景 偉 馬富強(qiáng)

（1）中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院（蘇州），生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部，合肥 230026；2）中國(guó)科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所，中國(guó)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，醫(yī)藥酶工程研究中心，蘇州 215163）

分子診斷技術(shù)在疾病診斷與治療中發(fā)揮著極為重要的作用，目前廣泛應(yīng)用在傳染病、性病、優(yōu)生優(yōu)育、司法鑒定、腫瘤、遺傳病等多個(gè)領(lǐng)域。2019年國(guó)內(nèi)分子診斷市場(chǎng)規(guī)模達(dá)132.1 億元，年復(fù)合增長(zhǎng)率達(dá)31.63%，是體外診斷領(lǐng)域種增速最快的細(xì)分領(lǐng)域。2020年初新型冠狀病毒感染（COVID-19）疫情的爆發(fā)更是極大地促進(jìn)了分子診斷技術(shù)的發(fā)展［1-4］。據(jù)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)統(tǒng)計(jì)，截至2022年4 月，中國(guó)已經(jīng)完成約115 億人次的嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）核酸檢測(cè)。目前中國(guó)擁有15.3萬(wàn)的專業(yè)技術(shù)人員從事核酸檢測(cè)技術(shù)工作，擁有1.3 萬(wàn)家醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)可以開展核酸檢測(cè)，全國(guó)二級(jí)以上醫(yī)院幾乎都配備核酸檢測(cè)能力，檢測(cè)能力達(dá)到5 700 萬(wàn)管/d，相比于2020 年3月COVID-19 疫情爆發(fā)初期（約126 萬(wàn)管/d）提高了將近50倍。COVID-19疫情極大促進(jìn)了分子診斷技術(shù)的發(fā)展和普及，也為分子診斷技術(shù)的發(fā)展帶來(lái)了契機(jī)［5-6］。

分子診斷技術(shù)包括核酸擴(kuò)增檢測(cè)、基因測(cè)序、基因芯片等［7-10］，其中核酸擴(kuò)增技術(shù)是目前應(yīng)用最廣泛的分子診斷技術(shù)［3］。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）是最廣泛使用的靶核酸檢測(cè)技術(shù)［11-12］，是多種疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，目前中國(guó)絕大多數(shù)SARSCoV-2 核酸檢測(cè)都是基于該技術(shù)平臺(tái)［13］。qPCR 的發(fā)展大致經(jīng)歷了6個(gè)階段（圖1）。1986年，美國(guó)學(xué)者M(jìn)ullis 等［14］開創(chuàng)了PCR 技術(shù)，并由美國(guó)Cetus公司開發(fā)，推出了第一臺(tái)PCR 自動(dòng)化熱循環(huán)儀，PCR 技術(shù)整個(gè)擴(kuò)增流程包括高溫變性、低溫退火、適溫延伸三個(gè)步驟［15］，反應(yīng)步驟簡(jiǎn)單，逐漸成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域中最常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法之一。1988年Saiki等［16］將分離出的耐熱型DNA聚合酶（Taq DNA 聚合酶）運(yùn)用于PCR 技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了PCR 過程自動(dòng)連續(xù)循環(huán)，Taq DNA 聚合酶的引入為PCR 的廣泛應(yīng)用帶來(lái)革命的突破。1993 年Higuchi 等［17］首次采用封閉式檢測(cè)方式和動(dòng)態(tài)PCR 的方法對(duì)目的核酸數(shù)量進(jìn)行定量分析，首次提出了qPCR技術(shù)的概念，qPCR利用熒光染料檢測(cè)每次PCR循環(huán)后產(chǎn)物總量，提高了反應(yīng)自動(dòng)化水平，實(shí)現(xiàn)了從定性到定量的飛躍。1995年美國(guó)Perkin Elmer（PE）公司開發(fā)出了TaqMan 熒光探針定量技術(shù)，熒光探針只與目的序列結(jié)合，不受非特異性產(chǎn)物的影響，特異性更高，且定量更準(zhǔn)確。Taqman 熒光探針定量技術(shù)將qPCR 帶入了更廣闊的應(yīng)用空間，是qPCR技 術(shù) 的 重 要 里 程 碑［18-19］。1996 年 美 國(guó)Applied Biosystems 公司推出全世界首臺(tái)熒光定量PCR 儀，從而正式使qPCR 技術(shù)應(yīng)用到市場(chǎng)［20］。1999 年，Bert Vogelstein 創(chuàng)造了“數(shù)字PCR”［21］，適用于依靠Ct值不能很好分辨的應(yīng)用領(lǐng)域，實(shí)現(xiàn)了對(duì)起始樣品的絕對(duì)定量。到目前為止qPCR仍是中國(guó)核酸檢測(cè)的主流技術(shù)和金標(biāo)準(zhǔn)，已具備良好的臨床基礎(chǔ)，是應(yīng)用最成熟、市場(chǎng)份額最大的分子診斷技術(shù)平臺(tái)［22］。

Fig.1 The development of PCR nucleic acid amplification technology圖1 PCR核酸擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展歷程

全球COVID-19疫情的爆發(fā)使原本在專業(yè)實(shí)驗(yàn)室開展的核酸檢測(cè)技術(shù)為大眾所認(rèn)知，核酸檢測(cè)是疫情防控的有效手段，可以盡早發(fā)現(xiàn)傳染源并從源頭上抑制疫情的傳播。隨著分子診斷的發(fā)展和推廣，對(duì)于家庭自測(cè)、社區(qū)即時(shí)核酸檢測(cè)的需求也逐漸凸顯，但目前進(jìn)行核酸檢測(cè)的主要方法仍是集中采樣后轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室處理，一般要6~48 h才能出檢測(cè)結(jié)果，無(wú)法實(shí)現(xiàn)即時(shí)、快速檢測(cè)。若要實(shí)現(xiàn)快速社區(qū)、居家檢測(cè)等分子即時(shí)檢測(cè)（point-of-care testing，POCT）應(yīng)用場(chǎng)景，必須滿足檢測(cè)時(shí)間快、設(shè)備成本低、操作簡(jiǎn)便等要求［23-26］。

為實(shí)現(xiàn)快速便捷分子POCT，人們圍繞檢測(cè)設(shè)備、檢測(cè)原料和試劑、技術(shù)原理等方面進(jìn)行了不斷改進(jìn)提升，例如在檢測(cè)設(shè)備上節(jié)省設(shè)定程序、對(duì)升降溫速度進(jìn)行改進(jìn)、優(yōu)化結(jié)果分析的時(shí)間等。伯樂的CFX-96 儀器能在55 min 內(nèi)完成40 循環(huán)的升降溫，相比于傳統(tǒng)熱循環(huán)儀的1.5 h大大加快了速度；另外，科學(xué)家們還從核心酶角度進(jìn)行了擴(kuò)增速度及耐熱性改進(jìn)，比如Kapa公司研制的2G Fast taq酶，該酶通過分子進(jìn)化顯著提升了持續(xù)合成能力和延伸速度，相比于野生型Taq DNA 聚合酶可以縮短20%~70%的反應(yīng)時(shí)間；在技術(shù)原理方面，開發(fā)了一系列速度快、操作便捷的等溫?cái)U(kuò)增方法，包括滾環(huán) 擴(kuò) 增 技 術(shù)（RCA）［27-28］、重 組 酶 等 溫 擴(kuò) 增（RPA）［29-30］、鏈代替擴(kuò)增（SDA）［31］、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)（LAMP）等［32-34］，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)具有無(wú)需昂貴PCR 儀器、速度快（10~60 min 完成反應(yīng)）等優(yōu)勢(shì)，成為分子POCT領(lǐng)域的重要技術(shù)，但是相比于傳統(tǒng)qPCR技術(shù)，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)普遍存在不容易進(jìn)行多重靶標(biāo)檢測(cè)、假陽(yáng)性嚴(yán)重、靈敏度不高等缺點(diǎn)［35］，因此開發(fā)速度快、且多重檢測(cè)和靈敏度等關(guān)鍵性能等指標(biāo)能夠媲美傳統(tǒng)qPCR的快速核酸檢測(cè)技術(shù)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

超快脈沖控制PCR（ultra-fast pulse-controlled PCR，upPCR）是近年來(lái)開發(fā)出來(lái)的分子診斷新技術(shù)，是傳統(tǒng)qPCR技術(shù)的延伸和升級(jí)，該技術(shù)在保留傳統(tǒng)熒光定量PCR 高靈敏度、高特異性和多重檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)的基礎(chǔ)上，還具有超快速、設(shè)備簡(jiǎn)單、能耗低等新優(yōu)勢(shì)，非常適合分子POCT。自從21世紀(jì)初被發(fā)明以來(lái)，upPCR 技術(shù)經(jīng)過一系列迭代升級(jí)，在加熱源、光熱納米粒子、升降溫方式上都經(jīng)歷了一系列發(fā)展和完善。2008 年Stehr 等［36］使用DNA 結(jié)合的金納米棒聚集體作為光吸收劑，將300 ns激光脈沖的光能局部轉(zhuǎn)換為熱能，在微秒時(shí)間尺度上熔化雙鏈DNA，奠定了納米金作為upPCR 的核心加熱材料的地位。2012 年，Roche等［37］使用金納米球作為光熱納米材料，結(jié)合相關(guān)配套設(shè)備的開發(fā)，首次建立了upPCR 技術(shù)。2017年GNA Biosolutions GmbH 公司［38］開發(fā)出商業(yè)化的upPCR產(chǎn)品，設(shè)備到目前為止已經(jīng)過多代更新，形成較為成熟的產(chǎn)品體系。此外還有ROVER diagnostics公司也推出LightSpeed系統(tǒng)［39］，該技術(shù)展示出廣闊的應(yīng)用前景。

upPCR 通過向反應(yīng)體系中引入能夠快速進(jìn)行光熱/電熱轉(zhuǎn)換的納米材料（例如納米金），從而大幅度提升了反應(yīng)體系的溫度變化速度，例如，通過脈沖控制激光或LED 燈加熱溶液中的納米材料，能夠在毫秒時(shí)間實(shí)現(xiàn)溶液微環(huán)境的快速升溫，停止加熱后通過環(huán)境溶液對(duì)微環(huán)境進(jìn)行快速降溫，該方法的升降溫速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)熱循環(huán)儀的加熱模塊的升降溫度速度，因此可以在15 min 以內(nèi)完成整個(gè)檢測(cè)反應(yīng)。以GNA Biosolutions 公司開發(fā)的upPCR 技術(shù)為例（圖2），將含有模板DNA 的溶液加入到upPCR 混合溶液，PCR 混合溶液中的金納米粒子被目標(biāo)特異性引物功能化，反應(yīng)體系在脈沖控制擴(kuò)增儀中，當(dāng)高功率的激光束通過快速脈沖對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行照射時(shí)，由于激光波長(zhǎng)和金納米粒子的等離子體吸收特性相匹配，膠體金納米粒子的激光照射能夠?qū)鶆蚍稚⒌募{米粒子進(jìn)行微秒級(jí)超快速局部加熱，使納米粒子周圍溶液溫度迅速上升，導(dǎo)致DNA 雙鏈變性解鏈，當(dāng)停止激光照射時(shí)，反應(yīng)的主體溶液可作為內(nèi)置冷卻容器對(duì)反應(yīng)微環(huán)境進(jìn)行迅速冷卻，單鏈模板DNA 與金納米顆粒上的特異性引物退火，在DNA 聚合酶的作用下延伸，生成新的DNA 雙鏈。經(jīng)過多次循環(huán)，最終實(shí)現(xiàn)模板DNA 的大量擴(kuò)增和檢測(cè)。在該技術(shù)體系中，由于激光以短脈沖（微秒級(jí)）加熱納米粒子（皮摩爾濃度），并將熱循環(huán)限制在以納米粒子為核心的反應(yīng)微環(huán)境中，因而只對(duì)小部分反應(yīng)體積進(jìn)行升降溫，主體反應(yīng)溫度基本不變，從而可實(shí)現(xiàn)超快的加熱和冷卻循環(huán)［38］。upPCR技術(shù)的單個(gè)變性-擴(kuò)增循環(huán)僅需1.5~5 s，遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)PCR 所需的時(shí)間（約90 s/循環(huán)），從而能夠在15 min以內(nèi)完成擴(kuò)增檢測(cè)。

Fig.2 Principle of ultrafast pulse-controlled PCR amplification圖2 超快脈沖控制PCR擴(kuò)增原理

upPCR技術(shù)開發(fā)的設(shè)備重量輕，能耗低，可由電池供電，便攜且易于使用，靈敏度與傳統(tǒng)qPCR相當(dāng)，同樣支持多重靶標(biāo)檢測(cè)，可以在很短的時(shí)間內(nèi)提供具有高靈敏度和特異性的結(jié)果?；诖耍瑄pPCR 可以在實(shí)驗(yàn)室外快速檢測(cè)傳染原［40］，在家庭自檢和社區(qū)快檢等分子POCT場(chǎng)景中具有重大應(yīng)用潛力。本文介紹了upPCR 技術(shù)的最新進(jìn)展，對(duì)近年來(lái)upPCR 技術(shù)的原理、核心原料、儀器設(shè)備的發(fā)展情況進(jìn)行綜述，并討論了該技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)和應(yīng)用前景。

1 upPCR技術(shù)的發(fā)展

與普通qPCR 相比，upPCR 技術(shù)通過引入納米金輔助加熱。金納米粒子在PCR 中的應(yīng)用研究可追溯至2005 年，上海交通大學(xué)與中國(guó)科學(xué)院應(yīng)用物理所［41-42］首次報(bào)道了金納米粒子對(duì)于PCR 體系的提升作用，該方法通過引入金納米粒子從而有效抑制了PCR 中的非特異性反應(yīng)，顯著提升了PCR技術(shù)的性能。同年，Li 等［43］通過將0.7 nmol/L 的13 nm 金納米粒子添加到PCR 試劑中并與不同的PCR 系統(tǒng)比較，結(jié)果顯示金納米粒子可用于提高PCR 效率和縮短反應(yīng)時(shí)間。2012 年，Roche 等［37］將金納米球作為光熱納米材料引入PCR 體系，結(jié)合相關(guān)配套設(shè)備的開發(fā)，將商業(yè)熱循環(huán)器中使用的微升體積減少到納升或皮升體積，首次建立了upPCR 技 術(shù)。2017 年GNA Biosolutions GmbH 公司［38］將金納米顆粒與引物偶聯(lián)，通過高功率激光束快速脈沖選擇性和特異性地照射金納米顆粒，從而實(shí)現(xiàn)反應(yīng)微環(huán)境局部加熱，和環(huán)境溶液快速降溫，開發(fā)出了商業(yè)化的脈沖控制PCR產(chǎn)品。

納米金的光熱效應(yīng)主要依靠其對(duì)不同特定波長(zhǎng)的光的強(qiáng)烈吸收，通過非輻射弛豫途徑將光能轉(zhuǎn)化為熱能。金納米粒子對(duì)激光脈沖能量的吸收分為三個(gè)步驟：電子吸收、電子-聲子熱化、外部熱擴(kuò)散［44-46］。原理如圖3所示：激光照射時(shí)，在共振波長(zhǎng)的激發(fā)下，在粒子表面形成的極化電荷導(dǎo)致振蕩偶極子，表現(xiàn)出增強(qiáng)的吸收和散射截面。共振相對(duì)于波長(zhǎng)的位置由顆粒的大小和幾何形狀決定。振蕩偶極子的共振能量通過歐姆加熱損失分散到周圍介質(zhì)。釋放的能量可用于快速加熱溶液，其中每個(gè)顆粒成為加熱元件。停止激光照射后，具有高導(dǎo)熱性的金納米顆?？梢越柚車芤嚎焖倮鋮s。通過打開或關(guān)閉激發(fā)光，可以實(shí)現(xiàn)在金納米顆粒表面上快速加熱和冷卻。因此，使用該方法可以在幾分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)具有高加熱和冷卻速率的超快PCR。應(yīng)用納米材料的光熱效應(yīng)優(yōu)點(diǎn)是可以很容易地控制溶液的加熱和冷卻，進(jìn)而控制溶液中DNA 的變性和擴(kuò)增［37］。

Fig.3 Schematic diagram of photothermal effects of gold nanoparticles圖3 金納米粒子光熱效應(yīng)原理圖

金納米粒子可以使用各種技術(shù)靈活合成，得到所需的形狀和大小［47-51］，其中金納米球、金納米棒和金雙錐體等是upPCR 中常用形狀［52-53］，相較于其他貴金屬，金納米粒子有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)［44，54-56］，包括：a.金納米粒子具有較高的表面等離子體吸收和高光散射能力，在短時(shí)間內(nèi)可迅速升溫，使其在upPCR 技術(shù)中得到廣泛應(yīng)用［57-60］；b.金納米粒子可通過調(diào)整金尺寸和形狀，導(dǎo)致其從可見光調(diào)諧到近紅外光（NIR）的共振，由于組織在NIR范圍內(nèi)的吸收性較低，因此它非常適合生物學(xué)應(yīng)用；c.金納米粒子表面可以簡(jiǎn)單地進(jìn)行修飾，允許用各種化合物對(duì)金納米粒子進(jìn)行功能化，例如DNA、抗體、蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)等；d.金納米粒子的氧化作用很弱，生物相容性高，無(wú)細(xì)胞毒性，兼容多種生化、分子和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

不同形狀的金納米粒子具有不同的光學(xué)性能。a.金納米薄膜可快速吸光強(qiáng)光，使其表面電子激發(fā)到更高的能量狀態(tài)并產(chǎn)生熱電子，從而對(duì)PCR 溶液進(jìn)行加熱。b.金納米球比表面積高，負(fù)載量高，易于表面功能化，在upPCR 中可通過與特異性引物偶聯(lián)實(shí)現(xiàn)溶液局部加熱，并通過主體溶液實(shí)現(xiàn)冷卻。c.金納米棒比金納米球具有更為獨(dú)特的光電性質(zhì)，在近紅外區(qū)對(duì)光的吸收和散射能力都很強(qiáng)，可快速吸收光源實(shí)現(xiàn)加熱，另外金納米棒還具有合成方法簡(jiǎn)單、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。d.金雙錐體具有更高的吸光度系數(shù)，尺寸分布更均勻，這使得它們更有效地吸收入射光，此外，金雙錐體具有更高的光熱轉(zhuǎn)換效率，可以進(jìn)一步提高入射光的利用率。近年來(lái)，科學(xué)家們將不同形狀的金納米粒子應(yīng)用于PCR 反應(yīng)體系中，結(jié)合引物偶聯(lián)、光加熱、脈沖控制等輔助手段，形成了具有不同性能的upPCR體系，下文將對(duì)這些體系進(jìn)行了歸納和討論。

第一，樹立和堅(jiān)持正確的歷史觀，堅(jiān)持歷史唯物主義，反對(duì)歷史虛無(wú)主義。要尊重歷史，明確“中國(guó)的今天是從中國(guó)的昨天和前天發(fā)展而來(lái)的”[注]習(xí)近平：《牢記歷史經(jīng)驗(yàn)歷史教訓(xùn)歷史警示 為國(guó)家治理能力現(xiàn)代化提供有益借鑒》，《人民日?qǐng)?bào)》2014年10月14日，第1版。。近年來(lái),歷史虛無(wú)主義沉渣泛起。歷史虛無(wú)主義否定中華民族的歷史貢獻(xiàn)，扭曲中國(guó)共產(chǎn)黨帶領(lǐng)中國(guó)人民進(jìn)行革命、改革、建設(shè)的歷史，消解中華民族的民族凝聚力，動(dòng)搖中國(guó)人民的愛國(guó)主義信念，為害甚大，不容輕忽。為此，必須要引導(dǎo)人們樹立和堅(jiān)持正確的歷史觀。深入挖掘歷史上的愛國(guó)主義精神，傳承中華民族愛國(guó)主義優(yōu)良傳統(tǒng)。

1.1 基于金納米膜的upPCR技術(shù)

2015 年，Son 等［61］開發(fā)了一種基于金納米膜的upPCR 技術(shù)，基于金納米膜作為光熱轉(zhuǎn)換器的光子PCR 使用LED 作為激發(fā)光。當(dāng)LED 照射金納米膜時(shí)，金納米膜會(huì)發(fā)生對(duì)等離子體輔助的強(qiáng)光吸收，導(dǎo)致等離子體表面附近的電子激發(fā)到更高的能量狀態(tài)，在100 fs內(nèi)產(chǎn)生熱電子。熱電子可以迅速擴(kuò)散到整個(gè)金屬薄膜，從而形成平衡且均勻的溫度場(chǎng)。當(dāng)關(guān)閉LED 燈后，加熱后的溶液可通過散熱風(fēng)扇和高導(dǎo)熱率的金薄膜散熱，從而實(shí)現(xiàn)快速熱循環(huán)。反應(yīng)加熱速率約為12.8℃/s，冷卻速率為6.6℃/s，可在5 min內(nèi)完成30個(gè)超快熱循環(huán)。但單層金納米薄膜層技術(shù)的熱擴(kuò)散引起的PCR 溶液溫度均勻性差，導(dǎo)致擴(kuò)散效率相對(duì)較低，2016年Son等［62］通過引入兩個(gè)平行的金納米膜形成3D PCR室，解決了僅一側(cè)加熱導(dǎo)致溶液溫度均勻性差及用于溫度控制的熱電偶的可靠定位問題。改進(jìn)后技術(shù)的原理為：LED 的光首先被反射、吸收并傳輸?shù)降撞拷鸺{米薄膜，被底層吸收產(chǎn)生熱量，隨后透射光被反射、吸收并透射到頂部的金納米薄膜，反射光經(jīng)多次反射、吸收和透射并產(chǎn)生熱量。相對(duì)于單層金納米薄膜層技術(shù)，雙層金納米薄膜層溫度變化相對(duì)較慢，但精度和穩(wěn)定性顯著提高，靈敏度和可重復(fù)性也顯著提升，可以實(shí)現(xiàn)10 min內(nèi)完成反應(yīng)。

1.2 基于金納米雙錐體的upPCR技術(shù)

2017 年，Lee 等［63］通過使用具有更高光吸收系數(shù)的金雙錐體實(shí)現(xiàn)了超快熱循環(huán)。將金雙錐體納米粒子均勻分散在PCR 反應(yīng)混合物中，溶液的加熱與冷卻可通過脈沖紅外LED（IR-LED）實(shí)現(xiàn)，當(dāng)紅外發(fā)光二極管照射時(shí)，金雙錐體作為納米反應(yīng)器可以吸收光子能并將其轉(zhuǎn)化為熱能，金雙錐體吸收光子后，除散熱外沒有明顯的能量損失途徑。在熱擴(kuò)散的作用下迅速提高整體溶液的溫度，實(shí)現(xiàn)DNA 雙鏈的變性。該方法使用的金納米雙錐體允許特定的光激發(fā)和熱釋放，并確保精確均勻的加熱，可以在7.5 min內(nèi)可以完成40個(gè)循環(huán)，實(shí)現(xiàn)更快的熱循環(huán)，加熱過程只是對(duì)占比很少的微環(huán)境進(jìn)行加熱，但該體系中引物和模板是隨機(jī)分布在反應(yīng)體系，大部分的模板并沒有被加熱，存在靶向性加熱不強(qiáng)的問題，理論擴(kuò)增效率低，如果將納米金與引物偶聯(lián)則有望大幅度提升加熱和反應(yīng)效率。

1.3 基于鍍金鎢絲的upPCR技術(shù)

GNA Biosolutions 公司使用成本更低的鍍金鎢絲（直徑15 μm，Au 涂層200 nm）替代納米金顆粒，開發(fā)了一種更為經(jīng)濟(jì)的upPCR 方法［40，64］。該體系采用電流而非光能對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行加熱——通過將快速脈沖電壓施加到75 根鍍金鎢絲陣列，僅在每根導(dǎo)線周圍的微米級(jí)液體層內(nèi)引起超快速加熱，實(shí)現(xiàn)溶液局部加熱。而剩余的大部分反應(yīng)體積（超過99%）則保持在用于退火和延伸的基礎(chǔ)溫度。由于局部加熱的方法僅在導(dǎo)線周圍的加熱層內(nèi)使雙鏈DNA 變性，該技術(shù)對(duì)引物進(jìn)行了局部加熱，以提高加熱和反應(yīng)效率。該技術(shù)通過Au-S 鍵將引物固定到鍍金鎢絲，使其中引物5'端連接到鍍金鎢絲的表面，3'端在溶液中保持游離，以便于擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增反應(yīng)的雙鏈DNA 變性步驟只需要熱循環(huán)總反應(yīng)體積通常所需的能量的一小部分即可。局部加熱使得大部分反應(yīng)溶液體積可用作鍍金鎢絲被動(dòng)冷卻過程的冷卻容器，在電壓脈沖后鍍金鎢絲通過熱擴(kuò)散在毫秒時(shí)間尺度上冷卻下來(lái)，從而產(chǎn)生超快的熱循環(huán)。由于直接將引物偶聯(lián)在納米金載體上流程復(fù)雜，工藝要求高等，GNA Biosolutions 公司通過磁珠與引物結(jié)合替代電阻絲直接固定的方式，將引物懸浮在鍍金鎢絲兩側(cè)從而進(jìn)行局部脈沖加熱，實(shí)現(xiàn)熱循環(huán)。磁珠在偶聯(lián)上具有更高的比表面積和操作更加方便、快捷的優(yōu)點(diǎn)，該方法每個(gè)循環(huán)的周期為1.5~5 s，可在14 min內(nèi)完成擴(kuò)增。

1.4 基于金納米棒的upPCR技術(shù)

2022 年，ROVER diagnostics 公司推出了一種基于金納米棒的可多路熒光監(jiān)測(cè)的LightSpeed 系統(tǒng)［39］。金納米棒對(duì)近紅外區(qū)對(duì)光的吸收和散射能力都很強(qiáng)，可快速實(shí)現(xiàn)溶液整體加熱。該系統(tǒng)將金納米棒懸浮在0.2 ml PCR 管中的溶液中，將3 個(gè)LED 模塊同心放置在PCR 管周圍并連接到散熱器和散熱器風(fēng)扇上，通過帶有線熱電偶的閉環(huán)傳感或通過非接觸式開環(huán)控制來(lái)實(shí)現(xiàn)溫度控制。加熱時(shí)金納米棒快速吸收LED 發(fā)出的光，由于紅外輻射與金納米棒的電子相互作用產(chǎn)生熱量，對(duì)溶液整體進(jìn)行加熱，DNA 雙鏈在高溫下變性成為單鏈。停止加熱后使用風(fēng)扇對(duì)溶液輔助冷卻，目的片段進(jìn)行退火延伸，從而實(shí)現(xiàn)快速循環(huán)擴(kuò)增。該裝置在初始溫度保持2 min（用于逆轉(zhuǎn)錄），變性時(shí)間為10 s，可在15 min 內(nèi)完成45 個(gè)快速熱循環(huán)周期，每周期加熱時(shí)間為6.7℃/s，降溫速度為4.7℃/s。每次退火延伸結(jié)束時(shí)可通過488 nm 激光和光譜儀設(shè)置進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)從樣品到結(jié)果檢出可在30 min 內(nèi)完成。

隨著upPCR 技術(shù)的發(fā)展，upPCR 形成了不同的性能體系（表1）。在對(duì)PCR溶液加熱范圍方面，可通過將納米金與引物偶聯(lián)的方式實(shí)現(xiàn)溶液的局部加熱，溶液整體溫度不變；也可將納米金直接加入到溶液內(nèi)對(duì)溶液進(jìn)行整體加熱。局部加熱靶向性強(qiáng)，升降溫速度快，但引物偶聯(lián)到納米金的技術(shù)復(fù)雜，成本較高；而整體加熱無(wú)需額外的引物偶聯(lián)，但需要較長(zhǎng)的升降溫時(shí)間。在PCR 溶液的加熱方式上，可分為光加熱與電加熱，電加熱成本更低，可控性更強(qiáng)，但需要將電阻絲和反應(yīng)芯片整合，反應(yīng)容器制備工藝較復(fù)雜，光加熱相比于電加熱，光源高頻通斷控制相比電流控制技術(shù)難度稍高，但非接觸加熱方法降低了芯片制造的復(fù)雜性，因而適用性高，目前應(yīng)用更廣。

Table 1 Comparison of ultra-fast pulse-controlled PCR experimental technology based on different thermal cycling modes表1 基于不同熱循環(huán)方式的超快脈沖控制PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)對(duì)比

2 upPCR技術(shù)的核心原料

2.1 引物及功能化

upPCR 技術(shù)兼容熒光染料法的qPCR 體系，也兼容多重Taqman 探針，在整體加熱的upPCR 中，可直接兼容常規(guī)qPCR引物，引物無(wú)需功能化，而在局部加熱的upPCR 技術(shù)中，需要將引物與納米金特異性偶聯(lián)，使加熱溫度局限在納米金表面，從而實(shí)現(xiàn)反應(yīng)的局部化。由于納米金合成方式不同，導(dǎo)致其表面化學(xué)性質(zhì)不同，進(jìn)行引物功能化的方式也不同。

金納米球易于表面修飾并且能與檸檬酸鹽離子直接置換，它們可以通過直接吸附未修飾的寡核苷酸或接枝硫醇末端寡核苷酸實(shí)現(xiàn)引物功能化［65］。相比之下，金納米棒由于其表面生長(zhǎng)所必需的十六烷基三甲基溴化銨雙層，與DNA 的功能化更具有挑戰(zhàn)性［66］。金納米棒功能化主要分三步：第一步用巰基-聚二乙醇-甲氧基（HS-PEG-OMe）部分置換十六烷基三甲基溴化銨分子并轉(zhuǎn)移到有機(jī)介質(zhì)中；第二步用6-巰基己酸對(duì)金納米棒的表面進(jìn)行改性，通過添加異丙醇使末端羧酸基團(tuán)電離，并在緩沖介質(zhì)中再分散；第三步通過電荷篩選進(jìn)行DNA功能化，洗滌3次后在緩沖液中再分散。對(duì)于使用鍍金鎢絲的upPCR 技術(shù)而言，如果在鍍金鎢絲上直接偶聯(lián)引物，需要用硫醇修飾的正向引物對(duì)鍍金鎢絲進(jìn)行功能化，使用多聚A 尾（poly-A-tail）和亞磷酰胺（Int Spacer 9）將硫醇修飾添加到引物的5'端，通過強(qiáng)Au-S 鍵將引物固定到鍍金鎢絲實(shí)現(xiàn)引物功能化。磁珠與寡核苷酸的偶聯(lián)有以下幾種方法［67-68］：a.共價(jià)固定法，典型的共價(jià)化學(xué)連接鍵包括形成酰胺鍵、酯鍵或者二硫鍵，通過5'-反應(yīng)基團(tuán)-（如5'-氨基-）固定；b.離子或偶極作用，通過離子或偶極相互作用將帶負(fù)電荷的磷酸主鏈與部分帶正電荷的表面作用，并通過紫外線照射進(jìn)行交聯(lián)；c.親和作用，利用親和配體相互作用，例如生物素化核酸在親和素表面的偶聯(lián)。

2.2 核心酶

upPCR 技術(shù)可以將PCR 運(yùn)行時(shí)間從幾小時(shí)縮短到幾分鐘，因而對(duì)酶的模板親和力、催化速度等關(guān)鍵性能提出了更高要求。PCR 過程的速度取決于許多因素［45，69］，包括所用聚合酶的延伸率、熱循環(huán)器的升降溫速度和DNA 模板的復(fù)雜性等。選擇合適的DNA 聚合酶對(duì)PCR實(shí)驗(yàn)尤為重要，是開展實(shí)驗(yàn)前首要考慮的問題。DNA 聚合酶是影響反應(yīng)速度的重要因素，PCR 體系中最常用的DNA 聚合酶是Taq DNA 聚合酶，Taq DNA 聚合酶具有較好的耐熱性，可在PCR高溫變性過程中保持活性，在整個(gè)PCR 循環(huán)中無(wú)需多次補(bǔ)加酶［70-72］。但用于常規(guī)PCR 的Taq DNA 聚合酶延伸速度較慢，Taq DNA 聚合酶的標(biāo)準(zhǔn)延伸率約為1 kb/min［73］，而upPCR 技術(shù)通常需要具有更快的延伸速率的熱穩(wěn)定聚合酶。例如快速Taq DNA 聚合酶，快速Taq DNA 聚合酶在擴(kuò)增速度、擴(kuò)增效率、特異性以及酶本身的穩(wěn)定性都顯著優(yōu)于普通Taq酶，在大幅度縮短反應(yīng)時(shí)間的同時(shí)能提高擴(kuò)增效果?？茖W(xué)家們對(duì)Taq DNA 聚合酶進(jìn)行了一系列提升反應(yīng)速度的酶工程改造，Davidson等［74］通過在Taq DNA聚合酶拇指結(jié)構(gòu)與上插入硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域，將DNA 聚合酶速度提升了20~50倍。Wang等［75］將Taq DNA聚合酶和非序列特異性的dsDNA 結(jié)合蛋白Sso7d融合，增強(qiáng)酶和DNA模板結(jié)合，將DNA聚合酶速度提升了16 倍。這些快速突變體及其組合有望用于upPCR體系。

當(dāng)檢測(cè)靶標(biāo)是RNA 時(shí)，需要通過逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為DNA 才能進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。目前已發(fā)現(xiàn)的逆轉(zhuǎn)錄酶大多不能耐受高溫環(huán)境，在PCR 過程中難以保持活性。例從如從克隆有莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶基因的大腸桿菌中分離到的莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）逆轉(zhuǎn)錄酶和從禽類成骨髓細(xì)胞白血病病毒純化到的禽類成髓細(xì)胞病毒（AMV）逆轉(zhuǎn)錄酶等。用于PCR 的逆轉(zhuǎn)錄酶需要高度耐熱性，科學(xué)家利用蛋白質(zhì)工程的方法對(duì)MMLV 進(jìn)行了一系列改造，大幅度提升了穩(wěn)定性，耐熱溫度提高到60℃以上，并實(shí)現(xiàn)了商品化，如賽默飛公司的SuperScript系列等，在提升熱穩(wěn)定性的同時(shí)也提升了逆轉(zhuǎn)錄活性和產(chǎn)量。另外從自然界中發(fā)現(xiàn)超級(jí)耐熱的逆轉(zhuǎn)錄酶也在開展，例如Moser 等［76］從病毒宏基因組庫(kù)中分離出一種基于熱穩(wěn)定3173 Pol的先天逆轉(zhuǎn)錄酶活性的獨(dú)特單酶替代品，該酶具有高熱穩(wěn)定性、高靈敏度和特異性。上述這些新酶資源有望運(yùn)用到upPCR中。

除此之外，upPCR 體系還包括其他核心酶，例如RNase 抑制劑、尿嘧啶DNA 糖基酶（UDG）等。RNase 抑制劑可以減少和控制RNase 的污染，提高轉(zhuǎn)錄及翻譯的效率，確保RNA 分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。常用的RNase 抑制劑有焦碳酸二乙酯（DEPC）、氧釩核糖核苷復(fù)合物（RVC）、異硫氰酸胍和RNA 酶的蛋白質(zhì)抑制劑（RNasin）等。尿嘧啶DNA 糖基酶（UDG）可與脫氧尿苷三磷酸（dUTP）搭配使用，建立PCR 防污染體系，避免氣溶膠污染，提升擴(kuò)增結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3 upPCR設(shè)備體系開發(fā)

upPCR 技術(shù)需要配備特殊的配套設(shè)施，近年來(lái)陸續(xù)有幾家國(guó)外公司開發(fā)出upPCR 設(shè)備，例如GNA Biosolutions 公司開發(fā)的一系列脈沖控制設(shè)備，Pharos V8、Pharos Micro、GNA Octea 等，Curiosity Diagnostics 公司開發(fā)的PCR One 設(shè)備及ROVER diagnostics公司開發(fā)的LightSpeed設(shè)備等。

GNA Biosolutions 公司基于upPCR 技術(shù)開發(fā)了一系列的設(shè)備產(chǎn)品（圖4a），第一臺(tái)設(shè)備Pharos 400世界上第一臺(tái)upPCR儀器，可快速安全的制備樣品，超快分析DNA，但由于技術(shù)成本等問題并未商業(yè)化供應(yīng)。Pharos V8 是世界上第一臺(tái)商業(yè)化的的upPCR 儀器，Pharos V8 通過利用納米金將溫度循環(huán)控制在納米尺度上，實(shí)現(xiàn)溶液局部加熱，可在10 min或更短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行超快實(shí)時(shí)核酸檢測(cè)，將PCR 反應(yīng)時(shí)間加快了10 倍，同時(shí)儀器具有直觀的操作界面和易于使用的軟件，并可以遠(yuǎn)程訪問。但目前該平臺(tái)無(wú)法進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，只能用于半定量的檢測(cè)。Pharos Micro 是一臺(tái)可實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)的脈沖PCR 設(shè)備。兩個(gè)常規(guī)加熱塊在芯片底部和頂部設(shè)置為恒溫，通過USB 連接到儀器的平板電腦上使用專用軟件進(jìn)行操作，可以將反應(yīng)體積保持在65℃的恒溫以進(jìn)行引物的退火和延伸。該設(shè)備可以連接到固定實(shí)驗(yàn)室中的電源也可以由電池供電以供現(xiàn)場(chǎng)使用。GNA Octea是第一臺(tái)使用薄箔電加熱完成的脈沖擴(kuò)增PCR儀。GNA Octea通過將磁珠結(jié)合的樣品懸浮在反應(yīng)容器的兩側(cè)，從而實(shí)現(xiàn)局部溫度脈沖進(jìn)行快速熱循環(huán)?？梢栽?0 min內(nèi)分析8個(gè)樣本，包括咽拭子和測(cè)試準(zhǔn)備的總時(shí)間約為40 min，靈敏度為96.7%，特異度為100%，體積小、重量輕、可移動(dòng)，可以快速、方便地安裝和使用。GNA Helios 是一個(gè)自動(dòng)化的樣本-結(jié)果分子測(cè)試系統(tǒng)，目前還未上市，GNA Helios 主要由分析儀和一次性集成測(cè)試盒組成。該系統(tǒng)可同時(shí)檢測(cè)9~12種目標(biāo)病原體，并可在15~30 min 內(nèi)提供結(jié)果。GNA Nano是一種小型化的分子診斷系統(tǒng)，目前正處于研發(fā)狀態(tài)，該系統(tǒng)可用于一次測(cè)試一個(gè)患者樣本，或并行地添加一個(gè)基站，可以在10~20 min內(nèi)提供結(jié)果。

Fig.4 Development of equipment for ultra-fast pulse-controlled PCR technology圖4 超快脈沖控制PCR技術(shù)的設(shè)備開發(fā)

Curiosity Diagnostics公司基于upPCR技術(shù)開發(fā)了PCR One系統(tǒng)（圖4b），PCR One通過采用IR加熱擴(kuò)增技術(shù)，最快可在7 min 內(nèi)完成40 個(gè)熱循環(huán)。該系統(tǒng)可以在15 min 完成從樣本到結(jié)果的檢測(cè)，PCR One 的微流體在單獨(dú)的微孔中進(jìn)行每個(gè)PCR，并可以對(duì)來(lái)自患者的原始樣本進(jìn)行多達(dá)20 個(gè)目標(biāo)的多重檢測(cè)，每個(gè)靶標(biāo)可進(jìn)行3 孔重復(fù)。PCR One系統(tǒng)可做到樣品進(jìn)，結(jié)果出，適用于快速檢測(cè)。

哥倫比亞大學(xué)Sia 教授和他的團(tuán)隊(duì)［39］開發(fā)了一種LightSpeed 儀器用于檢測(cè)新型冠狀病毒感染（COVID-19）（圖4c），該設(shè)備使用金納米棒粒子將光轉(zhuǎn)化為熱，通過冷卻風(fēng)扇實(shí)現(xiàn)熱循環(huán)。LightSpeed 儀器主要由3 個(gè)850 nm IR-LED 模塊、冷卻風(fēng)扇以及1個(gè)用于熒光檢測(cè)的488 nm激光和分光光度計(jì)裝置組成。LightSpeed儀器采用了質(zhì)子納米粒子熱循環(huán)和基于熒光測(cè)量的光學(xué)讀數(shù)的組合，可以在大約25 min 內(nèi)完成從樣本到結(jié)果的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)，擴(kuò)增速度比傳統(tǒng)qPCR的快數(shù)倍。通過使用該儀器與賽默飛QuantStudio 6 Pro儀器進(jìn)行的qPCR測(cè)試相比，LightSpeed儀器在上具有100%的靈敏度和特異性。LightSpeed儀器設(shè)備小巧，大約只有0.91 kg重，儀器的商品成本為1 500美元，每項(xiàng)檢測(cè)的成本約為5美元，檢測(cè)成本低，具備較好的便攜性，且過程全封閉，適用于分子POCT應(yīng)用場(chǎng)景。

4 upPCR技術(shù)的應(yīng)用

upPCR 技術(shù)由于其檢測(cè)快速、流程簡(jiǎn)單、無(wú)需提取核酸、可在非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行檢測(cè)等特點(diǎn)，適用于分子POCT現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，目前在分子診斷領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景（表2）。

Table 2 Practical application of ultra-fast pulse-controlled PCR technology表2 超快脈沖控制PCR技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用

2015年Son等［61］通過λ-DNA的擴(kuò)增驗(yàn)證了基于金納米膜的upPCR 的方法。通過E-Gel 2%瓊脂糖凝膠和SYBR Safe可視化擴(kuò)增后與臺(tái)式熱循環(huán)儀（Bio-Rad C1000）對(duì)比發(fā)現(xiàn)，upPCR能夠有效擴(kuò)增出目的條帶，證明該方法可成功擴(kuò)增λ-DNA。擴(kuò)增結(jié)果與商用臺(tái)式熱循環(huán)儀的擴(kuò)增結(jié)果一致，驗(yàn)證了該系統(tǒng)的實(shí)用性和對(duì)核酸擴(kuò)增的適用性。2016年Son等［62］引入兩個(gè)平行的金納米膜形成3D PCR室，成功地?cái)U(kuò)增了從非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞（NSCLC，H1975）制備的c-MET cDNA。該方法可以在4~10 min內(nèi)完成30個(gè)PCR熱循環(huán)，并可以在15 min內(nèi)擴(kuò)增低至2×106拷貝/L的核酸濃度，比傳統(tǒng)PCR 的總反應(yīng)時(shí)間減少了70%~85%，顯示upPCR 對(duì)異質(zhì)生物樣品的實(shí)用性。GNA Biosolutions 公司將upPCR 技術(shù)用于檢測(cè)埃博拉病毒［77］，該技術(shù)所使用的設(shè)備為Pharos 400，通過激光脈沖對(duì)所有cDNA立即擴(kuò)增并實(shí)時(shí)熒光探針檢測(cè)。該方法可以檢測(cè)樣品中最低6×107拷貝/L 的埃博拉病毒RNA，為快速診斷埃博拉病毒提供方法。該公司還采用Pharos V8 設(shè)備對(duì)MRSA（耐甲氧西林金黃色葡萄球菌）的mecA抗性基因進(jìn)行檢測(cè)［38］，在100 μl的反應(yīng)體積中可以檢測(cè)到從MRSA 基因組DNA 中純化的10 拷 貝 的mecA。Muller 等［40］使 用Pharos Micro 檢測(cè)鼠疫桿菌（Yersinia pestis），使用pla基因作為靶標(biāo)，整個(gè)運(yùn)行可在14 min 內(nèi)完成。純化DNA 每次反應(yīng)的LOD（95%）為434 拷貝，對(duì)目標(biāo)基因的測(cè)定可實(shí)現(xiàn)較低拷貝數(shù)，驗(yàn)證了該技術(shù)的有效性。

2021 年Zwirglmaier 等［64］將upPCR 技術(shù)用于模式樣本檢測(cè)，開發(fā)了一種逆轉(zhuǎn)錄upPCR 檢測(cè)RNA靶標(biāo)的方法，無(wú)需事先提取RNA便可直接從拭子樣本中檢測(cè)SARS-CoV-2。該方法使用的儀器為Pharos Micro，陽(yáng)性樣本可在15 min 內(nèi)被檢測(cè)到。整個(gè)運(yùn)行在40 min 內(nèi)完成，檢測(cè)限為4.9×106拷貝/L。

2022 年Sia 等［39］通過使用LightSpeed 儀器檢測(cè)以不同病毒載量摻入人類唾液中的滅活SARSCoV-2 病毒顆粒（BEI Resources），將upPCR 技術(shù)應(yīng)用于臨床樣本檢測(cè)。包括RT-PCR熱循環(huán)的所有步驟在內(nèi)，該技術(shù)平均運(yùn)行時(shí)間為17.9 min。實(shí)時(shí)設(shè)置可以成功檢測(cè)出低至每毫升4 425個(gè)拷貝的病毒濃度。為進(jìn)一步分析等離子RT-qPCR 的定量能力，該團(tuán)隊(duì)測(cè)試了包括10個(gè)陽(yáng)性和9個(gè)陰性在內(nèi)的19 個(gè)人類唾液樣本，將不同病毒檢測(cè)濃度的Ct值與在實(shí)驗(yàn)室PCR 上運(yùn)行的樣本進(jìn)行了比較，證明了在該儀器中進(jìn)行定量分析的潛力。該團(tuán)隊(duì)還通過測(cè)試49 個(gè)經(jīng)鼻收集的人體臨床標(biāo)本（20 個(gè)陽(yáng)性和29 個(gè)陰性），在同一管中同時(shí)檢測(cè)到兩COVID 目標(biāo)：N1 和N 基因。并與在基于實(shí)驗(yàn)室的PCR 儀器上運(yùn)行的相同樣品的Ct值相比，進(jìn)一步說明這種方法的多功能性和廣泛的適用性。

5 總結(jié)與展望

qPCR 由于其快速、高精度、技術(shù)成熟、可定量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)牢牢占據(jù)著國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)，市場(chǎng)應(yīng)用發(fā)展成熟，在疾病篩查領(lǐng)域被廣泛使用。且隨著技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步，中國(guó)的qPCR檢測(cè)儀器、設(shè)備及檢測(cè)試劑已在一定程度上實(shí)現(xiàn)國(guó)產(chǎn)代替，在未來(lái)10年內(nèi)qPCR 仍將是大型集中檢測(cè)的主流技術(shù)。但qPCR 技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室和非醫(yī)療環(huán)境中進(jìn)行基因識(shí)別擴(kuò)增時(shí)需要從DNA 樣品制備和最終擴(kuò)增子檢測(cè)和量化的過程，以及對(duì)檢測(cè)試劑、設(shè)備、場(chǎng)地、操作人員要求較高，難以做到大規(guī)?？焖俸Y查，也不適合基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)及家庭檢測(cè)。

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是一系列恒溫分子診斷技術(shù)的統(tǒng)稱，包括LAMP、RCA、RPA、SDA等，以其設(shè)備簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速等優(yōu)勢(shì)，在分子POCT領(lǐng)域嶄露頭角，以SARS-CoV-2檢測(cè)為例，國(guó)外推出了一系列基于恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的快檢產(chǎn)品，包括美國(guó)Lucira Health公司開發(fā)的Lucira COVID-19一體化試劑盒，Cue Health 公司開發(fā)的Cue’s COVID-19 Diagnostic Test，Detect 公司開發(fā)的Detect COVID-19 Test 等。已形成幾十億美元的銷售額，等溫?cái)U(kuò)增在未來(lái)分子POCT場(chǎng)景中具有重大應(yīng)用潛力，但等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)目前也存在一系列缺點(diǎn)，比如較難兼容多重檢測(cè)體系、假陽(yáng)性較高、試劑穩(wěn)定性不高（等溫?cái)U(kuò)增大多采用中溫酶）、靈敏度不夠、試劑常溫儲(chǔ)存的凍干技術(shù)缺乏等。

upPCR 技術(shù)在繼承了常規(guī)qPCR 的兼容多重檢測(cè)、靈敏度高、試劑穩(wěn)定性好等優(yōu)勢(shì)的基礎(chǔ)上，也兼具了等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)快速、設(shè)備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，在未來(lái)分子POCT 領(lǐng)域中具有很大應(yīng)用潛力。此外，在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)市場(chǎng)上，常規(guī)qPCR檢測(cè)技術(shù)復(fù)雜且昂貴，而upPCR 技術(shù)操作簡(jiǎn)單、成本低，可對(duì)轉(zhuǎn)基因成分準(zhǔn)確定量檢測(cè)，使其在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)市場(chǎng)上具有較強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)力?？梢灶A(yù)見，在未來(lái)發(fā)展中，upPCR及多種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)有可能以與qPCR技術(shù)以互補(bǔ)的形式存在于市場(chǎng)：qPCR由于其特異性高、檢測(cè)范圍寬、可定量檢測(cè)等特點(diǎn)，在大型醫(yī)院、第三方檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)、科研實(shí)驗(yàn)室等大型專業(yè)終端場(chǎng)景中仍然長(zhǎng)期占據(jù)主要市場(chǎng)；而upPCR 及等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)有望成為家庭自檢、社區(qū)快檢等分子POCT領(lǐng)域中的主要技術(shù)。

值得注意的是，upPCR技術(shù)目前仍處于技術(shù)研發(fā)階段，對(duì)擴(kuò)增過程中所使用的核心酶仍具有改進(jìn)空間，相較于普通PCR，upPCR 技術(shù)檢測(cè)速度更快，在擴(kuò)增過程中需要具有熱穩(wěn)定性更高、延伸速率更快的聚合酶。通過對(duì)核心酶分子進(jìn)行改造，提升酶分子的熱穩(wěn)定性及延伸速度對(duì)upPCR 技術(shù)尤為重要，目前改造酶分子的方式主要是化學(xué)修飾法、通過基因工程技術(shù)生產(chǎn)酶和通過蛋白質(zhì)工程技術(shù)改造酶。而近年來(lái)生物信息學(xué)的發(fā)展，使得關(guān)于酶序列和結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)更易獲取，通過計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)和基于結(jié)構(gòu)信息的分析使得現(xiàn)有的酶分子定向進(jìn)化技術(shù)得到進(jìn)一步發(fā)展，使用計(jì)算機(jī)輔助聯(lián)合方法對(duì)熱穩(wěn)定聚合酶進(jìn)行改造將成為upPCR 技術(shù)研發(fā)的一種新方法。在探針法的upPCR 中，除了要求酶具有很高的延伸速度，還要求酶的5'→3'外切酶結(jié)構(gòu)域能夠更快速地切割熒光探針，目前這方面的分子改造仍缺乏報(bào)道，因此提升5'→3'外切酶活性是后續(xù)對(duì)快速Taq DNA 聚合酶進(jìn)行研發(fā)的一個(gè)重點(diǎn)方向。除熱穩(wěn)定聚合酶外，逆轉(zhuǎn)錄酶的分子改造對(duì)提升upPCR 技術(shù)的靈敏性和檢測(cè)速度也至關(guān)重要。upPCR 反應(yīng)過程需要高度耐熱性的逆轉(zhuǎn)錄酶，如何提高逆轉(zhuǎn)錄酶的耐熱性，增強(qiáng)逆轉(zhuǎn)錄酶與模板的親和力，也是后續(xù)研發(fā)的重點(diǎn)內(nèi)容。除此之外，對(duì)局部加熱與整體加熱、光能加熱與電能加熱技術(shù)的優(yōu)劣也并未形成定論，對(duì)納米金批量制備技術(shù)、引物-納米金偶聯(lián)技術(shù)，以及超快速核心酶的開發(fā)也較為薄弱，因此upPCR 技術(shù)離真正的商業(yè)化成熟還有較大距離。upPCR技術(shù)相應(yīng)的配套設(shè)備的開發(fā)也比較少，這使得upPCR 的技術(shù)研究缺少必要的硬件工具，也阻礙了該技術(shù)的進(jìn)步。雖然目前國(guó)外已經(jīng)有少數(shù)公司推出了upPCR 的商品化解決方案，但在國(guó)內(nèi)關(guān)注并研究該技術(shù)的機(jī)構(gòu)仍較少，期待隨著國(guó)內(nèi)分子診斷技術(shù)的進(jìn)步，未來(lái)將會(huì)有越來(lái)越多的分子POCT新技術(shù)被開發(fā)出來(lái)。