431細(xì)胞活力,抑制其遷移、侵襲以克隆形成能力,這與研究〔11〕報(bào)道的抗癌作用類似,表明抑制circ_0000337表達(dá)通過抑制CSCC細(xì)胞惡性生物學(xué)行為來阻礙CSCC進(jìn)展。MMP-2和MMP-9可破壞血管基底膜、降解細(xì)胞外基質(zhì),在腫瘤轉(zhuǎn)移擴(kuò)散中起重要作用,其表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力存在顯著相關(guān)性,是常用的腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移標(biāo)志物〔12,13〕。本研究進(jìn)一步證實(shí)抑制circ_0000337表達(dá)的抗遷移、抗侵襲作用。

circRNA含有miRNA結(jié)合位點(diǎn),circRNA通過吸附miRNA能夠減弱其對(duì)靶mRNA的抑制作用,參與腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移過程,研究報(bào)道,circ_0000337在骨肉瘤中的致癌作用與調(diào)控miR-4458/BTB-CNC異體同源體(BACH)1通路相關(guān)〔11〕。本研究證實(shí),miR-578為circ_0000337的直接靶點(diǎn)。已有研究顯示,miR-578在多種腫瘤中充當(dāng)抑癌因子,如miR-578通過靶向血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)控因子抑制乳腺癌易感基因(BRCA)1/2相關(guān)乳腺癌血管生成〔14〕。沉默環(huán)狀RNA鋅指RNA結(jié)合蛋白(circZFR)通過miR-578顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的惡性行為,抑制體內(nèi)腫瘤的生長〔15〕。沉默circ_0005785可抑制肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯,其機(jī)制與靶向上調(diào)miR-578表達(dá)有關(guān)〔16〕。miR-578還可作為circ-CNST、circ_0006677的下游靶miRNA參與調(diào)控骨肉瘤、非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展〔17,18〕。本研究結(jié)果證實(shí),miR-578在CSCC中的抑癌功能。RT-qPCR檢測(cè)到miR-578表達(dá)受到circ_0000337負(fù)性調(diào)控,且在CSCC中抑制circ_0000337表達(dá)和過表達(dá)miR-578的抗腫瘤作用一致,提示CSCC中存在circ_0000337/miR-578通路。本研究表明,干擾miR-578表達(dá)顯著削弱抑制circ_0000337表達(dá)對(duì)A431細(xì)胞活力及遷移、侵襲、克隆形成能力的影響,進(jìn)一步證實(shí)circ_0000337靶向調(diào)控miR-578表達(dá)參與調(diào)控CSCC進(jìn)展。然而,本研究仍存在不足之處,circ_0000337下游是否存在其他miRNA,miR-578下游靶點(diǎn)仍需探討。此外,未來仍需開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證circ_0000337/ miR-578通路在CSCC中的作用。

綜上,circ_0000337在CSCC中表達(dá)上調(diào),miR-578表達(dá)下調(diào)。抑制circ_0000337通過靶向上調(diào)miR-578表達(dá)可抑制CSCC細(xì)胞A431增殖、遷移和侵襲。