陳心珠 劉曉宇 張少芳** 穆曉宇** 張曉東1，**

（1）天津大學(xué)醫(yī)學(xué)工程與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，天津 300072；2）天津大學(xué)理學(xué)院，天津 300350）

人工酶是一種具有類(lèi)似天然酶特性的材料，可以模擬催化人體內(nèi)的生物化學(xué)反應(yīng)［1-5］。其中，作為新一代人工酶——納米酶，其相比于天然酶具有更強(qiáng)的穩(wěn)定性、更低的制備成本以及更加普適的催化反應(yīng)條件［6-8］，因而被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、檢測(cè)傳感、環(huán)境治理以及能源再生等多個(gè)領(lǐng)域［9-15］。然而，目前大多數(shù)納米酶的催化活性低、底物選擇性差，難以實(shí)現(xiàn)催化活性的選擇性調(diào)控。并且其結(jié)構(gòu)組成復(fù)雜，導(dǎo)致催化活性位點(diǎn)不明確、催化機(jī)理研究困難［16-17］。因此，納米酶的設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)需要新的方向和策略。

近年來(lái)，在原子水平構(gòu)建人工酶的策略為納米酶的發(fā)展提供了新的思路，通過(guò)將納米酶的活性位點(diǎn)精確到具有明確配位結(jié)構(gòu)的幾個(gè)或幾十個(gè)原子，然后在原子水平調(diào)控設(shè)計(jì)出具有更高類(lèi)酶活性和更強(qiáng)選擇性的納米酶［18-23］。比如Liu 等［24］制備了一種由25 個(gè)金原子組成的團(tuán)簇酶（Au25MPA18），通過(guò)原子水平的調(diào)控，成功地獲得了類(lèi)過(guò)氧化氫酶（CAT）活性提升的Au24Cu1MPA18和類(lèi)超氧化物歧化酶（SOD）活性提升的Au24Cd1MPA18，區(qū)別于團(tuán)簇酶原有的優(yōu)異的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPx）活性。團(tuán)簇酶自身精確的原子配位結(jié)構(gòu)也為研究人員分析計(jì)算催化反應(yīng)路徑以及反應(yīng)的可能性提供了便利條件。此外，一種新型的人工納米酶——單原子納米酶（single-atom nanozyme，SAN）因具有與天然酶相似的催化反應(yīng)活性中心，且配位環(huán)境簡(jiǎn)單、催化活性高、類(lèi)酶活性豐富以及回收利用方便，一經(jīng)提出就成為了研究的熱點(diǎn)［25-27］。目前通過(guò)“自下而上”以及“自上而下”等方法制備的多種SAN 已經(jīng)被廣泛研究并應(yīng)用于檢測(cè)傳感以及抗腫瘤、殺菌抗炎、創(chuàng)傷性腦損傷的治療等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域［28-32］。

隨著SAN 的蓬勃發(fā)展，多種金屬元素組成的M-N-C 結(jié)構(gòu)（M 為Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Mn、Ru、Ir、Pd 等）被用于模擬天然酶的活性中心位點(diǎn)。其中Cu 元素作為多種天然酶（如漆酶、SOD等）活性中心的組成部分，其價(jià)格低廉，獲取渠道廣泛，被用于制備Cu SAN，在多個(gè)領(lǐng)域取得了顯著的成果。如Cheng 等［33］將制備的基于多孔碳基質(zhì)的Cu-N4單原子催化劑應(yīng)用于電催化CO2還原生成CO， 在-0.9 Vvs.RHE （reversible hydrogen electrode，可逆氫電極）時(shí)的CO 法拉第效率（實(shí)際生成物與理論生成物的百分比）高達(dá)98%，對(duì)于CO2還原表現(xiàn)出強(qiáng)的活性和選擇性。Zong 等［34］制備的Cu 單原子催化劑同時(shí)具有優(yōu)異的氧還原反應(yīng)（ORR）和析氧反應(yīng)（OER）兩種電催化活性，被成功應(yīng)用于鋅-空氣電極的空氣陰極材料，性能優(yōu)異。Zhang等［35］則將Cu單原子催化劑用于催化苯氧化生成苯酚，展現(xiàn)出83.7%的苯轉(zhuǎn)化率和98.1%的苯酚選擇性。以上研究結(jié)果均表明了Cu SAN在能源再生以及環(huán)境保護(hù)中潛在的應(yīng)用價(jià)值。Wu等［36］則將其制備的具有優(yōu)異類(lèi)過(guò)氧化物酶（POD）活性的高負(fù)載Cu 單原子納米酶（highloading Cu SAN）（~5.1%（質(zhì)量百分比））與天然乙酰膽堿酯酶以及膽堿氧化酶相結(jié)合構(gòu)建了級(jí)聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)，對(duì)于乙酰膽堿的檢測(cè)限達(dá)到1.24 μmol/L，對(duì)于有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)限達(dá)到了0.6 ng/L。除了體外研究應(yīng)用，研究人員也嘗試將Cu SAN轉(zhuǎn)化應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，Wang 等［23］制備了Cu SAN，具有強(qiáng)類(lèi)POD活性、谷胱甘肽消耗作用和光熱性能，協(xié)同應(yīng)用于抗菌可以達(dá)到接近100%的效率。Zhang 等［25］則創(chuàng)造性地將具有優(yōu)異類(lèi)SOD 活性的Cu SAN 以及其他一系列SAN 與可吸收縫合線結(jié)合，應(yīng)用于創(chuàng)傷性腦損傷后的傷口縫合，結(jié)果顯示其可以促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的產(chǎn)生，加速腦損傷后的頭皮傷口愈合?？傊?，以單原子作為活性中心的催化劑因其超高的催化性能和選擇性已經(jīng)在越來(lái)越廣闊的領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。

雖然SAN 的原子利用率較高，但是較低的原子負(fù)載量使得SAN的整體活性仍然有限。據(jù)報(bào)道，大多數(shù)SAN的金屬原子負(fù)載量低于3%（質(zhì)量百分比）。隨著金屬粒子尺度縮小至原子水平，其表面自由能會(huì)急劇增加，導(dǎo)致金屬原子聚集形成納米顆粒、金屬氧化物晶體等從而影響原子利用率［16，37］。因此，開(kāi)發(fā)具有高分散性和高負(fù)載量的SAN 成為目前研究的難點(diǎn)?，F(xiàn)有的高負(fù)載SAN 在制備過(guò)程中多借助金屬和載體原子之間強(qiáng)的金屬-載體相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)原子負(fù)載量的提升［5，38］，例如Zheng等［39］在制備過(guò)程中使用二維層狀過(guò)渡金屬硫族化合物作為載體，借助表面刻蝕后載體上形成高密度的陰離子空位捕獲硫脲-過(guò)渡金屬原子復(fù)合物，使Fe 單原子催化劑的負(fù)載量達(dá)10%（質(zhì)量百分比）。Li 等［40］使用區(qū)別于傳統(tǒng)金屬有機(jī)框架（metal organic frameworks，MOFs）燒結(jié)制備單原子的方法，以Cu MOF 作為前驅(qū)體，與雙氰胺混合后燒結(jié)制備Cu單原子催化劑，負(fù)載量達(dá)20.9%（質(zhì)量百分比）。其中，雙氰胺為單原子錨定提供的豐富的N元素是負(fù)載量提升的關(guān)鍵。Wang等［41］以具有高比表面積的硫摻雜介孔碳為載體，借助金屬和S原子之間的強(qiáng)鍵合作用使得制備的Pt 單原子催化劑的負(fù)載量達(dá)10%（質(zhì)量百分比）。上述這些研究為制備高負(fù)載SAN提供了可行性策略。

本文采用原位錨定策略將金屬鹽前驅(qū)體錨定在氨基化石墨烯量子點(diǎn)形成的框架中，石墨烯量子點(diǎn)以及尿素中富含的N原子促進(jìn)了金屬原子與載體之間形成強(qiáng)的金屬-載體相互作用，協(xié)同實(shí)現(xiàn)了Cu原子的高密度均勻分散。文中系統(tǒng)地研究了金屬負(fù)載量對(duì)于單原子結(jié)構(gòu)和活性的影響，將本研究制備的高負(fù)載Cu SAN 與傳統(tǒng)的MOFs 錨定法制備的低負(fù)載Cu單原子納米酶（low-loading Cu SAN）的多種類(lèi)酶活性進(jìn)行定量對(duì)比。結(jié)果表明，本研究制備的高負(fù)載Cu SAN 具有更高的模擬POD 和SOD 的生物催化活性，并表現(xiàn)出催化選擇性，為高負(fù)載SAN的制備及類(lèi)酶活性研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑

無(wú)水氯化銅（CuCl2，98%）購(gòu)自北京伊諾凱科技有限公司，尿素（CH4N2O）購(gòu)自天津希恩思生化科技有限公司，六水合硝酸鋅（Zn（NO3）2·6H2O，99%）、過(guò)氧化氫（H2O2，30%（質(zhì)量百分比））、二甲基亞砜（DMSO，＞99.8%）、異丙醇（99.8%）購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司，2-甲基咪唑（99%）、3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB，99%）購(gòu)自上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司，辣根過(guò)氧化物酶（HRP，＞300 U/mg）購(gòu)自上海麥克林生化有限公司，去離子水（＞99.5%）購(gòu)自天津元立化工有限公司，醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 4.5）、TMB底物顯色試劑盒（ELISA，HRP發(fā)光）購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司，總SOD 活性檢測(cè)試劑盒（氮藍(lán)四唑，NBT 法）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 高負(fù)載Cu SAN的制備

本文制備的高負(fù)載Cu SAN是在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化后合成的［42］。將30 ml濃度為1 g/L的氨基化石墨烯量子點(diǎn)溶液與濃度為5 g/L的CuCl2溶液（分別含有0.01、0.02、0.03 或0.05 mmol CuCl2）均勻混合，混合后的溶液在冰水浴中超聲15 min，然后立刻在液氮中凍結(jié)并放入冷凍干燥機(jī)（BSA224S，美國(guó)Gibco 生物科技公司）中冷凍干燥。獲得的粉末與尿素按照1∶10的質(zhì)量比研磨混勻放入剛玉舟中。然后將剛玉舟移入真空管式爐（SK-GO6123K，天津中環(huán)），在氬氣保護(hù)下以10℃/min 的升溫速度加熱至50℃并煅燒2 h。待降溫結(jié)束后，得到的粉末即為不同摻雜比的Cu SAN。

文中用于對(duì)比的低負(fù)載Cu SAN也是參考文獻(xiàn)的制備方法進(jìn)一步優(yōu)化后合成的［25］。首先，將0.590 9 g 2-甲基咪唑和0.508 5 g Zn（NO3）2·6H2O分別溶解在45 ml 和50 ml 甲醇中，然后在磁力攪拌的作用下混勻，60℃靜置24 h后收集白色沉淀物，使用無(wú)水乙醇洗滌至沉淀呈透明。真空干燥后收集晶體研磨均勻，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下900℃燒結(jié)2 h。稱(chēng)取120 mg 燒結(jié)后的粉末分散于異丙醇中，加入4.5 mg CuCl2，混合液超聲震蕩。將超聲后的溶液離心、洗滌及干燥后，氮?dú)獗Ｗo(hù)下500℃燒結(jié)1 h。收集獲得的粉末即為低負(fù)載Cu SAN。

1.3 高負(fù)載Cu單原子納米酶的表征

使用球差校正透射電子顯微鏡（AC-STEM，JEM-ARM200F，日本電子）對(duì)制備的高負(fù)載SAN的原子信息進(jìn)行觀察；在X 射線衍射儀（XRD，Smartlab，日本理學(xué)）10°~60°的范圍內(nèi)對(duì)制備的SAN 進(jìn)行了物象鑒定；利用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS，7900ICP-MS，英國(guó)安捷倫）測(cè)試了高/低負(fù)載的Cu SAN的原子負(fù)載量；X射線光電子能譜儀（XPS，Axis Supra，Kratos）測(cè)試分析了SAN 的元素組成，并通過(guò)分峰擬合推測(cè)了原子的成鍵情況。

1.4 類(lèi)POD活性檢測(cè)

本文按照TMB 底物顯色試劑盒中的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作測(cè)試了納米酶的類(lèi)POD 活性。首先，將試劑盒中的TMB 顯色液、TMB 緩沖液和TMB 氧化劑按照5 000∶5 000∶4 的體積比配制成工作液。然后將20 μl 濃度為100 mg/L 的不同摻雜比例的Cu SAN 和180 μl 工作液混合作為實(shí)驗(yàn)組，20 μl 去離子水和180 μl工作液混合作為對(duì)照組，將樣品放入96 孔板中，使用多功能酶標(biāo)儀（SuPerMax 3000FA，上海閃譜）實(shí)時(shí)檢測(cè)652 nm 處的吸光度值。不同濃度（100、80、60、40、20 和10 mg/L）的高/低負(fù)載Cu單原子的類(lèi)POD活性測(cè)試方法與上述操作相同。實(shí)驗(yàn)中選取不同濃度的HRP 作為標(biāo)準(zhǔn)品制定了標(biāo)準(zhǔn)曲線，將SAN 在652 nm 處的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，對(duì)納米酶的類(lèi)POD 活性進(jìn)行了定量。

使用紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)（UV-3600，日本島津）的動(dòng)力學(xué)模式測(cè)試了Cu SAN類(lèi)POD活性的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。測(cè)試時(shí)，將高/低負(fù)載SAN、不同濃度的H2O2（0、0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50 mmol/L）或TMB（0、6、10、25、50、100、200、400、800 μmol/L）加入醋酸-醋酸鈉緩沖液中，保持溶液總體積為200 μl，監(jiān)測(cè)混合后的反應(yīng)液在652 nm 處的吸光度值。之后對(duì)測(cè)試的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，利用Origin軟件作出雙倒數(shù)圖并擬合得到納米酶催化底物的米氏常數(shù)（Km） 和最大反應(yīng)速率（Vm）。TMB 的摩爾消光系數(shù)為：ε652nm=39 000 L·mol-1·cm-1。

1.5 類(lèi)SOD活性檢測(cè)

本文中所有類(lèi)SOD 活性檢測(cè)均按照總SOD 活性檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。首先將試劑盒中的SOD 提取液、NBT 顯色液和酶溶液按照100∶30∶30 的比例混合配制成SOD 檢測(cè)工作液。檢測(cè)時(shí)，分別在96 孔板的孔中加入160 μl 工作液，20 μl 濃度為300 mg/L 的樣品，20 μl 反應(yīng)啟動(dòng)液，光照對(duì)照組用20 μl SOD提取液替代樣品，將96孔板在日光燈下照射10 min 至光照對(duì)照組的溶液變?yōu)樗{(lán)綠色。然后加入避光對(duì)照組，避光對(duì)照組用40 μl SOD 提取液替代樣品和反應(yīng)啟動(dòng)液，在560 nm 處檢測(cè)各孔的吸光度值。其中光照對(duì)照組未加入SAN，所以光照之后的反應(yīng)液在560 nm 處具有明顯的吸收；避光對(duì)照組未加入SAN且未經(jīng)過(guò)光照，所以在560 nm 處沒(méi)有明顯的紫外吸收。用紫外分光光度計(jì)測(cè)試上述反應(yīng)后的混合液在400~800 nm處的吸收曲線以進(jìn)一步比較高/低負(fù)載的Cu SAN的類(lèi)SOD 活性，取光照對(duì)照組作為對(duì)照線（Con）。不 同 濃 度（500、400、300、200、100、50 和30 mg/L）的高/低負(fù)載Cu SAN 活性測(cè)試方法與上述操作相同。按照試劑盒中的說(shuō)明將吸光度轉(zhuǎn)化為抑 制 率， 公 式 為 抑 制 率/% =（A光照-A實(shí)驗(yàn)組）/（A光照-A避光）×100。計(jì)算SOD 活力的公式為：酶活力/U=抑制率/（1-抑制率）。

1.6 類(lèi)OXD活性檢測(cè)

本文使用TMB 顯色法檢測(cè)樣品的類(lèi)氧化物酶（OXD）活性。實(shí)驗(yàn)時(shí)，稱(chēng)取TMB 粉末溶解在DMSO中配成濃度為16 mmol/L的工作液，分別將170 μl醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 4.5）、10 μl TMB工作液和20 μl 濃度為300 mg/L 的不同摻雜比例的樣品加入96孔板中，對(duì)照組使用20 μl醋酸-醋酸鈉緩沖液替代樣品。將各組溶液混合均勻后，使用多功能酶標(biāo)儀實(shí)時(shí)檢測(cè)96 孔板中的液體在652 nm 處的吸光度值。不同濃度的高/低負(fù)載Cu單原子活性測(cè)試方法與上述操作相同，使用的樣品濃度分別為500、400、300、200、100和50 mg/L。

1.7 類(lèi)CAT活性檢測(cè)

本文借助紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)檢測(cè)H2O2在240 nm 處的吸光度的變化來(lái)比較樣品催化H2O2分解的能力。使用去離子水將30%（質(zhì)量百分比）的H2O2稀釋為40 mmol/L，取180 μl 放入比色皿中，然后加入20 μl Cu SAN（濃度為500 mg/L）混合均勻，立刻在紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)的動(dòng)力學(xué)模式下檢測(cè)加入樣品后5 min 內(nèi)溶液的吸光度值變化。另外取180 μl 稀釋的H2O2溶液（30 mmol/L）與20 μl 濃度為500 mg/L 的樣品混合孵育，每20 min取反應(yīng)液放入比色皿中測(cè)定吸光度值。另一方面，使用溶氧儀（LD101 探頭，HACH HQ40d，US）測(cè)試納米酶催化H2O2分解生成O2的量來(lái)更加直觀地比較高/低負(fù)載Cu SAN 的類(lèi)CAT 活性。測(cè)試時(shí)，首先向盛有6 ml 去離子水的小燒杯中鼓入N2以排出溶液中的O2，待水溶液中O2的含量低至0.6 mg/L時(shí)，迅速向溶液中依次邊攪拌邊加入60 μl H2O2（10 mol/L）和90 μl 納米酶（濃度為2 g/L），對(duì)照組用90 μl 去離子水代替納米酶。使用溶氧儀每10 s記錄一次液體中O2的含量。同時(shí)為了更加直觀的觀察以及證明樣品的類(lèi)CAT活性，實(shí)驗(yàn)中取3個(gè)離心管均放入500 μl 濃度為2 mol/L 的H2O2，實(shí)驗(yàn)組的兩個(gè)離心管中分別加入20 μl 高/低負(fù)載Cu SAN（濃度為1 g/L），對(duì)照組用20 μl 去離子水代替SAN，將離心管靜置10 min，觀察氣泡產(chǎn)生的速度和密度并拍照記錄。定義過(guò)氧化氫酶的酶活力單位（unit）為在25℃、pH 為7.0 條件下，在1 min 內(nèi)催化分解1 μmol H2O2即為1 個(gè)酶活力單位（1 U）。計(jì)算SAN類(lèi)CAT活力值的公式為：CAT活力值/（U·μg-1）=消耗H2O2的微摩爾數(shù)/（反應(yīng)分鐘數(shù)×樣品質(zhì)量）。H2O2的摩爾消光系數(shù)為：ε240nm=39.4 L·mol-1·cm-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 高負(fù)載Cu SAN的表征分析

利用原子分辨的AC-STEM 觀察金屬摻雜比為0.03 mmol 時(shí)制備的高負(fù)載Cu SAN 中Cu 單原子的分布，如圖1a 中藍(lán)色圓圈所標(biāo)記，有許多單個(gè)亮點(diǎn)均勻分布，因?yàn)镃u原子的相對(duì)分子質(zhì)量高于C、N 和O 等，所以可以認(rèn)為圖中亮點(diǎn)為Cu 原子以單原子的形式分散在石墨烯基底材料上，并且原子分布密度高。通過(guò)XRD 譜表征了不同摻雜比下Cu SAN 的衍射峰（圖1b），在金屬摻雜量為0.02和0.03 mmol 時(shí)，圖譜中只顯示了石墨烯載體在25°和44°附近的特征峰，分別歸屬于石墨碳的（002） 晶面和（010） 晶面。當(dāng)摻雜量增加到0.05 mmol時(shí)，圖譜中開(kāi)始有Cu納米顆粒尖銳的晶體衍射峰出現(xiàn)［43］。通過(guò)ICP-MS 檢測(cè)了高/低負(fù)載Cu SAN 中Cu 元素的含量，結(jié)果表明0.03 mmol 摻雜時(shí)制備的高負(fù)載Cu SAN 中Cu 原子負(fù)載量為7.66%（質(zhì)量百分比），是低負(fù)載Cu SAN 的12 倍（圖1c）。利用XPS技術(shù)表征高負(fù)載Cu SAN的元素組成和結(jié)構(gòu)。圖1d~f展示了高負(fù)載Cu SAN的XPS圖譜，全譜的元素分析結(jié)果顯示Cu SAN中含有C、N、O 和Cu 元素。對(duì)N1s高分辨能譜圖進(jìn)行分峰擬合，發(fā)現(xiàn)材料中的氮主要由吡啶氮（398.5 eV）、吡咯氮（399.6 eV）和石墨烯氮（400.5 eV）組成［44］。而C1s的高分辨圖顯示C 主要以C=C 雙鍵（284.8 eV）、C―N 鍵（286.3 eV）和O―C=O 鍵（288.6 eV）的形式存在［45-46］。

Fig.1 Structural characterizations of Cu SAN

2.2 類(lèi)POD活性評(píng)估

基于以上結(jié)構(gòu)表征，本文對(duì)高/低負(fù)載Cu SAN進(jìn)行系統(tǒng)地催化性能評(píng)估。首先，以TMB 為顯色底物，檢測(cè)了Cu SAN 的類(lèi)POD 活性。TMB 在H2O2參與下可由POD 催化生成藍(lán)色的oxTMB 產(chǎn)物，此產(chǎn)物在652 nm處有特征吸收峰（圖2a）。圖2b顯示，隨著金屬前驅(qū)體摻雜量由0.01 mmol提升為0.05 mmol，Cu SAN 的類(lèi)酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)摻雜量為0.03 mmol 時(shí)溶液反應(yīng)60 min 吸光度值達(dá)到2.35（圖2c）。結(jié)合XRD結(jié)果，在摻雜量為0.05 mmol時(shí)制備的SAN 可能會(huì)形成金屬納米顆粒，因此繼續(xù)提高金屬前驅(qū)體的添加量不但沒(méi)有提高類(lèi)POD 催化活性，反而因?yàn)榻档土嗽永寐剩沟肧AN的整體活性呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)比研究了高（摻雜量為0.03 mmol）/低負(fù)載Cu SAN 的類(lèi)POD 活性的差異，如圖2d，e所示，在相同的質(zhì)量濃度和測(cè)試條件下，本文制備的高負(fù)載Cu SAN的催化活性和催化反應(yīng)速率相比于低負(fù)載SAN 顯著提升。根據(jù)天然HRP 的活性作標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)SAN 的活性進(jìn)行了定量分析，結(jié)果表明，高/低負(fù)載Cu SAN 的類(lèi)POD 活性分別約為0.134 U/mg和0.039 U/mg，高負(fù)載Cu SAN相比低負(fù)載SAN 提升了約3.4 倍（圖2f）。此外，本文進(jìn)一步研究了高/低負(fù)載Cu SAN 類(lèi)POD 活性的動(dòng)力學(xué)過(guò)程，通過(guò)分別測(cè)試不同H2O2或TMB濃度下SAN催化TMB生成藍(lán)色oxTMB產(chǎn)物的初始速度，通過(guò)擬合可以得到SAN對(duì)于兩種底物的Km及Vm。結(jié)果顯示高負(fù)載SAN 對(duì)于TMB 和H2O2的Km分別為0.211 mmol/L和18 mmol/L（圖S1），低于現(xiàn)有研究中多數(shù)納米酶［25-26，32，36，47-49］（具體參數(shù)比較見(jiàn)表S1），表明其對(duì)于底物具有良好的親和力。納米酶優(yōu)異的類(lèi)POD 活性可以使檢測(cè)傳感更加靈敏，如Wu 等［36］借助模板制備了一種高負(fù)載的Cu SAN（Cu-N-C），具有優(yōu)異的類(lèi)POD 活性，作者將其研究應(yīng)用于乙酰膽堿和有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)，取得了顯著的成效。文中終濃度為10 mg/L 的Cu-N-C 催化TMB顯色反應(yīng)，吸光度為0.9，比本研究中所能到達(dá)的吸光度低。Yan等［14］制備的一種Pt/CeO2SAN在終濃度為10 mg/L時(shí)催化TMB顯色反應(yīng)6 h吸光度達(dá)到1.6，而本研究中的高負(fù)載Cu單原子在相同濃度下僅1 h 時(shí)吸光度可達(dá)2.4，遠(yuǎn)高于Pt/CeO2。表明本文制備的SAN 類(lèi)POD 活性?xún)?yōu)異，具有應(yīng)用于檢測(cè)傳感的潛力。

Fig.2 POD-like activity of Cu SAN

2.3 類(lèi)SOD活性評(píng)估

SOD 是人體內(nèi)重要的抗氧化酶，可以將體內(nèi)病理狀態(tài)下產(chǎn)生的過(guò)量的超氧陰離子（O2·-）催化生成O2和H2O2，從而避免O2·-被催化生成次級(jí)自由基（ONOO-）對(duì)人體產(chǎn)生進(jìn)一步的傷害［50］。本文使用NBT 顯色法檢測(cè)了Cu SAN 的類(lèi)SOD 活性。NBT作為顯色底物，在光照和O2·-存在的條件下被還原成藍(lán)綠色的甲臜，而SOD 可以抑制甲臜的產(chǎn)生（圖3a）。基于該反應(yīng)原理，本文研究了不同摻雜量對(duì)Cu SAN的類(lèi)SOD活性的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著金屬前驅(qū)體投料量的提升，SAN 類(lèi)SOD活性逐漸增強(qiáng)，當(dāng)摻雜濃度為0.03 mmol時(shí)，抑制率高達(dá)87.4%（圖3b）。圖3c為反應(yīng)后溶液的紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)吸收譜，可以看出高負(fù)載的Cu SAN在560 nm處的吸光度明顯低于光照對(duì)照組（Con），并且低于低負(fù)載Cu SAN，表明高負(fù)載Cu SAN 具有更優(yōu)的類(lèi)SOD 活性，可以有效清除O2·-。當(dāng)反應(yīng)體系中抑制百分率為50%時(shí)，反應(yīng)體系中的SOD 酶活力單位定義為一個(gè)酶活力單位（unit，U）。圖3d對(duì)高/低負(fù)載Cu SAN的類(lèi)SOD活性進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明高負(fù)載Cu SAN的類(lèi)酶活性可以達(dá)到2.18 U/μg，而低負(fù)載Cu SAN的活性約為0.24 U/μg，高負(fù)載Cu SAN的酶活力值約是低負(fù)載Cu單原子的8.88倍。此外，研究了高/低負(fù)載的Cu SAN濃度依賴(lài)的類(lèi)SOD活性，結(jié)果顯示濃度為20 mg/L 時(shí)高負(fù)載Cu SAN 即顯示出78.6%的抑制率，而低負(fù)載Cu SAN 在濃度高達(dá)50 mg/L 時(shí)抑制率只達(dá)到了72.7%（圖3f）。該研究結(jié)果揭示了通過(guò)增加SAN中Cu原子的負(fù)載量可實(shí)現(xiàn)其類(lèi)SOD活性的增強(qiáng)。相同的濃度水平下，本研究制備的高負(fù)載Cu SAN的類(lèi)SOD活性高于現(xiàn)有研究中多數(shù)納米酶（圖3e）。如Ruan 等［51］制備的Pd/CeO2納米酶在濃度為80 mg/L時(shí)SOD抑制率僅為67%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于本文中的高負(fù)載Cu SAN。Huang等［52］制備的V2O5納米線在濃度為15 mg/L時(shí)約為70%，與本文達(dá)到了相似的水平。

Fig.3 SOD-like activity of Cu SAN

2.4 類(lèi)OXD活性評(píng)估

OXD 以O(shè)2作為電子受體催化底物氧化生成H2O 或H2O2。本文以TMB 作為顯色底物，檢測(cè)了制備的Cu SAN 的類(lèi)OXD 活性（圖4a）。根據(jù)圖4b，c 所示，當(dāng)摻雜比為0.03 mmol 時(shí)，高負(fù)載Cu SAN 的催化活性達(dá)到最高，反應(yīng)180 min 后oxTMB在652 nm處吸光度值可以達(dá)到0.31。但是，將高/低負(fù)載的Cu SAN在相同的質(zhì)量濃度下進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)高負(fù)載Cu SAN 催化TMB 生成的藍(lán)色產(chǎn)物的吸光度值在60 min 時(shí)為0.18，而低負(fù)載Cu SAN 催化反應(yīng)60 min 時(shí)吸光度值可達(dá)0.95，是高負(fù)載的5.28 倍（圖4d，f）。進(jìn)一步計(jì)算高/低負(fù)載的Cu SAN催化TMB氧化的反應(yīng)速率，結(jié)果顯示，當(dāng)濃度均為50 mg/L 時(shí)，低負(fù)載Cu SAN 的反應(yīng)速率為3.03 μmol/（L?min），而高負(fù)載的Cu SAN 的反應(yīng)速率僅為0.817 μmol/（L?min），低負(fù)載SAN的反應(yīng)速率是高負(fù)載的3.7 倍（圖4e）。這個(gè)結(jié)果體現(xiàn)了高負(fù)載Cu SAN的類(lèi)酶催化選擇性，在實(shí)際的檢測(cè)過(guò)程中，類(lèi)OXD 活性會(huì)提高反應(yīng)的基底，對(duì)于類(lèi)POD 活性的應(yīng)用是一種副反應(yīng)，因此制備只具有單活性的納米酶對(duì)于檢測(cè)是有益的。如Liang 等［55］研究制備了一種顏色呈白色的單活性GeO2納米酶，該納米酶只具有類(lèi)POD 活性，避免了類(lèi)OXD活性的影響。推測(cè)本文中高/低負(fù)載SAN呈現(xiàn)出不同類(lèi)酶活性選擇的結(jié)果可能與材料的結(jié)構(gòu)有關(guān)，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因需要進(jìn)一步的研究。

2.5 類(lèi)CAT活性評(píng)估

CAT 是以H2O2為底物的一種氧化還原酶，可以催化H2O2分解產(chǎn)生O2和H2O（圖5a），從而有效清除體內(nèi)產(chǎn)生的過(guò)量的H2O2。因此本研究也進(jìn)一步探索了制備的高負(fù)載Cu SAN的類(lèi)CAT活性。將H2O2和SAN均勻混合后，檢測(cè)H2O2在240 nm處的吸光度值隨時(shí)間的變化來(lái)定量對(duì)比高/低負(fù)載的Cu SAN對(duì)H2O2的分解能力。結(jié)果如圖5b所示，反應(yīng)120 min 后高/低負(fù)載Cu SAN 的反應(yīng)液在240 nm處的吸光度分別由1.047 降低至0.614 和0.506，表明低負(fù)載Cu SAN具有更強(qiáng)的分解H2O2能力。并且根據(jù)動(dòng)力學(xué)測(cè)試可以看出，低負(fù)載Cu 單原子的催化速率明顯較快（圖5c）。圖5d 對(duì)比了Cu SAN 對(duì)H2O2的清除率，發(fā)現(xiàn)在反應(yīng)1.5 h后低負(fù)載Cu SAN的清除率為57.6%，高負(fù)載為44.5%，這個(gè)結(jié)果也證明了在相同時(shí)間內(nèi)低負(fù)載Cu SAN 比高負(fù)載Cu SAN可以催化分解更多的H2O2。此外，根據(jù)酶活力的定義計(jì)算得到高負(fù)載Cu SAN的類(lèi)過(guò)氧化氫酶 活 力 值 為43.9 U/μg，而低負(fù)載Cu SAN 為60.5 U/μg，表明低負(fù)載Cu SAN 的催化活性約是高負(fù)載Cu SAN 的1.37 倍（圖5e）。研究中進(jìn)一步借助溶氧儀測(cè)定了高/低負(fù)載Cu SAN 加入H2O2溶液后催化產(chǎn)生的O2量來(lái)比較其活性差異，結(jié)果表明，在100 mmol/L 的H2O2中加入SAN 5 min 后，低負(fù)載Cu SAN 產(chǎn)生了3.67 μmol 的O2，高負(fù)載SAN 僅產(chǎn)生了1.87 μmol（圖5f）。通過(guò)觀察加入SAN 后，H2O2溶液中產(chǎn)生的氣泡數(shù)量也可以直觀地比較高/低負(fù)載Cu SAN 的類(lèi)CAT 活性，如圖5f 中插圖所示，SAN和H2O2混合10 min后，低負(fù)載Cu SAN產(chǎn)生了更多的氣泡，說(shuō)明催化更多的H2O2產(chǎn)生了O2。在一些顯色檢測(cè)的應(yīng)用中，如Lu 等［56］將制備的Fe-N-C SAN 應(yīng)用在比色檢測(cè)H2O2和谷胱甘肽，H2O2作為檢測(cè)目標(biāo)，材料的類(lèi)CAT 活性可能會(huì)對(duì)這種檢測(cè)產(chǎn)生干擾。因?yàn)榫哂休^強(qiáng)類(lèi)CAT 活性的納米酶會(huì)在類(lèi)POD催化過(guò)程中出現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)底物現(xiàn)象，從而使得計(jì)算出的底物親和力和反應(yīng)速率產(chǎn)生較大的偏差。在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，也會(huì)干擾反應(yīng)路徑以及降低檢測(cè)靈敏性。因此，本文中制備的高負(fù)載Cu SAN略差的CAT活性或許有助于其在更廣泛領(lǐng)域中的應(yīng)用。

Fig.5 CAT-like activity of Cu SAN

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，多種疾病的產(chǎn)生和發(fā)展與生物體中過(guò)量活性氧（ROS）有關(guān)，具有清除ROS 作用的納米酶被證明可以延緩相關(guān)疾病的進(jìn)程。Wu 等［57］制備了一種具有類(lèi)POD、SOD、CAT、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APOD）以及硫醇過(guò)氧化物（TPx）等多種類(lèi)酶活性的RuO2-PVP 納米酶，將其應(yīng)用在小鼠帕金森病模型中可以有效地提高酪氨酸羥化酶的表達(dá)以及抑制小膠質(zhì)細(xì)胞被激活從而減輕炎癥并防止神經(jīng)細(xì)胞變性。Moglianetti等［58］制備了具有類(lèi)POD、CAT、SOD活性的Pt納米酶，體外研究表明，該納米酶可以有效降低人腦海綿狀畸形疾病模型中病理細(xì)胞內(nèi)ROS 的總體水平。Yan等［14］將制備的具有類(lèi)POD、SOD、CAT、GPx等活性的Pt/CeO2應(yīng)用于創(chuàng)傷性腦損傷的治療，能夠有效減輕傷口處的炎癥水平，改善受損的神經(jīng)認(rèn)知能力。以上研究均表明，具有多種類(lèi)酶活性的納米酶在氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的治療中可以有效發(fā)揮作用。本研究中SAN具有優(yōu)異的類(lèi)POD和SOD活性選擇性，并且具有一定的類(lèi)CAT 活性和較弱的類(lèi)OXD 活性，總體上可以降低體系中的H2O2和O2·-等ROS。綜上所述，本研究制備的Cu SAN 可能會(huì)通過(guò)清除生物體內(nèi)病理狀態(tài)下產(chǎn)生的過(guò)量ROS，從而調(diào)節(jié)生物體的穩(wěn)態(tài)平衡，有望應(yīng)用于糖尿病、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、炎癥等一系列氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的治療。

3 結(jié) 論

本研究通過(guò)原位錨定策略制備了一種高負(fù)載Cu SAN，碳基載體中富含的N 原子使得更多的金屬Cu 原子被牢固錨定，Cu 原子負(fù)載量達(dá)到7.66%（質(zhì)量百分比）。實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)性評(píng)估了高/低負(fù)載Cu SAN 的多種類(lèi)酶活性（類(lèi)POD、類(lèi)SOD、類(lèi)OXD、類(lèi)CAT）的差異。以TMB和NBT為顯色底物，活性定量結(jié)果表明，高負(fù)載Cu SAN具有優(yōu)異的類(lèi)POD 和SOD 活性，分別是低負(fù)載Cu SAN 的3.4 倍和8.88 倍。動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果表明，本文制備的高負(fù)載Cu SAN 對(duì)底物TMB 和H2O2的Km分別為0.211 mmol/L 和18 mmol/L，低于現(xiàn)有研究中多數(shù)納米酶。此外，高負(fù)載Cu SAN表現(xiàn)出對(duì)類(lèi)POD和SOD 活性的催化選擇性。綜上，本文研究結(jié)果為制備高負(fù)載SAN 提供了思路，系統(tǒng)的活性研究增強(qiáng)了SAN實(shí)際應(yīng)用轉(zhuǎn)化的可能性和可信度。

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