翁珍麗 楊勤 方雪彬

(1金華市中心醫(yī)院急診重癥醫(yī)學科,浙江 金華 321000;2衢州市龍游縣人民醫(yī)院重癥監(jiān)護室;3金華市中心醫(yī)院急診科)

肺炎是一種常見的傳染病,是由病毒、細菌和真菌等病原體引起的下呼吸道感染,在全世界范圍內發(fā)病率和死亡率不斷上升,具有寒戰(zhàn)、發(fā)燒、胸痛、咳嗽、產生膿性痰等典型癥狀,嚴重影響患者的生活質量〔1〕。脂多糖(LPS)作為內毒素的一種有效成分,是革蘭陰性菌細胞壁的主要生物活性成分,是引起炎癥反應的關鍵。闡明肺炎的潛在機制,制定治療肺炎的新的有效策略具有重要意義〔2〕。蘿卜硫素具有很強的抗氧化、抗炎、抗癌等生物學活性,對細顆粒物誘導的人支氣管上皮細胞氧化應激和炎癥反應具有一定的抑制作用〔3〕,可抑制小細胞肺癌細胞的生長〔4〕,對鉻導致的大鼠肺損傷具有一定的預防作用〔5〕,但關于其對肺炎的緩解作用仍不清晰。核苷酸結合域樣受體蛋白(NLRP)3廣泛參與宿主免疫、炎癥反應過程,機體受到炎癥損害后,NLRP3可被特異性激活,活化的NLRP3進一步促進白細胞介素(IL)-1β、轉化生長因子(TGF)-β1等炎癥因子的釋放,進而加劇機體炎癥反應〔6,7〕。宋占帥等〔8〕研究發(fā)現NLRP3/IL-1β/TGF-β1通路在矽肺肺纖維化大鼠體內呈現高表達,與肺部損傷聯系密切。本研究探討蘿卜硫素對LPS誘導的小鼠肺炎的改善作用及NLRP3/IL-1β/TGF-β1信號通路的影響。

1 資料與方法

1.1動物 SPF級ICR雄性小鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司),6～8周齡,體質量13～16 g,生產許可證號為SCXK(京)2016-0006。所有小鼠飼養(yǎng)于本院動物房中,12 h晝夜交替,期間自由進食、飲水,動物房溫度約25 ℃,相對濕度約50%,按時清潔鼠籠及動物房。在實驗過程中按照動物使用的“3R”原則給予人道主義關懷。本研究經動物倫理委員會批準同意。

1.2主要試劑及儀器 LPS,HY-D1056、蘿卜硫素(HY-13755)、NLRP3通路激活劑(白藜蘆醇-4'-甲醚,33626-08-3)、NLRP3抑制劑(CY-09,貨號:HY-103666)購于美國MCE公司;小鼠IL-8 ELISA試劑盒(貨號:ml063162)購于上海酶聯免疫生物;小鼠TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、瑞氏染液(貨號:SEKM-0034、SEKM-0002、G1121、G1040)購于北京索萊寶科技有限公司;兔源NLRP3、IL-1β、TGF-β1、GAPDH一抗、羊抗兔IgG二抗(貨號:ab263899、ab254360、ab215715、ab9485、ab6721)購于Abcam。組織脫水機(ASP6025)、手動輪轉式切片機(RM2125RTS)購于德國Leica公司;光學顯微鏡(SMZ745)購于日本尼康公司;酶標儀(XElx800)購于美國Perkin Elmer公司;蛋白電泳儀(1659001)、半干轉膜儀(Trans-Blot SD)購于美國Bio-Rad公司;凝膠成像儀(GIS-500)購于Miulab公司等。

1.3動物模型制備及分組給藥 肺炎小鼠模型參考文獻〔9〕,50只ICR小鼠隨機分為對照組、模型組、蘿卜硫素組、抑制劑組、蘿卜硫素+激活劑組,每組10只,除對照組,其余各組滴鼻LPS(2 mg/kg)構建肺炎模型,對照組僅滴入相同體積的生理鹽水。觀察到小鼠行動緩慢、反應遲鈍、背毛豎起、飲食減少、顫抖、抱團等現象認為肺炎小鼠模型構建成功〔9〕。造模期間出現小鼠死亡或不符合條件的現象發(fā)生,及時選取備用小鼠進行造模處理。

造模成功后24 h開始藥物干預,蘿卜硫素組腹腔注射20 mg/kg的蘿卜硫素〔10〕,抑制劑組腹腔注射50 mg/kg的NLRP3通路抑制劑〔11〕,蘿卜硫素+激活劑組腹腔注射蘿卜硫素、1.5 mg/kg的NLRP3通路激活劑〔12〕,對照組、模型組腹腔注射等量生理鹽水。每天干預1次,連續(xù)1 w。

1.4小鼠血氣分析、血清炎癥因子指標測定 末次干預結束后24 h將各組小鼠麻醉,用血氣針在小鼠腹主動脈取血2 ml,在血氣分析儀上測定動脈血氧分壓(PaO2)、二氧化碳分壓(PaCO2)值。

腹主動脈取血約2 ml,靜置20 min,3 000 r/min離心15 min取上層血清,采用IL-8、IL-1β、TNF-α相關酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒測定各組小鼠血清中炎癥因子水平。

1.5小鼠肺泡灌洗液、肺組織標本獲取及肺濕/干比測定 肺泡灌洗液:將小鼠處死,剪開皮膚暴露肺組織,結扎小鼠右側主支氣管,用磷酸鹽緩沖液通過左側主支氣管灌入左側肺泡,觀察到小鼠肺部組織膨隆立即抽回緩沖液,換新鮮緩沖液繼續(xù)灌洗,重復灌洗3次,合并3次緩沖液,1 500 r/min離心10 min,上清液用于相關炎癥因子水平測定,沉淀用于炎癥細胞分類計數。

肺組織:獲取小鼠右肺組織,3只用于肺組織形態(tài)學觀察,3只用于肺濕/干值的測定,4只用于相關炎癥因子水平、通路相關蛋白表達水平測定。取各組右肺組織,用生理鹽水沖洗多余的血液及雜質后用濾紙輕輕拭干,稱量肺組織濕重,將肺組織放于80 ℃恒溫箱中干燥至恒重,稱量肺組織干重,肺組織濕重與肺組織干重之比即為肺濕/干比。

1.6小鼠肺組織HE染色觀察 取各組小鼠右肺組織,在4%甲醛溶液中固定48 h,采用常規(guī)石蠟包埋法獲得肺組織石蠟切片,根據HE染色試劑盒的要求進行HE染色,封片干燥后在顯微鏡中觀察、分析、拍照。

1.7小鼠肺泡灌洗液中炎癥細胞、炎癥因子測定 取各組小鼠肺泡灌洗液上清,采用IL-8、IL-1β、TNF-α相關ELISA試劑盒測定其中炎癥因子水平。取各組小鼠肺泡灌洗液沉淀,用生理鹽水重懸后涂抹在載玻片上,自然干燥后用瑞氏染液染色3 min,用水沖去染液,干燥后用中性樹膠進行封片,由經驗豐富的實驗人員在顯微鏡下統(tǒng)計嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、中性粒細胞數量。

1.8小鼠肺組織NLRP3/IL-1β/TGF-β1通路蛋白表達檢測 取各組肺組織,用蛋白質提取試劑盒提取其中的蛋白質,測定其中蛋白質含量,用蛋白上樣液將各組蛋白濃度調整至相同,取適量待測液,經過電泳實驗分離蛋白質,采用濕轉法將分離的蛋白質轉移到硝酸纖維膜上,加入兔源NLRP3、IL-1β、TGF-β1、GAPDH(1∶1 000)一抗,低溫孵育24 h,用TBST緩沖液洗滌3遍后加入辣根過氧化物標記的羊抗兔二抗,室溫孵育2 h,用TBST緩沖液洗滌3遍后進行顯色處理,在凝膠成像儀中觀察并拍照,分析各組小鼠肺組織中NLRP3、IL-1β、TGF-β1蛋白的相對表達。

1.9統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0軟件進行方差分析及LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組血氣分析、肺濕/干值比較 與對照組相比,模型組PaO2值顯著降低,PaCO2、肺濕/干值顯著升高(P<0.05);與模型組相比,蘿卜硫素組、抑制劑組、蘿卜硫素+激活劑組PaO2值顯著升高,PaCO2、肺濕/干值顯著降低(P<0.05);與蘿卜硫素組、抑制劑組相比,蘿卜硫素+激活劑組PaO2值顯著降低,PaCO2、肺濕/干值顯著升高(P<0.05)。見表1。

2.2各組血清炎癥因子水平比較 與對照組相比,模型組血清IL-1β、TNF-α、IL-8水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,蘿卜硫素組、抑制劑組、蘿卜硫素+激活劑組血清IL-1β、TNF-α、IL-8水平顯著降低(P<0.05);與蘿卜硫素組、抑制劑組相比,蘿卜硫素+激活劑組血清IL-1β、TNF-α、IL-8水平顯著升高(P<0.05)。見表1。

2.3各組肺組織形態(tài)學變化 對照組肺組織結構正常,無明顯病變;模型組肺組織肺泡結構受損嚴重,可見血管充血、重大、炎性細胞浸潤等現象;與模型組相比,蘿卜硫素組、抑制劑組肺組織結構損壞得到緩解;與蘿卜硫素組相比,蘿卜硫素+激活劑組肺組織損傷加重。見圖1。

表1 各組血清血氣分析值、炎癥因子水平、肺濕/干值比較

2.4各組肺泡灌洗液中炎癥細胞、炎癥因子水平變化 與對照組相比,模型組肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、中性粒細胞、IL-1β、TNF-α、IL-8水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,蘿卜硫素組、抑制劑組、蘿卡硫素+激活劑組肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、中性粒細胞、IL-1β、TNF-α、IL-8水平顯著降低(P<0.05);與蘿卜硫素組、抑制劑組相比,蘿卜硫素+激活劑組肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、中性粒細胞、IL-1β、TNF-α、IL-8水平顯著升高(P<0.05)。見表2。

2.5各組肺組織NLRP3/IL-1β/TGF-β1通路蛋白表達 與對照組相比,模型組肺組織NLRP3、IL-1β、TGF-β1蛋白表達水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,蘿卜硫素組、抑制劑組肺組織NLRP3、IL-1β、TGF-β1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05);與模型組、蘿卜硫素組、抑制劑組相比,蘿卜硫素+激活劑組肺組織NLRP3、IL-1β、TGF-β1蛋白表達水平顯著升高(均P<0.05)。見表3、圖2。

表2 各組肺泡灌洗液中炎癥細胞、炎癥因子水平變化

表3 各組肺組織NLRP3/IL-1β/TGF-β1通路蛋白表達

1～5:對照組、模型組、蘿卜硫素組、抑制劑組、蘿卜硫素+激活劑組圖2 Western印跡檢測各組肺組織NLRP3/IL-1β/TGF-β1通路蛋白

3 討 論

肺炎主要是由細菌、病毒等病原體引起的肺部感染,與內毒素等微生物的炎癥刺激有關,目前臨床用于肺炎治療的藥物常有很大的副作用,尋找毒副作用小的新型天然治療藥物對于提高肺炎治愈率具有積極而重要的意義〔13,14〕。

蘿卜硫素廣泛分布于青花椰菜、胡蘿卜等十字花科蔬菜中,對于阿霉素誘導的巨噬細胞炎癥具有一定的保護作用〔15〕。Zeng等〔16〕研究發(fā)現,蘿卜硫素對于LPS誘導的慢性阻塞性肺疾病的炎癥反應具有一定的抑制作用。宣偉等〔17〕研究發(fā)現,蘿卜硫素可減輕輻射誘導的小鼠炎癥反應,對放射性肺損傷具有一定的防護作用。本研究結果提示,LPS誘導小鼠發(fā)生嚴重炎癥反應,經過蘿卜硫素治療的肺炎小鼠肺組織損傷得到緩解,機體炎癥反應得到抑制,提示蘿卜硫素可抑制由LPS誘導的小鼠機體炎癥反應及肺損傷,對肺炎小鼠有一定的保護作用,但關于其可能機制仍不清晰。

NLRP3主要在巨噬細胞、單核細胞等免疫細胞中,一旦被激活,就會促進IL-1β、TGF-β1等下游細胞因子的成熟和釋放,從而引起機體炎癥反應,進而參與多種炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展〔18,19〕。李小燕等〔20〕研究發(fā)現,納米級炭黑顆粒短期暴露引起的肺炎小鼠肺組織損傷、肺泡灌洗液中IL-1β水平、NLRP3陽性細胞數升高,并認為NLRP3炎癥小體的激活可能參與了小鼠肺炎的發(fā)生發(fā)展過程,陳潔等〔21〕研究發(fā)現,抑制NLRP3/IL-1β通路的活化可顯著減輕LPS誘導的肺泡上皮細胞炎性損傷,降低細胞中IL-1β、TNF-α、IL-8等炎性細胞因子水平。宣偉等〔17〕研究發(fā)現,蘿卜硫素可通過降低小鼠肺組織NLRP3的表達抑制炎癥反應,進而對放射性肺損傷起到保護作用。本研究結果提示,蘿卜硫素對LPS誘導的小鼠肺炎的保護作用可能是通過抑制NLRP3/IL-1β/TGF-β1通路實現的。