李印， 劉勁松， 王禹， 祁婷婷， 孟樂園， 張晶， 呂冬梅， 焦虎平

芘二聚體發(fā)夾探針用于細(xì)胞DNA單鏈斷裂修復(fù)能力的評(píng)估

李印， 劉勁松， 王禹， 祁婷婷， 孟樂園， 張晶， 呂冬梅， 焦虎平

（吉林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院, 長(zhǎng)春 130062）

基于芘分子二聚體的熒光特性設(shè)計(jì)了一種新型的發(fā)夾探針, 用于評(píng)估不同細(xì)胞的單鏈斷裂修復(fù)(SSBR)能力. 首先利用芘熒光分子設(shè)計(jì)一個(gè)莖上有缺口的DNA發(fā)夾探針, 該探針在Bst DNA聚合酶作用下可以水解, 使熒光信號(hào)“關(guān)閉”. 如果探針莖上的缺口被DNA修復(fù)酶修復(fù), 可以阻止Bst DNA聚合酶對(duì)探針的消化作用, 從而阻止熒光信號(hào)的“關(guān)閉”. 該設(shè)計(jì)可以用于評(píng)估細(xì)胞的SSBR能力, 并通過(guò)提取細(xì)胞的核蛋白考察了不同細(xì)胞的SSBR能力. 研究結(jié)果表明, 腫瘤細(xì)胞及細(xì)胞系不具有原代細(xì)胞的SSBR能力. 利用SSBR的關(guān)鍵酶進(jìn)一步探索了腫瘤細(xì)胞SSBR能力缺失的原因, 證明是由于腫瘤細(xì)胞中含有可以抑制SSBR過(guò)程的活性物質(zhì). 此外, 該方法能夠同時(shí)進(jìn)行500個(gè)細(xì)胞的SSBR能力檢測(cè), 并用于抗衰老藥物篩選.

單鏈斷裂修復(fù)； 芘二聚體； 發(fā)夾探針； 原代細(xì)胞； 腫瘤細(xì)胞

單鏈斷裂（SSBs）可以由直接氧化攻擊產(chǎn)生或者作為DNA代謝過(guò)程的中間產(chǎn)物產(chǎn)生［1］. SSBs是各種DNA損傷類型中最常見的， 據(jù)估計(jì)每個(gè)細(xì)胞每天發(fā)生SSBs的頻率達(dá)數(shù)萬(wàn)次［2～4］. 哺乳動(dòng)物細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)化出單鏈斷裂修復(fù)（SSBR）途徑， 以維持基因組完整性并防止SSBs引起的有害突變［5～7］. 然而， 在某些極端情況或病理?xiàng)l件下， SSBR能力必然會(huì)受到影響. 最近有研究表明， SSBR能力下降直接導(dǎo)致上皮細(xì)胞的衰老和腫瘤逃逸， 意味著衰老相關(guān)的上皮細(xì)胞源性腫瘤是SSBR缺陷的結(jié)果［8］， 并且SSBR在心臟壓力超負(fù)荷誘發(fā)心力衰竭的發(fā)病機(jī)制中也起著關(guān)鍵作用［9］. 增殖細(xì)胞中未修復(fù)的SSBs極有可能使DNA復(fù)制叉崩潰， 誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂， 導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定和大量遺傳信息丟失， 進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙或細(xì)胞死亡［10～13］. 鑒于SSBR的重要性及其在基因組穩(wěn)定性中的作用， 需要可行的方法來(lái)評(píng)估SSBR的能力.

檢測(cè)SSBR的傳統(tǒng)方法是彗星電泳實(shí)驗(yàn)， 根據(jù)斷裂DNA在蔗糖梯度［14］或瓊脂糖［15～17］中遷移速率的差異來(lái)判斷SSBR能力； 近年來(lái)， 下一代測(cè)序技術(shù)也被應(yīng)用于SSBR能力評(píng)估［18］. 但上述方法耗時(shí)長(zhǎng)， 需要專門的技術(shù)技能， 且成本高昂. 直接評(píng)估細(xì)胞SSBR能力的策略是基于一個(gè)帶缺口的寡核苷酸雙鏈， 在短的寡核苷酸5'端用放射性同位素32P標(biāo)記， 與核蛋白復(fù)合物孵育； 經(jīng)過(guò)核蛋白中的DNA修復(fù)酶作用， 修復(fù)后的寡核苷酸條帶由磷屏成像儀顯示［19］. 事實(shí)上， 復(fù)雜的過(guò)程和潛在的放射性污染問(wèn)題極大地限制了該方法的應(yīng)用. 因此， 迫切需要準(zhǔn)確、 操作簡(jiǎn)單、 改進(jìn)的直接評(píng)價(jià)細(xì)胞SSBR能力的方法.

熒光法以其操作簡(jiǎn)便、 結(jié)果可視化、 設(shè)計(jì)靈活等優(yōu)點(diǎn)， 成為許多酶活性檢測(cè)的常規(guī)策略［20～24］. 然而， 與放射性標(biāo)記相比， 靈敏度限制了其應(yīng)用. 因此， 很難用熒光團(tuán)標(biāo)記寡核苷酸以直接檢測(cè)細(xì)胞的SSBR能力. 增加核蛋白的量是對(duì)熒光靈敏度的補(bǔ)償， 但核蛋白復(fù)合物中的外切酶會(huì)降解整個(gè)雙鏈， 從而掩蓋SSBR的能力. 為了解決這一矛盾， 降低核蛋白的外切酶活性是必不可少的； 同時(shí)， 熒光的靈敏度也需要提高.

為了滿足上述需求， 本文提出了一種新的熒光傳感系統(tǒng)， 可以直接評(píng)估不同細(xì)胞的SSBR能力. 首先， 合成3′端芘修飾的寡核苷酸A（Oligo A）和5′端芘修飾的寡核苷酸B（Oligo B）， 兩條序列在一端互補(bǔ)； 退火后， Oligo A和Oligo B會(huì)形成一個(gè)帶有缺口的莖環(huán)結(jié)構(gòu)， 兩個(gè)芘單體距離靠近， 形成一個(gè)芘分子二聚體發(fā)夾探針（Oligo mix）， 缺口的修復(fù)與否決定了芘分子的熒光強(qiáng)度. 因此， SSBR可以直觀地轉(zhuǎn)化為芘分子二聚體和單體之間的熒光變化（Scheme 1）. 通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察到原代細(xì)胞的修復(fù)系統(tǒng)具有明顯的二聚體熒光值； 而癌細(xì)胞和細(xì)胞系的修復(fù)系統(tǒng)中則幾乎沒有熒光信號(hào). 該方法能夠直接評(píng)估SSBR能力， 而不需要昂貴的設(shè)備和復(fù)雜的步驟. 此外， 該熒光報(bào)告系統(tǒng)對(duì)抗衰老藥物的篩選也具有一定的應(yīng)用價(jià)值.

Scheme 1Schematic illustration of direct assessment of SSBR capacity based on pyrene excimer probe

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1　試劑與儀器

T4 DNA連接酶、 Bst DNA聚合酶（全長(zhǎng)）、 T4多聚核苷酸激酶（T4 PNK）、 dNTP混合物和T4 DNA連接酶緩沖液（10×）， 美國(guó)New England Biolabs公司； 三羥甲基氨基甲烷（Tris）、 乙二胺四乙酸二鈉（EDTA二鈉）、 甘氨酸和蛋白上樣緩沖液（5×）， 北京索萊寶科技有限公司； 硼酸， 上海麥克林生化科技有限公司； 十二烷基磺酸鈉（SDS）、 丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺（質(zhì)量比29∶1， 40% Acr-bis）、 Tris鹽酸鹽緩沖液（Tris-HCl）和過(guò)硫酸銨， 生工生物工程（上海）股份有限公司； 四甲基乙二胺（TEMED）、 細(xì)胞培養(yǎng)基Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）、 胰蛋白酶- EDTA（0.25%）、 胎牛血清、 GlutaMAX?添加劑（100×）、 MEM非必需氨基酸（100×）、 Orange DNA上樣染料（6×）和SYBR? Gold核酸凝膠染料， 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司； 青霉素/鏈霉素， 大連美倫生物科技有限公司； 磷酸緩沖鹽溶液（PBS）， 武漢博士德生物工程有限公司； 樣本釋放劑， 潤(rùn)方（長(zhǎng)春）生物技術(shù)有限公司；-環(huán)糊精（-CD）、 煙酰胺單核苷酸（NMN）和亞精胺， Sigma-Aldrich公司； 維生素C， 長(zhǎng)沙鼎國(guó)生物科技有限公司； CCK-8（Cell Counting Kit-8?）， 上海碧云天生物科技有限公司； 1×T4 DNA連接酶緩沖液［含50 mmol/L Tris-HCl（pH=7.5）、 10 mmol/L MgCl2、 10 mmol/L DTT和1 mmol/L ATP］用于Oligo退火和后續(xù)反應(yīng)緩沖液.

DNA序列由Takara生物科技（大連）有限公司合成， 堿基序列為Oligo A： GCGCTCCATGTCCAG-3' Pyrene； Oligo B： 5' Pyrene-CTGGACATGGAGCGCCCTCTCAGTGACAAGAACAATGTCACTGAGAGG； Oligo full-length： CTGGACATGGAGCGCCCTCTCAGTGACAAGAACAATGTCACTGAGAGGGCGCTCCATGTCCAG.

F-4500型熒光分光光度計(jì)， 日本Hitachi公司； 1300型生物安全柜、 Sorvall Legend Micro 17R型和Sorvall ST8R型離心機(jī)、 iBright CL750型凝膠成像系統(tǒng)， 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司； ThermoCell型恒溫金屬浴， 杭州博日科技股份有限公司； ELx800型全自動(dòng)酶標(biāo)儀， 美國(guó)BioTek公司.

1.2　實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.1熒光檢測(cè)在室溫（25 ℃）下， 通過(guò)F-4500型熒光分光光度計(jì)進(jìn)行穩(wěn)定狀態(tài)的熒光檢測(cè). 在含有8 mmol/L-CD的100 μL 1×T4 DNA連接酶緩沖液中， 將樣品孵育10 min， 將激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)為344 nm， 在450 ～ 600 nm范圍內(nèi)記錄樣品的熒光發(fā)射光譜， 激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度分別設(shè)為5 nm和10 nm， 掃描速度為240 nm/min， 光電倍增管電壓設(shè)置為950 V.

1.2.2熒光報(bào)告系統(tǒng)的構(gòu)建Oligo A和Oligo B用1×T4 DNA連接酶緩沖液稀釋至50 μmol/L. 將兩種存儲(chǔ)液以等體積混合， 在95 ℃水中變性5 min， 隨后在400 mL水中冷卻至室溫淬火. 經(jīng)過(guò)淬火后， Oligo A和Oligo B將形成一個(gè)帶有缺口的莖環(huán)結(jié)構(gòu)， 并且兩個(gè)芘分子相互靠近， 形成一個(gè)芘分子二聚體發(fā)夾探針（Oligo mix， 25 μmol/L）. 在修復(fù)體系中， 將1.2 μL Oligo mix， 5 U T4 PNK和40 U T4 DNA連接酶加入到1×T4 DNA連接酶緩沖液中， 使最終體積為25 μL， 于37 ℃孵育90 min， 隨后于65 ℃孵育 30 min， 使T4 PNK和T4 DNA連接酶失活； 再加入1 μL Bst DNA聚合酶（200 U/mL）和0.5 μL dNTP mix（200 μmol/L）， 在65 ℃下反應(yīng)30 min， 最后記錄熒光光譜. 與修復(fù)系統(tǒng)相比， 未修復(fù)系統(tǒng)中未添加T4 PNK和T4 DNA連接酶.

1.2.3非變性DNA-聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）按照DNA-PAGE配方制備厚度為1 mm的15%凝膠. 從反應(yīng)體系中取出5 μL反應(yīng)物與1 μL Orange DNA上樣染料（6×） Loading Dye混合， 加入到凝膠孔中， 在1×Tris-硼酸-EDTA緩沖溶液（89 mmol/L Tris-硼酸， 2 mmol/L EDTA）中， 于40 V電壓下電泳5 h； 電泳結(jié)束后， 用SYBR gold染料染色30 min； 最后， 用iBright CL750型凝膠成像系統(tǒng)拍攝凝膠圖片.

1.2.4細(xì)胞培養(yǎng)和核蛋白獲取所有細(xì)胞在37 ℃及5%（體積分?jǐn)?shù)）CO2的濕潤(rùn)氣體環(huán)境中培養(yǎng). 培養(yǎng)基為添加10%胎牛血清（FBS）、 1%青霉素/鏈霉素、 1% MEM非必需氨基酸溶液和1% GlutaMAX?的DMEM（完全培養(yǎng)基）. 根據(jù)生產(chǎn)商的使用說(shuō)明， 用樣本釋放劑裂解細(xì)胞， 分離核蛋白， 收集細(xì)胞沉淀， 在細(xì)胞中加入20 μL樣本釋放劑， 室溫孵育15 min， 在16000下離心10 min后將上清轉(zhuǎn)移到干凈的預(yù)冷離心管中， 于?80 ℃保存待用.

1.2.5SDS聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）根據(jù)SDS-PAGE配方表， 加入40% Acr-bis、 Tris-HCl、 10%過(guò)硫酸銨和TEMED， 依次制備10%下層分離膠和4%上層濃縮膠. 將5 μg蛋白與2.5 μL 5×蛋白上樣 緩沖液混合， 補(bǔ)加去離子水至12.5 μL， 將樣品加入到凝膠孔中， 在1×電泳緩沖液［25 mmol/L Tris， 192 mmol/L甘氨酸， 0.1%（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)）SDS］中， 于100 V電壓下進(jìn)行電泳； 最后， 使用iBright CL750型凝膠成像系統(tǒng)拍攝凝膠圖片.

1.2.6不同細(xì)胞SSBR能力評(píng)估和系統(tǒng)靈敏度檢測(cè)對(duì)不同數(shù)量的細(xì)胞用樣本釋放劑裂解獲得核蛋白， 將1.2 μL Oligo mix和0.5 μL核蛋白復(fù)合物加入到1×T4 DNA連接酶緩沖液中， 使最終體積為 25 μL， 于37 ℃孵育90 min， 隨后65 ℃孵育30 min， 使T4 PNK和T4 DNA連接酶失活， 終止反應(yīng). 隨后的步驟與熒光報(bào)告系統(tǒng)的構(gòu)建相同.

1.2.7細(xì)胞毒性檢測(cè)在完全培養(yǎng)基中加入終濃度為20 μmol/L的亞精胺、 100 μmol/L的NMN和 100 μmol/L的維生素C， 用0.22 μm濾器過(guò)濾備用. 將1×104個(gè)小鼠胎兒成纖維細(xì)胞加入到96孔板中， 每孔加入100 μL上述不同的培養(yǎng)基（實(shí)驗(yàn)組，=3）， 在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h； 然后， 加入100 μL PBS沖洗細(xì)胞2次， 將10 μL CCK-8溶液與90 μL DMEM混合， 共計(jì)100 μL加入每個(gè)培養(yǎng)孔中， 孵育4 h； 加了相應(yīng)量完全培養(yǎng)液、 細(xì)胞和CCK-8溶液但沒有加入藥物的孔作為陰性對(duì)照組（=3）， 加了相應(yīng)量完全培養(yǎng)液和CCK-8溶液但沒有加入細(xì)胞的孔作為空白對(duì)照（=3）； 當(dāng)CCK-8被活細(xì)胞還原成甲瓚后， 用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度.

1.2.8抗衰老藥物篩選細(xì)胞分別在含20 μmol/L亞精胺、 100 μmol/L NMN和100 μmol/L維生素C的完全培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)， 提取第5代（P5）至第9代（P9）1×106個(gè)小鼠胎兒成纖維細(xì)胞的核蛋白復(fù)合物， 隨后的步驟與不同細(xì)胞的SSBR評(píng)估一致.

2 結(jié)果與討論

2.1　SSBR能力評(píng)估系統(tǒng)的可行性分析

Scheme 1示出了熒光報(bào)告系統(tǒng)評(píng)價(jià)SSBR的原理. 芘分子單體被標(biāo)記在寡核苷酸末端， 通過(guò)核酸雜交形成芘二聚體［25～27］. 與典型的單體熒光發(fā)射峰在378和397 nm處相比， 二聚體熒光光譜發(fā)射峰（488 nm）發(fā)生紅移（圖S1， 見本文支持信息）. 退火后的Oligo mix， Bst DNA聚合酶和dNTP在T4 PNK和T4 DNA連接酶存在或不存在的情況下進(jìn)行反應(yīng). 由圖1（A）可以看出， 在T4 PNK和T4 DNA連接酶存在的情況下， 缺口被修復(fù)以抵抗Bst DNA聚合酶的消化， 體系保持芘分子二聚體的綠色熒光； 在沒有T4 PNK或T4 DNA連接酶存在的情況下， 缺口仍然存在， Oligo A被Bst DNA聚合酶通過(guò)5′-3′核酸外切酶活性水解， 導(dǎo)致二聚體的綠色熒光消失， 從而出現(xiàn)芘單體藍(lán)色熒光. 實(shí)驗(yàn)觀察到修復(fù)體系和未修復(fù)體系的熒光比值為780%（譜線和， 488 nm處）.-CD具有特殊的環(huán)狀中空?qǐng)A筒形結(jié)構(gòu)， 空腔內(nèi)側(cè)的非極性基團(tuán)形成一個(gè)疏水環(huán)境， 環(huán)糊精外部的多羥基與極性分子親和力強(qiáng)， 具有親水性. 由于環(huán)糊精分子“環(huán)內(nèi)疏水、 環(huán)外親水”的特殊結(jié)構(gòu)， 可通過(guò)范德華力將一些大小合適的分子嵌入環(huán)狀空腔中， 絡(luò)合成包合物， 為寡核苷酸探針兩端標(biāo)記的兩個(gè)芘分子的空間接近提供了可能， 因此，-CD能夠放大芘二聚體的熒光發(fā)射強(qiáng)度， 從而增強(qiáng)檢測(cè)系統(tǒng)的靈敏度［28，29］. 體系中引入-CD后， 與背景二聚體熒光強(qiáng)度的微小增加相比， 修復(fù)體系中二聚體熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)， 可獲得1003%的熒光比值（譜線和， 488 nm處）. 此外， 本文還利用非變性DNA-PAGE來(lái)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)可行性. 由圖1（B）可見， 當(dāng)Oligo mix未進(jìn)行任何處理時(shí)， 可以看到明顯的帶有兩個(gè)芘分子的電泳條帶（泳道c）. 在修復(fù)體系中， T4 PNK和T4 DNA連接酶同時(shí)存在， 使缺口修復(fù)， 修復(fù)的磷酸二酯鍵可以抵抗Bst DNA聚合酶的外切酶活性， 從而保持完整的序列結(jié)構(gòu)， 由于Oligo mix與修復(fù)產(chǎn)物僅相差一個(gè)磷酸二酯鍵， 而具有相同的堿基數(shù)， 因此在非變性DNA-PAGE中可以在Oligo mix相同的位置觀察到條帶（泳道d）. 然而， 在未修復(fù)體系中， 不存在T4 PNK或T4 DNA連接酶時(shí)， 缺口為Bst DNA聚合酶提供了一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)， Oligo A被外切酶活性完全水解， 然后通過(guò)聚合酶活性產(chǎn)生新的替代鏈， 因此， 可以檢測(cè)到一條含有一個(gè)芘分子的未修復(fù)條帶， 而沒有出現(xiàn)修復(fù)的電泳條帶（泳道e）. 未修飾芘的Oligo B和Oligo full-length作為分子量標(biāo)準(zhǔn)， 序列最短的Oligo B位于底部（泳道a）， 全長(zhǎng)片段比未修復(fù)產(chǎn)物少1個(gè)芘分子， 比修復(fù)產(chǎn)物少2個(gè)芘分子， 因此位于兩條帶的底部（泳道b）， 3條條帶從下至上依次分布. 以上結(jié)果表明， 基于芘分子二聚體的寡核苷酸探針方法檢測(cè)SSBR是完全可行的. 芘二聚體這種特征的大范圍斯托克斯位移（約100 nm）和-CD的熒光信號(hào)放大作用增強(qiáng)熒光信號(hào)與背景比值差異， 使檢測(cè)系統(tǒng)更加靈敏， 使芘分子代替?zhèn)鹘y(tǒng)熒光團(tuán)標(biāo)記核酸探針成為可能［29～32］.

Fig.1　Practicability analysis of the pyrene excimer?based oligonucleotide probe system

（A） Fluorescence spectra change between repair and unrepair sensing system in the presence or absence of-CD. Repair：. Oligo mix+T4 PNK+T4 DNA ligase+Bst DNA polymerase+-CD，. Oligo mix+T4 PNK+T4 DNA ligase+Bst DNA polymerase； Unrepair：. Oligo mix+Bst DNA polymerase+-CD，. Oligo mix+Bst DNA polymerase. Inset： fluorescence photos of repair system（left） and unrepair system（right）. （B） DNA-PAGE analysis of the different products. a. Oligo B； b. Oligo full?length（Oligo A+Oligo B without pyrene）； c. Oligo mix； d. repair； Oligo mix+T4 PNK+T4 DNA ligase+Bst DNA polymerase； e. unrepair， Oligo mix+Bst DNA polymerase.

2.2　實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

為了得到最優(yōu)的結(jié)果， 從Bst DNA聚合酶活性、 反應(yīng)時(shí)間、 Oligo mix濃度、 反應(yīng)溫度等方面進(jìn)行了一系列優(yōu)化實(shí)驗(yàn). Bst DNA聚合酶活性是影響熒光強(qiáng)度的關(guān)鍵因素， 直接決定了背景熒光. 首先， 研究了Bst DNA聚合酶活性對(duì)反應(yīng)體系的影響. 向體系中加入100 U/mL或200 U/mL Bst DNA聚合酶， 由于不存在T4 PNK和T4 DNA連接酶， 水解后的芘二聚體熒光值代表背景熒光值. 反應(yīng)體系中200 U/mL Bst DNA聚合酶的效果明顯優(yōu)于100 U/mL， 且在30 min時(shí)達(dá)到最小熒光值［圖2（A）］， 即在65 ℃條件下， 200 U/mL Bst DNA聚合酶需要30 min達(dá)到最佳效果， 背景值最低. 為了分析最佳反應(yīng)時(shí)間， 使T4 PNK和T4 DNA連接酶與Oligo mix孵育不同時(shí)間（0～120 min）， 由圖2（B）和圖S2（見本文支持信息）可見， 隨著修復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)， 檢測(cè)系統(tǒng)的熒光強(qiáng)度先上升， 90 min后達(dá)到停滯期， 說(shuō)明T4 PNK和T4 DNA連接酶在90 min時(shí)可以達(dá)到最高效率， 因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇孵育90 min. Oligo mix濃度和反應(yīng)溫度的優(yōu)化結(jié)果如圖S3和圖S4（見本文支持信息）所示.

Fig.2　Condition optimization of the pyrene excimer?based fluorescence system

（A） Fluorescence intensity changes of solutions at 488 nm under different Bst DNA polymerase incubating at different times； （B） fluorescence intensity as a function of the reaction time.

2.3　關(guān)鍵修復(fù)酶活性的檢測(cè)

T4 PNK和T4 DNA連接酶在3′-5′磷酸二酯鏈的重建中起著重要的磷酸化和連接作用. 通過(guò)不同酶濃度下的熒光發(fā)射光譜， 檢測(cè)了T4 DNA連接酶和T4 PNK［圖3（A）和（C）］. 首先， 準(zhǔn)備了5種濃度T4 DNA連接酶， 驗(yàn)證了在T4 PNK濃度固定的情況下， 該報(bào)告系統(tǒng)對(duì)T4 DNA連接酶的檢測(cè)能力， 并記錄了488nm處的熒光強(qiáng)度. 由圖3（B）可見， 芘二聚體的熒光強(qiáng)度隨著T4 DNA連接酶濃度的升高而增加， 在T4連接酶濃度為1.6 U/μL時(shí)， 熒光強(qiáng)度達(dá)到峰值. 隨后， 在上述最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下， 通過(guò)熒光光譜探索該系統(tǒng)對(duì)T4 PNK的檢測(cè)能力. 由圖3（D）可見， 隨著T4 PNK濃度的增加， 488 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸升高， 在T4 PNK濃度為100 U/mL時(shí)， 熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值； 并且該報(bào)告系統(tǒng)對(duì)T4 PNK的最低檢測(cè)限為0.1 U/mL. 此外， 建立了T4 PNK濃度與熒光強(qiáng)度的擬合曲線， 在0.1～2 U/mL濃度范圍內(nèi)存在良好的線性相關(guān)性（2=0.9901）. 在適當(dāng)?shù)腡4 DNA連接酶和T4 PNK存在時(shí)， 可以觀察到明顯的熒光， 表明系統(tǒng)完成了修復(fù)過(guò)程.

（A） Fluorescence emission spectra with different concentrations of T4 DNA ligase；（B） fluorescence intensity changes of solutions at 488 nm under different concentrations of T4 DNA ligase， T4 PNK concentration was fixed at 200 U/mL；（C） fluorescence emission spectra with different T4 PNK concentrations；（D） the relationship between fluorescence ratio at 488 nm and T4 PNK concentration. Ligase concentration was fixed at 1.6 U/μL.

2.4　不同細(xì)胞SSBR能力的評(píng)估

由于核蛋白中含有豐富的DNA修復(fù)酶， 并且據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道， 核蛋白被用于研究SSBR［19］， 因此本部分實(shí)驗(yàn)不再加入T4 DNA連接酶和T4 PNK， 而將寡核苷酸探針與核蛋白孵育， 直接評(píng)估不同細(xì)胞的SSBR能力. 通過(guò)用20 μL樣本釋放劑裂解1×106個(gè)細(xì)胞， 獲得核蛋白復(fù)合物， 以確保不同細(xì)胞之間具有可比性. 在Oligo mix中加入小鼠胎兒成纖維細(xì)胞核蛋白復(fù)合物后， 在488 nm處觀察到顯著的熒光值， 說(shuō)明小鼠胎兒成纖維細(xì)胞具有SSBR能力. 然而， 并不是核蛋白濃度越高， 熒光強(qiáng)度越強(qiáng). 核蛋白中的核酶水解寡核苷酸探針， 因此需要在增加熒光強(qiáng)度和核酶活性之間尋求平衡. 由圖4（A）可見， 隨著核蛋白含量的增加， 熒光值先升高后降低， 在0.5 μL處達(dá)到峰值； 基于芘二聚體的發(fā)夾探針設(shè)計(jì)具有更少的末端， 并非典型的三條寡核苷酸形成帶有缺口或間隙的雙鏈， 用于防止核蛋白中潛在的核酸外切酶活性. 在上述結(jié)果的基礎(chǔ)上， 對(duì)腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞系的SSBR能力進(jìn)行了研究. 結(jié)果表明， 與原代胎兒成纖維細(xì)胞相比， 腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞系的熒光強(qiáng)度與背景值幾乎相同， 說(shuō)明腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞系幾乎不具備SSBR能力［圖4（B）和圖S5， 見本文支持信息］. 此外， 簡(jiǎn)要研究了癌細(xì)胞不具備SSBR能力的原因. 向Hela細(xì)胞的反應(yīng)系統(tǒng)中加入額外的T4 PNK或T4 DNA連接酶， 以確定腫瘤細(xì)胞SSBR缺失是否是關(guān)鍵修復(fù)酶活性降低的結(jié)果. 結(jié)果表明， 488nm處的熒光信號(hào)與原始強(qiáng)度相比沒有明顯變化， 相反， 在胎兒成纖維細(xì)胞中， 隨著T4 PNK和T4 DNA連接酶的加入， 熒光明顯增強(qiáng)［圖4（C）］， 由此推測(cè)腫瘤細(xì)胞核蛋白復(fù)合物中的某些物質(zhì)抑制了SSBR， 而該物質(zhì)在胎兒成纖維細(xì)胞中不表達(dá). 隨后對(duì)核蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)， 結(jié)果表明不同細(xì)胞的核蛋白復(fù)合物中蛋白含量不同， 因此在SDS-PAGE上具有條帶不同（圖S6， 見本文支持信息）， 蛋白質(zhì)組成的差異決定了SSBR能力的差異. 此外， 還對(duì)該系統(tǒng)的適用性進(jìn)行了研究. 分別從小鼠子宮細(xì)胞、 心臟細(xì)胞、 脾臟細(xì)胞、 肺細(xì)胞和腎細(xì)胞中獲得核蛋白復(fù)合物， 將上述核蛋白復(fù)合物分別與Oligo mix孵育. 由圖4（D）和圖S7（見本文支持信息）可見， 在不同的體系中均可以觀察到明顯的二聚體熒光信號(hào)， 說(shuō)明這些細(xì)胞都具有SSBR能力. 該系統(tǒng)不僅可用于評(píng)價(jià)小鼠胎兒成纖維細(xì)胞的SSBR能力， 也可用于評(píng)價(jià)其它原代細(xì)胞的SSBR能力. 因此， 該方法具有廣泛的適用性， 并且SSBR可能作為鑒別原代細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞系的新指標(biāo).

Fig.4　Study on the difference in SSBR ability between different cells

（A） Optimization of mouse fetal fibroblast nuclear protein complex； （B） fluorescence intensity of pyrene excimer in different cells’ nucleoprotein complexes. a. Fetal fibroblasts， b. HepG2， c. 296T， d. Hela， e. PK-15； f. A549； （C） fluorescence intensity of the Hela and fetal fibroblast detection system with extra ligase or T4 PNK； the amount of T4 DNA ligase and T4 PNK is 1600 U/mL and 200 U/mL， respectively； （D） fluorescence intensity of pyrene excimer in different primary cells.

2.5　報(bào)告系統(tǒng)對(duì)SSBR評(píng)估的靈敏度檢測(cè)

為了探索基于芘分子的發(fā)夾探針靈敏度， 在最佳實(shí)驗(yàn)條件下， 利用該報(bào)告系統(tǒng)對(duì)小鼠胎兒成纖維細(xì)胞的SSBR檢測(cè)限進(jìn)行了研究. 用20 μL樣本釋放劑裂解不同數(shù)量的細(xì)胞， 在反應(yīng)體系中加入0.5 μL核蛋白復(fù)合物. 由圖5可見， 488 nm的處熒光強(qiáng)度隨著細(xì)胞數(shù)量的減少而下降. 當(dāng)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到 500個(gè)時(shí)， 熒光強(qiáng)度達(dá)到最低點(diǎn). 因此， 基于芘二聚體的熒光報(bào)告系統(tǒng)可檢測(cè)到的最小細(xì)胞數(shù)為500， 即該報(bào)告系統(tǒng)可以直接評(píng)估500個(gè)細(xì)胞的SSBR能力. 或許， 在將來(lái)可以引入基于CRISPR-Cas12a/Cas13a的無(wú)擴(kuò)增DNA生物傳感器來(lái)提高檢測(cè)靈敏度［33，34］.

（A） Fluorescence emission spectrum with different numbers of cells； （B） fluorescence intensity of pyrene excimer at 488 nm with different numbers of cells.

2.6　抗衰老藥物的篩選

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中， 發(fā)現(xiàn)二聚體熒光強(qiáng)度隨著原代胎兒成纖維細(xì)胞的傳代逐漸降低［圖6（A）， 對(duì)照組］， 即在細(xì)胞衰老過(guò)程中， SSBR的能力下降， 但仍高于腫瘤細(xì)胞系， 這一現(xiàn)象與Nassour的研究 結(jié)果一致［9］. 因此， 本部分實(shí)驗(yàn)通過(guò)SSBR與衰老的關(guān)系， 利用報(bào)告系統(tǒng)評(píng)估SSBR從而篩選抗衰老 藥物. 為了評(píng)價(jià)抗衰老藥物， 首先進(jìn)行了細(xì)胞毒性試驗(yàn). 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 幾種藥物毒性較?。蹐D6（B）］. 在細(xì)胞毒性試驗(yàn)后， 將該檢測(cè)系統(tǒng)應(yīng)用于抗衰老藥物的篩選. 將NMN、 亞精胺和維生素C加入細(xì)胞培養(yǎng)基中， 隨后進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)， 收集胎兒成纖維細(xì)胞， 獲得核蛋白復(fù)合物， 評(píng)估P5～P9細(xì)胞的SSBR能力. 結(jié)果表明， 化合物NMN和亞精胺可以延緩胎兒成纖維細(xì)胞SSBR的下降， 從而延緩衰老； 而維生素C作用不顯著［圖6（A）］. 因此， 該報(bào)告系統(tǒng)可以通過(guò)評(píng)估SSBR應(yīng)用于抗衰老藥物篩選.

Fig.6　Detection of potential anti?aging drugs

（A） Cell viability test by CCK-8；（B） fluorescence intensity of the detection system treated with anti-aging drugs. The concentration of NMN， spermidine and Vitamine C is 100 μmol/L， 20 μmol/L， and 100 μmol/L， respectively.

3 結(jié) 論

利用芘二聚體發(fā)夾探針設(shè)計(jì)了一種評(píng)價(jià)細(xì)胞SSBR能力的方法. 該方法具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、 易于操作的優(yōu)勢(shì)， 可以使評(píng)價(jià)細(xì)胞SSBR能力如同PCR反應(yīng)一樣方便； 而且檢測(cè)快速， 進(jìn)行完整的檢測(cè)工作僅需2.5 h， 大幅度縮短了測(cè)試時(shí)間； 該研究可用于評(píng)估細(xì)胞的SSBR能力， 在腫瘤細(xì)胞鑒別方面有巨大的應(yīng)用潛力. 此外， 本文研究結(jié)果在抗衰老藥物的篩選方面也具有很大的市場(chǎng)價(jià)值.

支持信息見http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20230288.

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Direct Evaluation of Single-strand Break Repair Capacity of Cells Using a Pyrene Excimer-based Hairpin Probe

LIYin， LIUJinsong， WANGYu， QITingting， MENGLeyuan， ZHANGJing，LYUDongmei， JIAOHuping*

（，，130062，）

A novel pyrene excimer-based hairpin probe with a nick at the stem was developed to directly evaluate the single-strand break repair（SSBR） ability. In the existence of appropriate activity of DNA repair-associated enzymes（DREs）， the oligonucleotide probe could prevent the digestion of Bst DNA polymerase and keep the long-wavelength excimer signal. However， in the absence of DREs， the nicked probe could be digested by Bst DNA polymerase， bringing about a “turn-off” monomer fluorescence signal. Therefore， the fluorescence changes of the probe could be used to directly evaluate the SSBR capability. After feasibility verification and a series of conditions optimization， the assessment of SSBR capacity by nucleoprotein extracted from different cells was investigated and the results showed that， compared to the primary cell， the tumor cell lines do not have the ability of SSBR. We also explored the deficiency of tumor cells SSBR by compensation with extra SSBR key enzymes and the results indicated that something might inhibit the SSBR in tumor cell lines. Furthermore， the reporter system could detect SSBR of 500 cells and was successfully applied to anti-aging drug screening. The advantages of this method include simple procedure， less time， and good repeatability， and this method can be used for the rapid detection of SSBR capacity of different cells.

Single-strand break repair； Pyrene excimer； Hairpin oligonucleotide probe； Primary cell； Tumor cell

2023-06-19

焦虎平, 男, 博士, 教授, 主要從事細(xì)胞分化及胚胎發(fā)育過(guò)程中DNA修復(fù)方面的研究. E-mail: jiaohp@jlu.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào): 31501909)資助.

O657.39

A

10.7503/cjcu20230288

2023-07-06.

Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.31501909).

（Ed.： W， K， M）