徐愷杰 葉 霞** 丁 力 胡松佩 姚佳烽

（1）江蘇理工學(xué)院機(jī)械工程學(xué)院，常州 213001；2）南京航空航天大學(xué)機(jī)電學(xué)院，南京 210016）

隨著現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展，當(dāng)前醫(yī)療檢測(cè)方法已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞層面［1］。其中，細(xì)胞活性檢測(cè)在毒理學(xué)研究［2］、藥物篩選［3］、病理學(xué)［4］、腫瘤放射敏感性［5-6］等方面應(yīng)用廣泛。在腫瘤細(xì)胞的研究中，為了測(cè)試藥劑對(duì)腫瘤細(xì)胞和良性細(xì)胞的靶向性和破壞性，需要時(shí)常測(cè)定惡性細(xì)胞的存活狀態(tài)及良性細(xì)胞的完整度以判斷其活性是否下降。在各類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中要隨時(shí)記錄細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，也需要確定細(xì)胞的存活率。研究如何檢測(cè)細(xì)胞活性在生命科學(xué)中具有重要的研究意義及應(yīng)用前景。

目前，臨床上已經(jīng)有成熟的細(xì)胞活性檢測(cè)方法。臺(tái)盼藍(lán)染色排除法（trypan blue dye exclusion，TBDE）［7］操作簡(jiǎn)單，可以快速有效地對(duì)活性細(xì)胞和死亡細(xì)胞進(jìn)行定量，但需要特定溶液間接觀察，且部分凋亡細(xì)胞有臺(tái)盼藍(lán)拒染現(xiàn)象；流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）［8］具有速度快，能同時(shí)測(cè)試多個(gè)單位等優(yōu)點(diǎn)，但由于細(xì)胞在前期需要熒光標(biāo)記，會(huì)在一定程度上影響細(xì)胞活性；MTT 比色分析法［9］能有效地避免由于人為操作而造成的實(shí)驗(yàn)誤差，極大提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性，但不適合用于懸浮細(xì)胞，且測(cè)量前需要進(jìn)行細(xì)胞移植和培養(yǎng)；李國(guó)曉［10］利用標(biāo)量衍射理論研究出了細(xì)胞在不同狀態(tài)下的衍射指紋特征，并以此實(shí)現(xiàn)區(qū)分細(xì)胞活性的方法。這些技術(shù)雖然可以有效地區(qū)分細(xì)胞活性，但在實(shí)際操作中都會(huì)一定程度上影響被測(cè)細(xì)胞的活性。再者，這些技術(shù)需要依靠經(jīng)驗(yàn)豐富的操作人員在實(shí)驗(yàn)室中使用特定的試劑檢測(cè)，所以具有一定的局限性。為了進(jìn)一步優(yōu)化細(xì)胞活性在醫(yī)學(xué)檢測(cè)方面的應(yīng)用，醫(yī)學(xué)上亟需一種高效、免標(biāo)記且適用于一般環(huán)境下的全新實(shí)時(shí)檢測(cè)方法。

生 物 阻 抗 譜 （bioelectrical impedance spectroscopy，BIS）技術(shù)是對(duì)生物組織注入安全、多頻、復(fù)阻抗的激勵(lì)電流，以此為基礎(chǔ)來(lái)檢測(cè)生理參數(shù)的技術(shù)［11-12］。此技術(shù)是利用多對(duì)電極向被測(cè)細(xì)胞加以微小幅值的正弦電壓或電流，以掃頻的方式從低頻到高頻來(lái)采集生物組織在各個(gè)頻率分量下的阻抗信息，再通過(guò)提取其中有效響應(yīng)信號(hào)定性分析生物組織內(nèi)部的電學(xué)特性。由于介電測(cè)量具有非入侵的原位測(cè)量特點(diǎn)，并且生物體系服從介電增量和生物量之間存在相關(guān)性原理，從而可以獲得諸如細(xì)胞量的變化、細(xì)胞膜的狀態(tài)等豐富的生理化學(xué)信息。姚佳烽等［13］采用數(shù)值仿真的方法對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行電學(xué)特性與其結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系進(jìn)行了研究，根據(jù)細(xì)胞的生理特征建立了不同種類(lèi)的細(xì)胞電學(xué)模型。尹鴻潤(rùn)等［14］提出一種檢測(cè)生物組織的成像方法，將目標(biāo)區(qū)域可視化并精確判別種類(lèi)。Sande 等［15］分析患者體液管理中的情況，使用BIS輔助調(diào)整血液透析患者的凈體重以改善高血壓。

近幾年的研究表明，BIS在檢測(cè)燙傷程度方面有了新的進(jìn)展。如Edwick等［16］等使用BIS技術(shù)來(lái)評(píng)估燒傷后患者手部的水腫情況，從醫(yī)學(xué)角度評(píng)價(jià)了BIS技術(shù)作為衡量手燒傷后水腫的可靠性和有效性。其成果顯示，BIS檢測(cè)結(jié)果與水置換容量測(cè)定法的一致性較高，是衡量急性手燒傷后水腫的敏感可靠指標(biāo)。此外，BIS是利用生物組織的電阻抗特性來(lái)獲取相對(duì)應(yīng)的病理信息，死亡細(xì)胞相較于活性細(xì)胞有諸多特性［17］，會(huì)產(chǎn)生與活性細(xì)胞不同的響應(yīng)信號(hào)。因此使用BIS技術(shù)可以有效地檢測(cè)生物細(xì)胞中的活性和死亡部分，從中提取出兩種細(xì)胞的相異電學(xué)信息來(lái)區(qū)分細(xì)胞的狀態(tài)。

局限于當(dāng)前實(shí)驗(yàn)條件和技術(shù)手段，本文擬引入與人類(lèi)基因相似度高達(dá)87%的斑馬魚(yú)胚胎干細(xì)胞代替人體燙傷組織，用以研究人體細(xì)胞的介電特性［18］。并使用便攜式無(wú)線電阻抗譜檢測(cè)設(shè)備對(duì)各類(lèi)活性細(xì)胞懸浮液、死亡細(xì)胞懸浮液和混合細(xì)胞懸浮液進(jìn)行掃頻檢測(cè)，比較各類(lèi)懸浮液之間的電學(xué)特性。

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

本文使用了由斑馬魚(yú)胚胎干細(xì)胞制成的不同濃度的懸浮液作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象并搭建了實(shí)驗(yàn)平臺(tái)（圖1a）。實(shí)驗(yàn)平臺(tái)包括1臺(tái)計(jì)算機(jī)、1臺(tái)便攜式無(wú)線電阻抗譜檢測(cè)設(shè)備（PW-EIS）、1個(gè)四電極傳感器及1個(gè)帶有屏蔽裝置的自制比色皿。

圖1b 為自制比色皿結(jié)構(gòu)圖。其底部含有兩對(duì)鍍金電極組成的印制電路板為測(cè)量傳感器，兩兩電極之間的間距為wc=3 mm，每個(gè)電極的感測(cè)面積為A=1.8 mm2。比色皿長(zhǎng)度dc=10 mm，高度hc=20 mm，單次測(cè)量可容納的細(xì)胞懸浮液體積V=2 ml。在測(cè)試中將傳感器放置于含有屏蔽裝置的比色皿中進(jìn)行測(cè)量，可以隔離周?chē)h(huán)境的電磁干擾，有效減少誤差，為降低數(shù)據(jù)采集過(guò)程中的接觸阻抗，本文選用四電極法，并在實(shí)驗(yàn)前，使用無(wú)水乙醇擦拭電極表面，消除輕度氧化層。傳感器的4個(gè)鍍金電極通過(guò)4 條屏蔽線連接到PW-EIS 上，PW-EIS 捕獲探頭發(fā)出的信號(hào)后，將測(cè)量數(shù)據(jù)傳輸給PC 機(jī)進(jìn)行后續(xù)的處理。

圖2為激勵(lì)區(qū)域下胚胎干細(xì)胞在傳感器中的電場(chǎng)和電場(chǎng)線分布。在COMSOL 仿真模擬研究中表明，最大頻率為1 MHz 下，電極位于底部時(shí)所產(chǎn)生的電場(chǎng)線能流經(jīng)胚胎干細(xì)胞，并且完全穿透，進(jìn)一步驗(yàn)證了數(shù)據(jù)采集的有效性和可靠性。

Fig.2 Electric field and electric field line distribution of embryo tissue at positions of the sensor under excitation areas

1.2 臺(tái)盼藍(lán)染色篩選

為了在實(shí)驗(yàn)前判別所使用的斑馬魚(yú)胚胎是否具有活性，本文選用臺(tái)盼藍(lán)染色排除法來(lái)剔除已喪失活性的胚胎。正?；钚耘咛ゼ?xì)胞具有完整的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，能夠排斥臺(tái)盼藍(lán)，使胚胎不被染色；死亡的胚胎其細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞、胞膜不完整、通透性增加，可使臺(tái)盼藍(lán)滲入將胚胎細(xì)胞染成藍(lán)色。因此，借助臺(tái)盼藍(lán)染色法可以快速地區(qū)分活性胚胎細(xì)胞和死亡胚胎細(xì)胞。如圖3 所示，使用濃度為0.4%的臺(tái)盼藍(lán)染色液與細(xì)胞懸浮液以1∶9 比例混合均勻（最終濃度為0.04%）并靜置5 min。完成染色后使用滴管將胚胎取出并放置于蓋玻片上使用光學(xué)顯微鏡（PRIMOTECH型）觀察。

活性胚胎能夠清晰地看到胚胎內(nèi)的組織（圖4）。因?yàn)榛钚耘咛サ募?xì)胞膜完整，能夠排斥臺(tái)盼藍(lán)染料，使其不進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，而喪失活性的細(xì)胞因細(xì)胞膜被破壞，不再完整則可被染成藍(lán)色。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，所有被染色的胚胎外表都具有乳白色斑點(diǎn)。后續(xù)研究表明［19］，胚胎外表呈現(xiàn)透明狀為完成受精且具有活性，外表出現(xiàn)白色斑點(diǎn)則為喪失活性或未受精胚胎。下文所使用的均為外表呈現(xiàn)透明且完整的活性胚胎。

Fig.4 Embryo images

1.3 細(xì)胞懸浮液制備

為了比較活性胚胎干細(xì)胞與死亡胚胎干細(xì)胞在交流頻率范圍內(nèi)的電學(xué)特性，參照文獻(xiàn)［20］制備不同體積百分濃度的生物細(xì)胞懸浮液，以獲得胚胎干細(xì)胞在交流頻率范圍內(nèi)的阻抗數(shù)據(jù)。其制備過(guò)程如下：選取一批篩選后的活性斑馬魚(yú)胚胎干細(xì)胞放置于兩個(gè)含有磷酸緩沖溶液（PBS）的培養(yǎng)皿中。選取其中一個(gè)培養(yǎng)皿放置于數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4J）中，經(jīng)56℃水浴40 min 后，可獲得已完全滅活的細(xì)胞懸浮液。將制備后的細(xì)胞懸浮液放置于一旁，靜置其至室溫后便可用于實(shí)驗(yàn)測(cè)試。

1.4 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

準(zhǔn)備一個(gè)自制比色皿，使用滴管將兩個(gè)培養(yǎng)皿中的胚胎取出，以不同比例放入比色皿中待檢測(cè)，并往比色皿中加入一定量的生理鹽水以保證掃頻電流能完全通過(guò)所有細(xì)胞。為進(jìn)一步減小電極與被測(cè)組織的接觸電阻，同時(shí)減少電極與細(xì)胞組織電解液之間的極化，使用四電級(jí)法［21］測(cè)量細(xì)胞的阻抗譜。使用幅值為I=1 mA，掃頻范圍為1~106Hz 的交流電對(duì)細(xì)胞進(jìn)行激勵(lì)，并檢測(cè)其兩端的電位信號(hào)。對(duì)細(xì)胞懸浮液進(jìn)行掃頻，每次數(shù)據(jù)采集3 組。本組實(shí)驗(yàn)完成后清洗比色皿，再更換不同體積百分濃度的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行上述操作。對(duì)每組3次采集的數(shù)據(jù)取平均值，再進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 BIS檢測(cè)結(jié)果分析

圖5a，b 給出了在1~106Hz 頻率范圍下，不同體積百分濃度下的活性胚胎干細(xì)胞懸浮液和死亡細(xì)胞懸浮液的幅值頻譜?？梢钥闯?，對(duì)于兩類(lèi)不同體積百分濃度的懸浮液，其阻抗幅值的變化趨勢(shì)在整體上都是一致的，但是在相同的頻點(diǎn)上，其阻抗幅值大小不同。細(xì)胞懸浮液的阻抗幅值都是隨著頻率的增加而降低，具有活性細(xì)胞的懸浮液其阻抗值比滅活后的阻抗值平均高出17.25%。從前半段趨于平穩(wěn)的部分中可以看出活性細(xì)胞懸浮液的阻抗幅值相較于滅活細(xì)胞懸浮液更具波動(dòng)性，這是由于滅活胚胎細(xì)胞的細(xì)胞外膜在加熱過(guò)程中受損，進(jìn)而喪失高電容性。對(duì)于5%~20%體積百分濃度的活性胚胎細(xì)胞懸浮液，在0~45.25 kHz 的頻率范圍內(nèi)阻抗幅值略微下降1.12%，總體下降趨勢(shì)趨于穩(wěn)定。隨著頻率的增加，當(dāng)頻率達(dá)到45.25 kHz 時(shí)，阻抗幅值大幅下降。與活性細(xì)胞懸浮液相比，體積百分濃度為5%~20%的滅活細(xì)胞懸浮液頻率達(dá)到61.08 kHz后，才會(huì)發(fā)生阻抗幅值大幅下降的趨勢(shì)。圖5c，d為弛豫頻率下細(xì)胞懸浮液的濃度-幅值擬合圖；在同一類(lèi)狀態(tài)下，不同體積百分濃度對(duì)弛豫頻率的產(chǎn)生影響很小，且不同濃度下的阻抗值有明顯的規(guī)律，以此結(jié)論擬合函數(shù)，可以判斷兩類(lèi)懸浮液弛豫狀態(tài)下的濃度。

Fig.5 Amplitude spectroscopy of suspension

隨著B(niǎo)IS的深入研究，學(xué)者們建立了各種等效模型和電路理論來(lái)分析多頻電阻抗數(shù)據(jù)。這些模型都將被測(cè)的細(xì)胞組織視為含有電阻和電容的電路。在本文中BIS 的參數(shù)映射將使用科爾模型（Cole Model）其電路的數(shù)學(xué)方程如下：

其中，Y是全導(dǎo)納，G是電導(dǎo)，j為虛數(shù)單位，B是電納。G0是零驅(qū)動(dòng)頻率下的導(dǎo)納，G∞是驅(qū)動(dòng)無(wú)限大時(shí)的導(dǎo)納，fyc是導(dǎo)納虛部達(dá)到最大值時(shí)的頻率，jf是驅(qū)動(dòng)頻率，α是色散參數(shù)。

阻抗幅值在低頻區(qū)受細(xì)胞外環(huán)境影響，高頻區(qū)受細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)影響。在低頻段時(shí)，細(xì)胞組織中的阻抗成分中，主導(dǎo)成分為容抗。當(dāng)施加給細(xì)胞懸浮液的外電場(chǎng)頻率較低時(shí)，由于細(xì)胞膜的高電阻性、高容抗性，在低頻時(shí)導(dǎo)電性差，電流難以穿過(guò)細(xì)胞，必須繞過(guò)細(xì)胞并穿過(guò)細(xì)胞外區(qū)域，此時(shí)的等效電路可視為開(kāi)路，所以阻抗幅值較高；另一方面，隨著頻率的逐漸升高，由于胚胎干細(xì)胞膜的電容性質(zhì)，高頻電流能夠穿透細(xì)胞膜和細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的其他電子屏障。電流穿過(guò)細(xì)胞外液，電阻抗和細(xì)胞膜容抗緩慢降低，阻抗幅值就會(huì)隨之緩慢下降。當(dāng)頻率達(dá)到一定的幅值時(shí)，細(xì)胞會(huì)逐漸處于導(dǎo)通狀態(tài)，此時(shí)電流可以完全通過(guò)細(xì)胞，這時(shí)與之對(duì)應(yīng)的阻抗幅值隨之快速降低，阻抗幅值的變化也反應(yīng)了細(xì)胞的電容性特點(diǎn)。同時(shí)，從圖5a，b中可以明顯看出，兩種細(xì)胞懸浮液的濃度越高，在同頻率下，其阻抗幅值越低，在0~45.25 kHz 時(shí)，阻抗幅值小幅減少，直到頻率達(dá)到45.25 kHz之后，阻抗幅值大幅下降。

細(xì)胞是構(gòu)成生物的基本單元，單個(gè)細(xì)胞由細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜及細(xì)胞液構(gòu)成，并分散在組織液中，而細(xì)胞膜由低電導(dǎo)率的磷脂雙層和蛋白質(zhì)離子組成，因此細(xì)胞膜可以等效為電容。根據(jù)Hanai細(xì)胞模型可以把胚胎干細(xì)胞有效地區(qū)分為3 個(gè)部分：細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞壁，這3個(gè)部分造成了與頻率相關(guān)的不同形式的細(xì)胞電學(xué)特性。圖6為細(xì)胞懸浮液的等效電路圖，對(duì)應(yīng)細(xì)胞的生理結(jié)構(gòu)。細(xì)胞質(zhì)和溶液由蛋白質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽和水組成，這些成分都具有抗性。通常將細(xì)胞膜的等效電容和細(xì)胞質(zhì)的等效電阻串聯(lián)起來(lái)，再與細(xì)胞外液的等效電阻并聯(lián)起來(lái)，最終組合成細(xì)胞懸浮液的等效電路圖。圖中Rdl和Cdl分別是雙電層的電阻和電容，Cm是細(xì)胞膜的電容，Rcy是細(xì)胞質(zhì)的電阻，Rs是組織液（細(xì)胞外液）的電阻。考慮到實(shí)際測(cè)量過(guò)程中，界面極化對(duì)細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果的影響，引入界面極化電阻和界面極化電容。參照細(xì)胞懸浮液的等效電路圖，建立了等效電路的阻抗-頻率響應(yīng)函數(shù)模型：

Fig.6 Equivalent circuit diagram of suspension

等效電路中出現(xiàn)的細(xì)胞膜電容和雙電層電容使得細(xì)胞懸浮液的阻抗下降趨勢(shì)趨于平緩，而頻率達(dá)到45 kHz 后，抗幅值快速減小，這意味著此時(shí)的頻率就是細(xì)胞懸浮液的弛豫頻率，可以用科特模型的弛豫參數(shù)模型來(lái)表示，其數(shù)學(xué)公式如下：

式中，εh是介電常數(shù)的高頻極限值，Δεn是介電增量，ε1是介電常數(shù)的低頻值，τn是弛豫時(shí)間，kl是低頻電導(dǎo)率，fn是特征頻率，j是虛數(shù)單位，ω是外加電場(chǎng)的角頻率，βn是科特參數(shù)，ε0是真空介電常數(shù)。

2.2 細(xì)胞懸浮液的特性分析

為了探究和分析在同等體積百分濃度下多種細(xì)胞活性程度是否會(huì)對(duì)懸浮液的弛豫頻率和虛部阻抗值產(chǎn)生影響。通過(guò)實(shí)驗(yàn)獲得了4類(lèi)不同體積百分濃度的混合懸浮液在變頻條件下虛部阻抗幅值的變化趨勢(shì)，并與同體積百分濃度下的純活性和純滅活細(xì)胞懸浮液進(jìn)行對(duì)比。

從圖7整體來(lái)看，同等體積百分濃度下各個(gè)細(xì)胞懸浮液的阻抗幅值都是隨著頻率的增加而上升，直到某一時(shí)刻頻率達(dá)到了弛豫時(shí)間，阻抗幅值的趨勢(shì)才發(fā)生了轉(zhuǎn)變，開(kāi)始下降。這是因?yàn)樵谕润w積百分濃度下，純活性懸浮液中細(xì)胞完整度高，細(xì)胞膜具有較高的阻抗特性。其中，純活性細(xì)胞懸浮液的阻抗幅值整體來(lái)看大于另外兩種細(xì)胞懸浮液。如表1 所列，其弛豫頻率發(fā)生的時(shí)間早于另外兩類(lèi)，隨著濃度的增加，同類(lèi)懸浮液之間的阻抗幅值也相繼減小，而混合濃度細(xì)胞懸浮液的阻抗幅值在3類(lèi)中整體來(lái)看是最小的。另外，從表1 中可以看出，相較于混合濃度懸浮液，純滅活細(xì)胞懸浮液的弛豫頻率雖然先產(chǎn)生，但兩者弛豫頻率的間隔相差很小只有4.18%~4.73%。圖8 為斑馬魚(yú)胚胎干細(xì)胞懸浮液、雄豬生殖細(xì)胞懸浮液、酵母菌細(xì)胞懸浮液在不同濃度時(shí)頻率和虛部阻抗幅值的離散度。對(duì)于3種細(xì)胞懸浮液，在弛豫頻率下可以清楚的區(qū)分為兩大類(lèi)聚類(lèi)區(qū)域。聚類(lèi)分析表明純活性細(xì)胞懸浮液可以與純滅活和混合懸浮液相區(qū)分，從而鑒別懸浮液中是否具有死亡細(xì)胞，進(jìn)一步驗(yàn)證BIS技術(shù)可以為醫(yī)學(xué)檢測(cè)細(xì)胞活性方面提供有效幫助。

Fig.7 Electrical impedance imaginary part of cell suspension

Table 1 Relaxation point parameters for three types of cell suspensions

Fig.8 Dispersion of magnitude versus phase of cell suspension

3 結(jié) 論

本文根據(jù)臺(tái)盼藍(lán)染色排除法篩選出的斑馬魚(yú)胚胎制成斑馬魚(yú)胚胎干細(xì)胞懸浮液，采用BIS方法對(duì)各類(lèi)不同濃度、不同活性的干細(xì)胞懸浮液進(jìn)行了電學(xué)特性研究，比較發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞懸浮液的阻抗幅值在各類(lèi)不同狀態(tài)下有較為明顯的差異。在同等濃度下，活性細(xì)胞的阻抗幅值大于死亡細(xì)胞17.25%，在頻率為45.25 kHz 時(shí)，活性細(xì)胞達(dá)到了弛豫，且其弛豫時(shí)間早于死亡細(xì)胞25%。

本文研究方法無(wú)需樣品預(yù)處理，操作簡(jiǎn)單，可以通過(guò)PW-EIS 直接進(jìn)行檢測(cè)。在研究了各類(lèi)不同狀態(tài)的細(xì)胞懸浮液，了解了細(xì)胞懸浮液在電學(xué)特性方面存在的差異后，可以通過(guò)弛豫時(shí)間、頻率和阻抗，采用BIS技術(shù)來(lái)區(qū)分和辨別生物細(xì)胞組織的存活狀態(tài)，并為后續(xù)研究生物細(xì)胞的準(zhǔn)確濃度和活性奠定了基礎(chǔ)。