陳茂飛，焦 富，袁 進(jìn)，李巧玉，2，聶 葉，李代鑫*

（1.貴州茅臺(tái)酒股份有限公司，貴州仁懷 564500；2.貴州省釀酒工程技術(shù)研究中心，貴州仁懷 564500）

乳酸為揮發(fā)性較弱的有機(jī)酸，在白酒有機(jī)酸中占據(jù)著很大的比例，是醬香型白酒釀造過程中必不可少的有機(jī)酸[1]。適量的乳酸在白酒發(fā)酵過程中起到抑制雜菌生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)酸度的作用，但乳酸含量偏高容易造成淀粉的糖化率降低，從而降低出酒率[2]。因此監(jiān)測(cè)白酒發(fā)酵過程中乳酸含量至關(guān)重要。

目前，常用高效液相色譜儀對(duì)酒醅中乳酸含量進(jìn)行檢測(cè)[4-6]，平均檢測(cè)一個(gè)樣耗時(shí)25 min，該檢測(cè)方法前處理繁瑣，分析時(shí)間長(zhǎng)，檢測(cè)效率低，不能滿足生產(chǎn)過程質(zhì)量監(jiān)控覆蓋率要求[7]。

近紅外技術(shù)是20 世紀(jì)60 年代出現(xiàn)，80 年代后期迅速發(fā)展起來的一種快速、簡(jiǎn)便、綠色的成分檢測(cè)技術(shù)[8-12]。因其無需樣品前處理，僅通過一次近紅外光譜的采集測(cè)量，不消耗其他材料或破壞樣品，在幾十秒鐘或幾分鐘內(nèi)完成多項(xiàng)指標(biāo)的集成檢出，具有分析重現(xiàn)性好、無污染、方便快捷等特點(diǎn)[13-14]，廣泛應(yīng)用于食品、藥品、飼料等領(lǐng)域的檢測(cè)[15-18]。

現(xiàn)有技術(shù)中沒有近紅外快速檢測(cè)酒醅中乳酸指標(biāo)的具體檢測(cè)方法及近紅外分析模型[19-20]。針對(duì)上述問題，本研究通過收集醬香型白酒酒醅中不同乳酸含量的近紅外光譜信息，構(gòu)建醬香型白酒酒醅中乳酸近紅外快速檢測(cè)模型（模型構(gòu)建流程如圖1所示），模型具有準(zhǔn)確可靠，精密度良好的特點(diǎn)，為醬香型白酒酒醅中乳酸含量的快速檢測(cè)提供了一種方法[21-23]。此法能滿足生產(chǎn)對(duì)醬香型白酒酒醅樣品大批量、快速檢測(cè)的需求，同時(shí)還能減少因采用常規(guī)檢測(cè)方法對(duì)環(huán)境造成的污染，是一種理想的檢測(cè)方法[24]。

圖1 近紅外檢測(cè)模型構(gòu)建流程圖

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

試驗(yàn)樣品：樣品收集醬香型白酒生產(chǎn)車間各輪次的堆心、入窖、窖內(nèi)及出窖酒醅。

試劑：L-乳酸（色譜純，98 %），Sigma-Aldrich公司；甲醇（色譜純），美國(guó)天地公司；磷酸（色譜純），阿拉??；實(shí)驗(yàn)室用水均為超純水（電阻率18.2 MΩ·cm）。

儀器設(shè)備：DS2500F 型近紅外光譜儀，丹麥Foss 公司；安捷倫HPLC 1260Ⅱ-VWD 高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技有限公司；VELOCITY18R Pro 高速冷凍離心機(jī)，澳大利亞Dynamica 公司；超純水儀，上海HHitech；漩渦混合器（Vortex-Genie2T），美國(guó)；電子天平（0.01 g），梅特勒-托利多；0.45 μm 濾頭（親水性PTFE 針式濾器），安譜；WINISI 計(jì)量軟件，丹麥Foss 公司。運(yùn)用WINISI 軟件對(duì)采集到的光譜信息分別采用不同建模波段、化學(xué)計(jì)量學(xué)方法、光程類型、數(shù)據(jù)格式、平滑類型等進(jìn)行處理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 醬香型白酒酒醅中乳酸的色譜檢測(cè)

高效液相色譜條件：選取Venusil ASB C18 型色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫設(shè)定為30 ℃；流動(dòng)相：A：磷酸水甲醇溶液（0.12%（V/V）磷酸水溶液980 mL 加入20 mL 甲醇），B：甲醇；流速：0.8 mL/min，VWD 檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)：214 nm，運(yùn)行14 min，進(jìn)樣量10 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 線性洗脫程序

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取一定量的L-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水溶解并定容于100 mL 容量瓶中，得到2000 mg/L 的乳酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于4 ℃冰箱保存。取一定量的乳酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)行稀釋，分別配成20 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L、600 mg/L、800 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，漩渦混勻。

樣品前處理：準(zhǔn)確稱取5.00 g酒醅樣品于50 mL離心管中，加入10 mL 超純水，渦旋振蕩10 min，4000 r/min 離心5 min，取1 mL 上清液于2 mL 離心管，12000 r/min 離心10 min，取一定量的上清液，用超純水稀釋一定倍數(shù)，過0.45 μm 濾膜，濾液進(jìn)樣液相色譜分析。

1.2.2 醬香型白酒酒醅中乳酸近紅外光譜的采集

近紅外光譜儀要求供電電源：AC220 V±10%；50 Hz±1 Hz 單相交流電。工作環(huán)境溫度：15～35 ℃；空氣相對(duì)濕度：45 %～80 % RH。室內(nèi)無電磁干擾及有害有毒氣體。

儀器預(yù)熱30 min 以上，打開軟件待儀器自檢通過后，將杯架和監(jiān)控樣品(Check Sample)依次放在掃描臺(tái)上，轉(zhuǎn)動(dòng)杯架和監(jiān)控樣，確保放置穩(wěn)妥，蓋上儀器蓋子進(jìn)行監(jiān)控樣掃描，以此判斷儀器的工作狀態(tài)。用樣品勺充分混勻待采集樣品，均勻填裝入樣品杯中1/2～2/3 處，適當(dāng)按壓樣品，確保樣品杯底部均勻無空隙。將填裝好的樣品杯放在掃描臺(tái)上即可開始掃描。將各類醬香型白酒酒醅樣品的光譜信息采集后，提取出特征信息，從而提高近紅外光譜與酒醅中乳酸化學(xué)成分的相關(guān)性。

1.2.3 模型的建立與驗(yàn)證

借助WINISI 計(jì)量軟件將光譜信息和色譜數(shù)據(jù)匹配，建立得分文件和定標(biāo)方程文件。采用不同波長(zhǎng)（2 nm和6 nm）、不同求導(dǎo)（1階、2階）和標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換（SNV）、去趨勢(shì)化、一次平滑處理幾種處理方式進(jìn)行處理以提高模型的預(yù)測(cè)性能。由于近紅外光譜自身的缺點(diǎn)，如譜帶較寬、重疊嚴(yán)重、樣品中不同成分的影響，會(huì)干擾定量分析過程，故需要借助合適的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法降低干擾，以提升模型的精度和穩(wěn)定性[24]。本法建立的乳酸快速檢測(cè)模型采用偏最小二乘法（PLS）定標(biāo)方法。

為進(jìn)一步驗(yàn)證所建立模型的預(yù)測(cè)效果，在模型建立完成后，抽取547 個(gè)后期近紅外檢測(cè)樣品作為盲樣，將液相法測(cè)得的乳酸結(jié)果與近紅外模型預(yù)測(cè)的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，對(duì)模型進(jìn)行外部驗(yàn)證，評(píng)判模型的預(yù)測(cè)性能。另取未參與建模的酒醅樣品10 個(gè)，每個(gè)樣品通過近紅外光譜儀測(cè)量10 次光譜圖，通過所建分析模型得到10 次預(yù)測(cè)值檢驗(yàn)?zāi)Ｐ途芏取?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸色譜檢測(cè)

以乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2），結(jié)果表明，在濃度范圍20～800 mg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.9997，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.4997x+0.9436。

圖2 乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 醬香型白酒酒醅中乳酸近紅外光譜信息分析

采用近紅外光譜儀對(duì)1655 份樣品進(jìn)行掃描，得到近紅外光譜如圖3 所示，在近紅外區(qū)域850～2500 nm 出現(xiàn)明顯的吸收峰，不同乳酸含量的吸收峰明顯不同，為乳酸含量的近紅外建模提供了依據(jù)。由于各種因素的干擾，樣品之間的差異在光譜圖上看來并不顯著，需要試驗(yàn)不同的預(yù)處理方法得到最佳建模條件。

圖3 醬香型白酒酒醅樣品原始光譜圖

2.3 乳酸近紅外光譜信息處理

1 階、2 階求導(dǎo)處理得到的光譜圖顯示樣品間的差異性更加顯著（圖4），對(duì)比不同求導(dǎo)方式的內(nèi)部交叉驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)差（SECV），1 階導(dǎo)SECV 為0.0632（6 nm）和0.0641（2 nm），2 階導(dǎo)SECV 為0.0684（6 nm）和0.0701（2 nm）。

圖4 不同求導(dǎo)方式光譜圖

光譜處理結(jié)果見表2，分析以上處理方式，在同樣用1 階導(dǎo)處理?xiàng)l件下，分辨率6 nm 處理方式的SECV 為0.0632，2 nm 處理方式的SECV 為0.0641，定標(biāo)模型預(yù)測(cè)的相關(guān)系數(shù)（RSQ）為0.9757 和0.9749。

表2 光譜不同處理方式對(duì)比

2.4 模型準(zhǔn)確性分析

2.4.1 模型的準(zhǔn)確度

表3 結(jié)果顯示，測(cè)定樣品的平均偏差僅為-0.002，說明近紅外預(yù)測(cè)模型與高效液相色譜法測(cè)得的值相近，模型有很好的預(yù)測(cè)效果。由圖5 可以看出，模型驗(yàn)證預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)差（SEP）為0.054，線性回歸斜率為0.986，相關(guān)系數(shù)（RSQ）為0.977。按照AACC(美國(guó)谷物協(xié)會(huì))關(guān)于近紅外模型穩(wěn)健性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)SEP/SEC＜1.2 時(shí)視為模型穩(wěn)健。從表2、圖4 得出，采用一階導(dǎo)數(shù)，6 nm 波長(zhǎng)處理方式下的SEP/SEC 為0.92，說明該預(yù)測(cè)模型穩(wěn)定，準(zhǔn)確性可以得到保證。

圖5 盲樣驗(yàn)證相關(guān)圖

2.4.2 模型的精密度

對(duì)10 份不同乳酸含量的醬香型白酒酒醅樣品進(jìn)行近紅外檢測(cè)，每個(gè)樣品10 次平行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如表4所示。預(yù)測(cè)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)范圍在0.82 %～2.89 %，說明模型預(yù)測(cè)的重復(fù)性較好，穩(wěn)定性好。

表4 模型的精密度驗(yàn)證

3 結(jié)論

本方法采用近紅外光譜技術(shù)建立了醬香型白酒酒醅中乳酸含量的快速檢測(cè)模型，通過對(duì)模型優(yōu)化得到最優(yōu)的建模條件，并對(duì)所建模型的預(yù)測(cè)能力和精密度、準(zhǔn)確性進(jìn)行檢驗(yàn)。結(jié)果表明，采用一階導(dǎo)數(shù)，6 nm 波長(zhǎng)，采用標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換（SNV）、去趨勢(shì)化結(jié)合一次平滑的處理方法建立的模型效果最好，模型穩(wěn)定可靠。經(jīng)過驗(yàn)證，所建模型的預(yù)測(cè)值和液相色譜檢測(cè)值無顯著性差異，模型的精密度和準(zhǔn)確性良好。

本方法以近紅外光譜分析技術(shù)建立分析模型，克服了傳統(tǒng)乳酸檢測(cè)方法的局限性。在實(shí)際應(yīng)用中可實(shí)現(xiàn)2 min 內(nèi)檢出乳酸含量，檢測(cè)效率可提高11.5 倍，可及時(shí)為白酒釀造過程中乳酸的監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支撐，同時(shí)產(chǎn)生的環(huán)保效益巨大。今后可將近紅外分析技術(shù)推廣到更多指標(biāo)的快速檢測(cè)中，達(dá)到對(duì)白酒釀造的全過程、全時(shí)段監(jiān)測(cè)的目的，更好的推動(dòng)白酒釀造行業(yè)的發(fā)展[25]。