卜子晨，鄭詩(shī)琪，王 佳，夏永軍，艾連中，王光強(qiáng)

（上海理工大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院 上海食品微生物工程技術(shù)研究中心 上海 200093）

短鏈脂肪酸（SCFA）是腸道微生物的重要代謝產(chǎn)物。它們主要由厭氧微生物的多糖、寡糖、蛋白質(zhì)、多肽和糖蛋白前體形成[1]。短鏈脂肪酸是飽和脂肪酸的一個(gè)子集，含有6 個(gè)或更少的碳分子，包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和己酸[2]。在人體中，乙酸、丙酸和丁酸是腸道發(fā)酵產(chǎn)生的3 種主要短鏈脂肪酸，占腸道短鏈脂肪酸含量的95%，宿主產(chǎn)生短鏈脂肪酸的主要部位是結(jié)腸和盲腸[3]。其中SCFAs 的濃度在近端結(jié)腸較高，在遠(yuǎn)端結(jié)腸較低。SCFAs 參與人體代謝，在肝臟、骨骼肌、脂肪組織和胰島等不同器官中具有重要功能，可以直接影響碳水化合物代謝和脂質(zhì)利用，并通過(guò)副交感神經(jīng)系統(tǒng)間接調(diào)節(jié)能量代謝[4]。SCFAs 被報(bào)道可以緩解肥胖、糖尿病，抑制炎癥和腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[5-7]。近年SCFAs 的測(cè)量已被用于研究許多疾病。糞便標(biāo)本是研究SCFAs 濃度與疾病之間相關(guān)性的最常用標(biāo)本，它能夠反映結(jié)腸中SCFAs 的產(chǎn)生與吸收之間的平衡[8]。為了分析飲食、腸道微生物群和宿主健康之間的關(guān)系，需要可靠、方便、靈敏的方法來(lái)準(zhǔn)確測(cè)定短鏈脂肪酸的含量。

生物樣品中SCFAs 的分析方法多種多樣，其中包括高效液相色譜（HPLC）聯(lián)合紫外檢測(cè)[9]、固相微萃取氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（SPME-GCMS）[10]、核磁共振（NMR）[11]、毛細(xì)管電泳（CE）[12]等。由于SCFAs 具有較強(qiáng)的揮發(fā)性，在所有用于測(cè)定短鏈脂肪酸的設(shè)備中，氣相色譜是最廣泛用于短鏈脂肪酸分析的設(shè)備，并且與質(zhì)譜聯(lián)用具有更好的靈敏度和選擇性[13]。然而，直接進(jìn)樣分析回收率較低，并存在雜質(zhì)污染氣相色譜柱的現(xiàn)象[14]。由于丙酸峰面積比較小，因此直接進(jìn)樣也很難使其明顯出峰。為了提高檢測(cè)靈敏度和對(duì)柱子較少的損害，衍生化方法是更好的選擇。由于揮發(fā)性酸物質(zhì)較難檢測(cè)，且峰很難分離，因此硅烷化方法是氣相色譜分離揮發(fā)性酸的一種常用方法。硅烷化試劑有很多種，其中N，O-雙（三甲基硅基）乙酰胺（BSA）、N，O-雙（三甲基硅基）-三氟乙酰胺（BSTFA）和N-甲基-N-（三甲基硅基）-三氟乙酰胺（MSTFA）是GC/MS 分析中最常用的試劑[15]。這些衍生化劑通過(guò)三甲基硅基取代酸、醇、硫醇、胺、酰胺、酮和醛中的活性氫，與生物有機(jī)分子具有良好而廣泛的反應(yīng)活性[16]。相比較而言，很少用BSA 來(lái)檢測(cè)揮發(fā)性較強(qiáng)或分子質(zhì)量很低的化合物，而B(niǎo)STFA 雖與BSA 相似，但由它生成的副產(chǎn)物揮發(fā)性?xún)?yōu)于BSA，且更容易與衍生物分離，從而達(dá)到更好的出峰效果。常規(guī)的硅烷化試劑在檢測(cè)器中能形成SiO2，污染指數(shù)高并且會(huì)增加基線的噪音，BSTFA 分子中含有3 個(gè)氟原子，在檢測(cè)過(guò)程中可使SiO2進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為SiF4，從而有效降低污染情況[17]。與MSTFA 相比，BSTFA 氯甲酸鹽運(yùn)行時(shí)間更短，受空間位阻的影響更小，丁酸的分離效果更好，且操作時(shí)間較短，具有更好的衍生化效率和靈敏度[18]。最終選用GC-MS 聯(lián)合BSTFA 衍生化試劑，旨在建立一種可以高效定量分析短鏈脂肪酸的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)環(huán)境

SPF 級(jí)雌性C57BL/6 小鼠，購(gòu)于南京模式動(dòng)物有限公司。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境條件為溫度（23±2）℃、相對(duì)濕度控制在（50±5）%、12 h 光照和12 h 黑夜的環(huán)境中，自由取食、進(jìn)水，適應(yīng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 材料與試劑

乙酸、丙酸、丁酸（純度≥99%）購(gòu)自源葉生物；無(wú)水乙醚，鹽酸，均為分析級(jí)，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；N，O-三甲硅烷基三氟乙酰胺（BSTFA），無(wú)水Na2SO4，購(gòu)自Sigma 公司。

1.3 主要儀器設(shè)備

Thermo 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；漩渦振蕩儀；3-18K 型離心機(jī)，德國(guó)Sigma 公司；PL2002 型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；GT200 研磨儀，北京格瑞德曼儀器設(shè)備有限公司。

1.4 氣相色譜條件

色譜柱：TG-5MS 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。初始溫度40 ℃，保持2 min，以15 ℃/min 升至150 ℃，保持1 min，再以30 ℃/min 升至300 ℃，保持5 min。進(jìn)樣口溫度：260 ℃；載氣：氮?dú)猓兌取?9.999%）；分流比：10∶1；柱流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；溶劑延遲時(shí)間：3 min。

1.5 質(zhì)譜條件

離子源：EI 源（70 eV）；離子源溫度：230 ℃。定性時(shí)掃描方式為全掃描（m/z 40～400），采集頻率為每秒12.8 次，定量時(shí)掃描方式為選擇性離子掃描，乙酸、丙酸、丁酸掃描離子為（m/z）：117，131，145。采用外標(biāo)法計(jì)算短鏈脂肪酸的含量。

1.6 試驗(yàn)方法

1.6.1 樣品前處理 小鼠排便后立即用鑷子收集糞便樣本0.05 g 左右并與500 μL 純水混合，用研磨儀快速研磨至形成勻漿狀態(tài)，然后低速振蕩30 min。隨后放入冷凍離心機(jī)13 000 r/min 的條件下離心30 min。將100 μL 的上清液轉(zhuǎn)移到離心管中，并加入10 μL 5 mol/L HCl 使糞便溶液pH 值在2 左右。酸化后的糞便勻漿加入100 μL 無(wú)水乙醚，漩渦振蕩混勻，10 000 r/min 的條件下離心5 min。取上清轉(zhuǎn)移至含無(wú)水Na2SO4的離心管中，從而去除多余水分。重復(fù)萃取2 次。

衍生化過(guò)程：將100 μL 無(wú)水乙醚層轉(zhuǎn)移至內(nèi)插管中，加入5 μL 的BSTFA，漩渦振蕩后保存在氣相小瓶中。70 ℃孵育20 min，37 ℃孵育2 h。最后將樣品上機(jī)處理。

1.6.2 回收率和精密度 將小鼠糞便樣品加入3種不同水平（10，50 和250 μmol/L）的混合SCFAs標(biāo)準(zhǔn)品，按上述方法衍生化并進(jìn)行GC-MS 分析，計(jì)數(shù)出回收率。并采用相同濃度的糞便SCFAs 提取物測(cè)定精密度。

1.6.3 小鼠糞便、盲腸、結(jié)腸中SCFAs 的含量比較 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，收取0.05 g 左右糞便。脫頸椎處死后，分別取0.05 g 左右盲腸和結(jié)腸內(nèi)容物。并為加入無(wú)菌水按上述衍生化方法處理。隨后對(duì)3 種SCFAs 進(jìn)行含量測(cè)定和比例分布統(tǒng)計(jì)。

1.6.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 本試驗(yàn)中得到的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用Origin 9.0 軟件處理數(shù)據(jù)并作圖，采用SPSS 22.0 數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行顯著性差異分析。所有數(shù)據(jù)均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（mean±SD）表示。P>0.05 無(wú)顯著性差異，P<0.05 有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系

將3 種短鏈脂肪酸進(jìn)樣后獲得各自的出峰時(shí)間，它們的出峰順序?yàn)橐宜?、丙酸和丁酸。色譜圖見(jiàn)圖1，3 種SCFAs 的色譜峰得到很好的分離。根據(jù)峰面積，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并以峰面積對(duì)不同濃度進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表1。根據(jù)線性回歸方程和R2可知乙酸、丙酸、丁酸在25～400 μmol/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 不同SCFAs 線性關(guān)系考察Table 1 The linear relationship of different SCFAs

圖1 混合SCFAs 的GC-MS 色譜圖Fig.1 The chromatogram of mixed SCFAs

2.2 精密度

糞便樣品中SCFAs 分析方法精密度分析結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)同一糞便樣品進(jìn)行5 次平行進(jìn)樣測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果顯示，峰面積和保留時(shí)間的RSD 均小于4%，表明儀器的精密度良好。

表2 精密度測(cè)定結(jié)果Table 2 The precision of the method for the determination of mixed SCFAs

2.3 回收率

糞便樣品 GC-MS 回收率分析結(jié)果見(jiàn)表3。對(duì)糞便樣品進(jìn)行回收率試驗(yàn)，按照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果顯示，加樣回收率達(dá)到了86%～96%之間，各組分加樣回收率的RSD 均小于4%，說(shuō)明本試驗(yàn)的分析條件下測(cè)定短鏈脂肪酸的方法可靠。

表3 添加不同含量SCFAs 的糞便樣本回收率測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of fecal sample recovery with different SCFAs content

2.4 小鼠糞便、盲腸、結(jié)腸中SCFAs 的含量

體內(nèi)的腸道菌群通過(guò)發(fā)酵難以消化的碳水化合物來(lái)產(chǎn)生SCFAs，它們會(huì)顯著參與多種代謝功能，并且對(duì)機(jī)體系統(tǒng)產(chǎn)生有益的影響。SCFAs 不但可以調(diào)節(jié)肝臟中的脂肪生成和膽固醇生物合成等機(jī)制，并通過(guò)刺激腸道內(nèi)分泌細(xì)胞調(diào)節(jié)能量穩(wěn)態(tài)[19]。因此本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)小鼠糞便的衍生化處理，來(lái)確定小鼠中SCFAs 的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)該GC-MS 方法均能檢測(cè)到乙酸、丙酸和丁酸的含量。由圖2a 的比例分布圖所示糞便中含量最多的就是乙酸，高達(dá)73.9%，其次是丙酸（17.6%）和丁酸（8.5%）。這樣的含量分布順序與之前報(bào)道的文獻(xiàn)基本吻合[20-21]。由圖2b 可知，SCFAs 在糞便、盲腸和結(jié)腸中均有分布。其中盲腸中SCFAs 最高，糞便次之，結(jié)腸中最少。且盲腸中的乙酸、丙酸、丁酸含量均與結(jié)腸有顯著性差異（P<0.05）。

圖2 SCFAs 占比和不同部位SCFAs 的含量Fig.2 Proportion of SCFAs and content of SCFAs in different parts

3 結(jié)論

本試驗(yàn)中采用BSTFA 作為硅烷化試劑，可以有效解決SCFAs 分離效果差，揮發(fā)性太高從而不出峰等問(wèn)題。利用無(wú)水乙醚作為廣泛提取SCFAs的常用試劑，結(jié)合無(wú)水硫酸鈉的使用可以更有效的把多余的水分去除，使得結(jié)果更準(zhǔn)確，而且對(duì)機(jī)器的損傷也降到最低。從而建立了一種線性關(guān)系良好，回收率高，精密度達(dá)標(biāo)的檢測(cè)SCFAs 的方法。并且該方法可以準(zhǔn)確的測(cè)出糞便中乙酸、丙酸和丁酸這3 種最常見(jiàn)的SCFAs，沒(méi)有明顯的雜峰和干擾峰。并通過(guò)試驗(yàn)檢測(cè)出小鼠腸道內(nèi)盲腸中SCFAs 含量最多，并且乙酸、丙酸和丁酸的分布情況是：乙酸＞丙酸＞丁酸。