駱錦前,仲 春,陸松偉,王學(xué)彬,3#,俞登榮#

(1.海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科,上海 200433; 2.上海市北蔡社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心,上海 201204; 3.復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院生物藥物系,上海 201203)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是遲發(fā)性中樞神經(jīng)退行性疾病,臨床表現(xiàn)為記憶力和認(rèn)知功能的進(jìn)行性下降[1]。老年人是AD最常見的患病人群,AD發(fā)病率隨年齡增長而升高。AD帶來的高昂治療費(fèi)用及患者自理能力的喪失,給患者及其家屬和社會(huì)帶來了巨大的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。AD是由不同靶點(diǎn)觸發(fā)的系統(tǒng)性多功能障礙疾病,且其發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚[2-3]。因此,運(yùn)用多靶點(diǎn)治療方法將比單一靶點(diǎn)治療更具優(yōu)勢。中藥及其提取物在疾病的多靶點(diǎn)、多途徑治療中具有優(yōu)勢[4]。中藥補(bǔ)骨脂具有補(bǔ)腎固精、溫脾止瀉和平喘等功效[5]。有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚可有效治療AD,但其作用機(jī)制尚不明確[6-7]。隨著生物信息技術(shù)的迅速發(fā)展,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中藥機(jī)制研究中得到了廣泛應(yīng)用。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù),探討補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚在AD治療中的分子作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚結(jié)構(gòu)和潛在作用靶點(diǎn)獲取

在化源網(wǎng)(https://www.chemsrc.com/)中檢索“補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚”,獲取其CAS號(hào),再通過Pubchem數(shù)據(jù)庫(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索CAS號(hào),獲得表示其化學(xué)成分結(jié)構(gòu)的Canonical SMILES序列及2D結(jié)構(gòu),保存為“.sdf”格式。將獲取的Canonical SMILES序列及2D結(jié)構(gòu)分別輸入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)、PharmMapper數(shù)據(jù)庫(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測,設(shè)置物種為“Homo sapiens”,以P>0.05為篩選條件,提交后得到補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚靶點(diǎn)。合并2個(gè)數(shù)據(jù)庫中獲得的靶點(diǎn),統(tǒng)一在UniProt數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)中對(duì)蛋白質(zhì)靶點(diǎn)進(jìn)行名稱規(guī)范后刪除重復(fù)靶點(diǎn),得到補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚的最終靶點(diǎn)。

1.2 AD相關(guān)靶點(diǎn)的獲取

以“Alzheimer’s disease”為關(guān)鍵詞,分別在DisGeNET數(shù)據(jù)庫(http://www.disgenet.org/)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(http://www.genecards.org/)中檢索得到AD相關(guān)的潛在靶點(diǎn),進(jìn)入Drugbank數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca/)尋找治療AD的臨床一線西藥作用靶點(diǎn)予以補(bǔ)充[8]。在GeneCards數(shù)據(jù)庫及DisGeNET數(shù)據(jù)庫中,Score值越高則代表該靶點(diǎn)與疾病聯(lián)系密切,設(shè)定Score值>中位數(shù)的目標(biāo)靶點(diǎn)為AD相關(guān)的潛在靶點(diǎn),合并3個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫獲得的靶點(diǎn)后,刪除重復(fù)靶點(diǎn),得到AD相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚-AD共有靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為探究補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚相關(guān)靶點(diǎn)與AD靶點(diǎn)間的相互作用,利用Venny 2.1.1軟件分析兩者靶點(diǎn)取交集并繪制韋恩圖,最終獲得補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚治療AD的潛在作用靶點(diǎn)。將獲得的兩者共有靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/),設(shè)定物種為“Homo sapiens”,最小互相作用閾值設(shè)定為“medium confidence”(>0.4),其余均為默認(rèn)設(shè)置,構(gòu)建共有靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治雠c核心靶點(diǎn)獲取

將“1.3”項(xiàng)下所得PPI網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件,利用其內(nèi)置插件CytoHubba,對(duì)補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚治療AD靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行核心靶點(diǎn)拓?fù)浞治?得到補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚映射到AD上的核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖,其中靶點(diǎn)越關(guān)鍵,顏色越深。

1.5 基因本體(GO)功能富集分析與京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

利用R語言中Cluster Profiler GO.R插件對(duì)“1.4”項(xiàng)下獲得的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析(P<0.05,設(shè)定為物種為“Homo sapiens”),并對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化分析,得到關(guān)鍵靶點(diǎn)涉及的生物功能和信號(hào)通路。

1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

從RSCB蛋白數(shù)據(jù)庫(PDB,http://www.rcsb.org/)獲得關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白排序居前4位的X射線晶體結(jié)構(gòu)。在分子對(duì)接過程中,采用AutoDockTools v1.5.6軟件將排序居前4位的目標(biāo)靶點(diǎn)與補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚進(jìn)行分子對(duì)接分析,然后使用Pymol軟件對(duì)所得對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化展示。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚潛在靶點(diǎn)的篩選結(jié)果

通過PharmMapper數(shù)據(jù)庫獲得298個(gè)候選基因,通過SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫獲得100個(gè)靶點(diǎn)。2個(gè)數(shù)據(jù)庫靶點(diǎn)合并、刪除重復(fù)靶點(diǎn)后,共得到357個(gè)最終靶點(diǎn)。

2.2 AD相關(guān)靶點(diǎn)的篩選結(jié)果

在DisGeNET數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果中,設(shè)定Score≥0.1,篩選后得到673個(gè)靶點(diǎn);在GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果中,設(shè)定Score≥10,篩選后得到1 493個(gè)靶點(diǎn);在Drugbank數(shù)據(jù)庫中檢索到89個(gè)靶點(diǎn)。3個(gè)數(shù)據(jù)庫靶點(diǎn)合并、刪除重復(fù)靶點(diǎn)后,最終得到1 875個(gè)AD相關(guān)靶點(diǎn)。

2.3 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚-AD共有靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選的補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚靶點(diǎn)與AD靶點(diǎn)取交集,并繪制韋恩圖,得到補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚與AD共同靶點(diǎn)149個(gè)。將149個(gè)共有靶點(diǎn)提交至STRING 11.0平臺(tái),隱藏不與其他靶點(diǎn)有聯(lián)系的靶點(diǎn)后,得到共有靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò),該網(wǎng)絡(luò)共包括146個(gè)節(jié)點(diǎn)、1 819條邊,見圖1。

圖1 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚治療AD靶蛋白PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚治療AD核心靶點(diǎn)獲取結(jié)果

通過Cytoscape 3.7.2軟件內(nèi)置插件CytoHubba插件篩選出排序居前10位的補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚治療AD的核心靶點(diǎn),包括絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)1、MAPK3、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src(SRC)、胱天蛋白酶3(CASP3)、表皮生長因子受體(EGFR)、熱休克蛋白HSP90-α(HSP90AA1)、白蛋白(ALB)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、雌激素受體1(ESR1)和MAPK8,核心靶點(diǎn)信息見表1。補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚治療AD核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖見圖2。

圖2 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚治療AD核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO功能與KEGG通路富集分析

將“1.4”項(xiàng)下獲得的PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入R語言軟件,利用其Cluster Profiler GO.R 插件進(jìn)行GO功能分析與KEGG通路富集分析,并繪制氣泡圖。圖中氣泡大小代表?xiàng)l目富集基因數(shù)目的多少,氣泡顏色差異代表靶基因在各條目富集程度的高低。(1)關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO功能富集,以GeneRatio值前15位與P≤0.05為標(biāo)準(zhǔn),篩選結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示,涉及的生物過程主要包括對(duì)活性氧的應(yīng)答過程(response to reactive oxygen species)、肽基-絲氨酸磷酸化(peptidyl-serine phosphorylation)、肽基-絲氨酸修飾(peptidyl-serine modification)和細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)力的應(yīng)答過程(cellular response to chemical stress)等,見圖3(A);細(xì)胞組分主要涉及囊泡腔(vesicle lumen)、膜筏(membrane raft)、膜微結(jié)構(gòu)域(membrane microdomain)、膜區(qū)域(membrane region)和晚期內(nèi)小體(late endosome)等,見圖3(B);分子功能主要富集于蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性(protein serine/threonine kinase activity)、MAP激酶活性(MAP kinase activity)、支架蛋白的結(jié)合(scaffold protein binding)、ATP酶的結(jié)合(ATPase binding)、整合素結(jié)合(integrin binding),磷酸酶的結(jié)合(phosphatase binding)和泛素蛋白連接酶的結(jié)合(ubiquitin protein ligase binding)等,見圖3(C)。(2)關(guān)鍵靶點(diǎn)KEGG通路富集,以count值前20位與P≤0.05為標(biāo)準(zhǔn),篩選結(jié)果見圖4,靶點(diǎn)通路富集結(jié)果見表2。結(jié)果顯示,該干預(yù)過程在內(nèi)分泌抵抗(endocrine resistance)、雌激素信號(hào)通路(estrogen signaling pathway)最為富集,可能是補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚干預(yù)AD最主要的信號(hào)通路(雌激素信號(hào)通路見圖5)。此外,該干預(yù)過程與局灶性黏附(focal adhesion)、MAPK信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)也有一定的關(guān)系。提示補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚是通過多條信號(hào)通路發(fā)揮治療AD的作用的。

圖4 KEGG通路富集分析氣泡圖(排序居前20位)

2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

將關(guān)鍵靶點(diǎn)排序居前4位的基因(MAPK1、MAPK3、SRC和CASP3)分別與補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚進(jìn)行分子對(duì)接,其中靶點(diǎn)基因與蛋白間活性的結(jié)合能分別為-23.60、-18.66、-20.01及-26.48 kJ/mol。通常認(rèn)為在配體與受體結(jié)合過程中,所需要的結(jié)合能越低,其分子構(gòu)象越穩(wěn)定,即結(jié)合能≤-17.78 kJ/mol,提示有一定結(jié)合活性;結(jié)合能≤-20.92 kJ/mol,說明有較好結(jié)合活性;結(jié)合能≤-29.23 kJ/mol,表示有較強(qiáng)結(jié)合活性[9]。補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚與前4位靶點(diǎn)結(jié)合性較好,且結(jié)合方式較為相似,均結(jié)合于靶點(diǎn)受體的活性中心內(nèi),見圖6。

A. 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚-MAKP1;B. 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚-MAKP3;C.補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚-SRC;D. 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚-CASP3。

3 討論

AD主要的病理特征是腦細(xì)胞外β淀粉樣蛋白(Aβ)聚集形成的老年斑和細(xì)胞內(nèi)過度磷酸化Tau蛋白沉積形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)[10]。目前,關(guān)于AD的發(fā)病機(jī)制尚不明確,較為公認(rèn)的發(fā)病機(jī)制主要有腦膽堿能神經(jīng)元損傷假說、β淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說和炎癥假說等[11]。臨床上無特效治愈藥物,主要給予患者乙酰膽堿酯酶抑制劑和非競爭性N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑,只能在一定程度上改善癥狀,延緩AD進(jìn)程。

補(bǔ)骨脂是一味傳統(tǒng)的中藥,以果實(shí)入藥,具有補(bǔ)腎壯陽、補(bǔ)脾健胃的功效[12]。補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚是異戊烯基黃酮類化合物,作為補(bǔ)骨脂的主要成分之一,具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌和抗病毒等多種藥理作用。有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚在體外試驗(yàn)中可顯著抑制桿狀病毒中BACE1的表達(dá)以及減弱Aβ的聚集[6-7]。推測補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚可能在治療AD方面有重要價(jià)值。對(duì)于補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚的研究開發(fā),首先需闡明其與AD靶點(diǎn)的相互作用。本研究在SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫和PharmMapper數(shù)據(jù)庫中共篩選出補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚干預(yù)AD的相關(guān)靶點(diǎn)149個(gè),通過相關(guān)軟件分析預(yù)測,得到補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚治療AD的關(guān)鍵靶點(diǎn)為MAPK1、MAPK3、SRC和CASP3等。MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)參與調(diào)控Tau蛋白的過度磷酸化、Aβ聚集及神經(jīng)細(xì)胞凋亡等過程,在AD發(fā)生過程中起重要作用[13]。SRC屬于非受體酪氨酸激酶家族,在細(xì)胞內(nèi)傳遞細(xì)胞存活相關(guān)信號(hào),具有細(xì)胞保護(hù)作用。SRC在AD中的作用尚未見報(bào)道,今后可加強(qiáng)這方面的研究。CASP3作為細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵蛋白酶,參與調(diào)控神經(jīng)元的凋亡過程,也可促進(jìn)淀粉樣前體蛋白APP的裂解,加劇Aβ的積聚形成老年斑,誘導(dǎo)AD的發(fā)生[14-15]。由此可見,補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚抗AD的作用可能通過干預(yù)以上途徑來實(shí)現(xiàn)。

PPI網(wǎng)絡(luò)說明補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚與AD共有靶點(diǎn)蛋白之間發(fā)揮著相互作用。GO功能富集分析結(jié)果顯示,補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚作用于AD主要的生物學(xué)過程包括對(duì)活性氧的應(yīng)答過程、肽基-絲氨酸磷酸化、肽基-絲氨酸修飾、細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)力的應(yīng)答等方面。KEGG通路富集分析結(jié)果表明,內(nèi)分泌抵抗、雌激素信號(hào)通路是補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚干預(yù)AD的重要信號(hào)通路。神經(jīng)細(xì)胞損傷和丟失是AD的主要神經(jīng)病理學(xué)特征。雌激素信號(hào)通路與膽堿能神經(jīng)元的生長和生存關(guān)系密切,在AD的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要意義。研究結(jié)果表明,雌激素與其相應(yīng)的受體結(jié)合后,可發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng),促進(jìn)記憶性膽堿能神經(jīng)元的生長和生存,減少Aβ生成并抑制Tau蛋白過度磷酸化等作用[16]。

分子對(duì)接結(jié)果分析顯示,關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白MAPK1、MAPK3、SRC和CASP3與補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚的結(jié)合較為緊密,且均結(jié)合于靶點(diǎn)受體的活性中心內(nèi),進(jìn)一步提示補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚通過MAPK信號(hào)通路發(fā)揮AD治療作用的可行性。

綜上所述,本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法,預(yù)測相關(guān)作用靶點(diǎn),并進(jìn)行生物功能注釋和作用通路分析,從多角度探討了補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚抗AD的主要靶點(diǎn)和信號(hào)通路。結(jié)果提示,補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚可能作用于MAPK1、MAPK3、SRC和CASP3等靶點(diǎn),通過雌激素、MAPK等信號(hào)通路,緩解神經(jīng)元損傷,減少Aβ生成并抑制Tau蛋白過度磷酸化等,從而發(fā)揮抗AD的治療作用。本研究結(jié)果或?yàn)榻窈笱a(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚用于AD的作用機(jī)制研究提供理論依據(jù),也為中醫(yī)治療AD提供了新的思路。