李和麗 梁殿迅 王秋宇 姜平 朱軍義 郭哲

(南陽市中心醫(yī)院婦科,河南 南陽 473000)

宮頸癌(CC)發(fā)病率及病死率均高,對女性身心健康構(gòu)成極大威脅〔1〕。目前,學(xué)者認(rèn)為CC發(fā)病與人乳頭瘤病毒(HPV)感染、初產(chǎn)年齡小、多孕多產(chǎn)、免疫功能異常、炎癥反應(yīng)、環(huán)狀RNA(circRNA)異常表達(dá)等有關(guān)〔2〕。既往報道顯示,circRNA與多種腫瘤病理發(fā)展過程有關(guān),可作為診治腫瘤的靶標(biāo)〔3〕。研究發(fā)現(xiàn),circRNA蛋白質(zhì)精氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶(circPRMT)5可增強(qiáng)肝癌細(xì)胞增殖、遷移及糖酵解,其有望成為治療肝細(xì)胞癌的潛在靶點(diǎn)〔4〕。另外,果蠅zeste基因增強(qiáng)子同源物(EZH)2可受miR-214靶向調(diào)控,從而在CC癌細(xì)胞生長中發(fā)揮作用〔5〕;且circPRMT5可通過影響EZH2 mRNA表達(dá)進(jìn)而影響非小細(xì)胞肺癌發(fā)生、發(fā)展〔6〕。推測CC患者circPRMT5表達(dá)水平可能與EZH2 mRNA、CC患者預(yù)后的關(guān)系有關(guān),基于此,本研究通過檢測CC患者癌組織circPRMT5、EZH2 mRNA表達(dá)水平,分析circPRMT5與EZH2 mRNA的相關(guān)性及二者與CC患者預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取南陽市中心醫(yī)院2015年7月至2018年1月行根治性切除術(shù)并確診的CC患者84例,其中年齡34～69歲,平均(51.66±11.38)歲。診斷標(biāo)準(zhǔn):參考《宮頸癌及癌前病變規(guī)范化診療指南》〔7〕相關(guān)CC判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷。納入標(biāo)準(zhǔn):①患者均符合CC有關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn),經(jīng)病理確診為CC;②患者均具備完整病理檢查資料;③患者術(shù)前均未進(jìn)行任何放化療等任何輔助抗腫瘤治療;④患者均知情同意,自愿參與本研究。排除標(biāo)準(zhǔn):①病理診斷不明確者;②合并肝、腎功能不全者;③合并其他婦科疾病、惡性腫瘤者;④失訪者。所有受試者及其家屬簽署知情同意書,且本研究符合《赫爾辛基宣言》,獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)后實(shí)施(批號:No.150012)。

1.2主要試劑與儀器 Trizol試劑(貨號:15596018)購于南京森貝伽生物科技有限公司,First Strand cDNA Synthesis Kit(貨號:羅氏11483188001)購于上海嶸崴達(dá)實(shí)業(yè)有限公司,Perfectstart SYBR Green qPCR master mix(貨號:TQ2300-01)購于上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司。

紫外分光光度計(jì)(型號:DU-730)購于上海普迪生物技術(shù)有限公司,實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)儀(型號:ABI 9700)購于北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司。

1.3樣本收集 收集術(shù)后切除并且經(jīng)病理學(xué)確診為CC患者癌組織和癌旁正常組織樣本(距離癌組織>4 cm),剪取一部分置于液氮,凍存12 h,移入-80 ℃冰箱;另一部分置于甲醛溶液中固定,制備石蠟標(biāo)本切片。

1.4qRT-PCR法檢測組織樣本中circPRMT5、EZH2 mRNA表達(dá)水平 于-80 ℃冰箱中取出組織樣本,剪取適量組織樣本,勻漿,添加適量Trizol試劑,抽提樣本總RNA,按照Trizol試劑盒說明書進(jìn)行操作。利用紫外分光光度計(jì)檢測各樣本于260 nm、280 nm波長處的吸光度(A),選取A260/A280比值為1.8～2.1的RNA樣本進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。參考逆轉(zhuǎn)錄試劑盒First Strand cDNA Synthesis Kit說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。參考Perfectstart SYBR Green qPCR master mix說明書將cDNA擴(kuò)增、檢測。PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù):97 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,62 ℃退火/延伸30 s,45個循環(huán)。每個樣本均設(shè)置3個復(fù)孔,以2-ΔΔCt法計(jì)算circPRMT5、EZH2 mRNA相對表達(dá)量。引物序列:circPRMT5:正向引物5′-CTCATCTTCCGGCTCCTCAA-3′,反向5′-TGAT-TAAGGGGCAGCAGGAA-3′,EZH2:正向引物5′-TCGTGCCCTTGTGTGTGATAGC,反向5′-TCTCGGACAGCCAGGTAGC-3′,GAPDH:正向引物5′-ATCATGTTTGACCTTCAACA,反向5′-CATCTCTTGCTCGA-AGTCCA-3′。

1.5免疫組化法檢測組織標(biāo)本EZH2蛋白表達(dá)水平 取4 μm厚的石蠟標(biāo)本切片,以鏈霉親合素-生物素復(fù)合物(SP)法染色,依照試劑盒說明書進(jìn)行操作,加抗EZH2抗體,二氨基聯(lián)苯胺顯色,復(fù)染,脫水,封片,顯微鏡拍照。依據(jù)陽性細(xì)胞比例(A)與染色程度(B)乘積判定結(jié)果:以(A×B)<3分為陰性,以(A×B)≥3分為陽性,且分別以陽性細(xì)胞百分比<24%、24%～49% 、50%～74% 、>74%分別為 0、1、2、3分,分別以染色程度無色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別為 0、1、2、3分。

1.6隨訪 對84例CC患者進(jìn)行門診/電話隨訪36個月,以CC患者手術(shù)日期為隨訪起點(diǎn),以CC患者死亡或隨訪時間2021年1月為隨訪終點(diǎn)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)分析、COX回歸分析;采用Kaplan-Meier曲線法分析癌組織circPRMT5、EZH2 mRNA表達(dá)水平與CC患者預(yù)后的關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1CC患者癌組織和癌旁正常組織中circPRMT5、EZH2 mRNA表達(dá)水平比較 與癌旁正常組織相比,癌組織circPRMT5、EZH2 mRNA表達(dá)水平均升高(P<0.05),見表1。circPRMT5、EZH2 mRNA的瓊脂糖凝膠電泳見圖1。

2.2CC患者EZH2蛋白表達(dá) 免疫組化顯示,EZH2主要定位于細(xì)胞核,染色呈棕黃色/褐色,見圖2。EZH2在CC癌組織中陽性表達(dá)率〔80.95%(68例)〕顯著高于癌旁正常組織〔11.90%(10例);χ2=80.506,P=0.000〕。

2.3CC患者癌組織circPRMT5、EZH2 mRNA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 以CC患者癌組織circPRMT5相對表達(dá)量平均值1.95為界限,<1.95的CC患者為circPRMT5低表達(dá)組(n=40),≥1.95的CC患者為circPRMT5高表達(dá)組(n=44)。以CC患者癌組織EZH2 mRNA相對表達(dá)量平均值1.87為界限,<1.87的CC患者為EZH2 mRNA低表達(dá)組(n=43),≥1.87的CC患者為EZH2 mRNA高表達(dá)組(n=41)。CC患者癌組織circPRMT5表達(dá)、EZH2 mRNA與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO分期相關(guān)(P<0.05),見表2。

表1 CC患者癌組織和癌旁正常組織中circPRMT5、EZH2 mRNA表達(dá)水平比較

圖2 CC患者癌組織中EZH2蛋白表達(dá)(SP法染色,×400)

表2 CC患者癌組織circPRMT5、EZH2 RNA低表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(n)

2.4CC患者癌組織circPRMT5表達(dá)水平與EZH2 mRNA的相關(guān)性 Pearson法分析顯示,CC患者癌組織circPRMT5表達(dá)水平與EZH2 mRNA呈正相關(guān)(r=0.449,P<0.05)。

2.5癌組織circPRMT5、EZH2 mRNA表達(dá)水平與CC患者預(yù)后的關(guān)系 CC患者死亡36例,總生存率為57.1%(48/84)。CC患者circPRMT5低表達(dá)組術(shù)后36個月生存率〔75.0%(30/40)〕明顯高于circPRMT5高表達(dá)組〔40.9%(18/44);χ2=9.860,P=0.002〕;CC患者EZH2低表達(dá)組術(shù)后36個月生存率〔79.1%(34/43)〕明顯高于EZH2高表達(dá)組〔34.1%(14/41);χ2=17.110,P<0.001〕,見圖3。

圖3 癌組織circPRMT5、EZH2 mRNA表達(dá)水平與CC患者預(yù)后的關(guān)系

2.6COX回歸分析CC患者預(yù)后的影響因素 單因素COX回歸分析顯示,分化程度是CC患者發(fā)生不良預(yù)后的保護(hù)因素(P<0.05),淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、circPRMT5、EZH2、FIGO分期是CC患者發(fā)生不良預(yù)后的危險因素(P<0.05);多因素COX回歸分析結(jié)果顯示,circPRMT5、EZH2、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO分期是影響CC患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險因素(P<0.05),見表3。

表3 影響CC患者預(yù)后的單因素和多因素COX回歸分析

3 討 論

CC早期常無癥狀,發(fā)展可伴有排液、陰道流血等癥狀,其發(fā)病逐漸呈年輕化趨勢,嚴(yán)重影響女性生存狀況〔8〕。

circRNA穩(wěn)定存在于外泌體、血漿、組織中,其可調(diào)控可變剪接、轉(zhuǎn)錄過程,進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá),或可作為miRNA吸附海綿,或調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,從而在多種腫瘤發(fā)展過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用〔9～11〕。研究發(fā)現(xiàn),circPRMT5在胃癌患者癌組織中表達(dá)上調(diào),其高水平與不良預(yù)后有關(guān),其可能通過促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖與侵襲,從而促進(jìn)胃癌發(fā)展,circPRMT5有望成為診治胃癌、評估患者預(yù)后的指標(biāo)〔12〕。本研究結(jié)果與其在胃癌中的表達(dá)趨勢一致〔12〕,提示circPRMT5可能在CC病理進(jìn)展中具有重要作用,推測circPRMT5作為circRNA成員之一,其高表達(dá)可能引起基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控紊亂,異常激活CC相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,促進(jìn)癌細(xì)胞生長,影響腫瘤轉(zhuǎn)移及分化,在CC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮促進(jìn)作用。另外,本研究結(jié)果提示,circPRMT5與CC病情進(jìn)展有關(guān),測定癌組織circPRMT5表達(dá)水平有助于判定CC患者疾病進(jìn)展程度,確定合理治療方案。

EZH2可參與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)形成,調(diào)節(jié)基因表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞增殖,影響腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散及轉(zhuǎn)移,在機(jī)體生長發(fā)育、細(xì)胞記憶、X染色體滅活等生物學(xué)過程中具有重要作用〔13〕。研究發(fā)現(xiàn),miR-137在CC中表達(dá)下調(diào),而EZH2是miR-137的直接下游靶基因,EZH2可能受miR-137靶向調(diào)控,進(jìn)而在CC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔15〕。此外,Azizmohammadi等〔15〕研究發(fā)現(xiàn),EZH2 mRNA在CC患者癌組織中呈高表達(dá),與患者不良預(yù)后密切相關(guān),EZH2 mRNA具有評估CC患者預(yù)后的潛在價值。本研究結(jié)果與Azizmohammadi等〔15〕研究結(jié)果相一致,提示EZH2 mRNA可能參與并影響CC發(fā)生發(fā)展,究其原因,高水平EZH2 mRNA可能促使宮頸上皮細(xì)胞調(diào)控異常,促進(jìn)細(xì)胞惡性增殖、腫瘤細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)移,影響CC發(fā)生與發(fā)展。進(jìn)一步研究結(jié)果提示,EZH2 mRNA可能是診治CC的潛在靶標(biāo)。

此外,Wang等〔6〕研究發(fā)現(xiàn),非小細(xì)胞肺癌癌組織中circPRMT5表達(dá)水平與EZH2 mRNA呈正相關(guān),circPRMT5、EZH2 mRNA協(xié)同影響非小細(xì)胞肺癌病理發(fā)展。本研究結(jié)果提示,circPRMT5可能與EZH2 mRNA共同影響CC發(fā)展進(jìn)程,但具體作用機(jī)制需深入探究。進(jìn)一步研究顯示,CC患者癌組織circPRMT5、EZH2 mRNA表達(dá)水平升高與患者不良預(yù)后有關(guān),兩者有望成為評估CC患者預(yù)后的標(biāo)志物,有助于判定患者預(yù)后情況,推測circPRMT5、EZH2 mRNA可能通過影響腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等過程,進(jìn)而影響CC患者預(yù)后,但其具體機(jī)制仍需結(jié)合基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。此外,本研究結(jié)果提示,測定宮頸組織circPRMT5、EZH2 mRNA水平可能有利于盡早診治CC、評估CC患者預(yù)后。