唐會元，董 純，楊 志，朱其廣，羅安紅，朱正強，陳小娟

(1.水利部中國科學(xué)院水工程生態(tài)研究所，水利部水工程生態(tài)效應(yīng)與生態(tài)修復(fù)重點實驗室，武漢 430079；2.十堰市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測所，湖北十堰442000)

微生物是生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，對水環(huán)境的物質(zhì)循環(huán)和能量流動具有重要作用[1-3]。微生物群落通過吸附、轉(zhuǎn)化和沉淀等作用，可降低重金屬的遷移能力和生物有效性[4-5]，而在重金屬脅迫下，微生物會產(chǎn)生氧化應(yīng)激產(chǎn)物，當(dāng)產(chǎn)物超過微生物的抗氧化能力時，微生物的活性和生物量下降，從而削弱了對環(huán)境污染物的降解能力[6]。沉積物是微生物活動最活躍區(qū)域之一，也是重金屬的主要載體庫。因此，研究河流沉積物微生物群落及其與重金屬污染的響應(yīng)關(guān)系對于評估河流生態(tài)系統(tǒng)健康狀況具有重要意義。

長江上游是長江流域水能資源最為富集的區(qū)域，是整個長江流域的生態(tài)屏障[7]，水生態(tài)環(huán)境受到廣泛關(guān)注。已有研究發(fā)現(xiàn)，三峽水庫蓄水后，庫區(qū)重金屬和微生物群落結(jié)構(gòu)會隨著庫區(qū)環(huán)境的變更而迅速做出反應(yīng)[8-10]。如庫區(qū)Cr、Pb和Hg等重金屬濃度呈增加趨勢[11]；庫區(qū)沉積物微生物豐富度和多樣性隨季節(jié)水位變化產(chǎn)生顯著差異，并且與NH4-N和CO2濃度顯著相關(guān)[12]。微生物和重金屬之間的相互作用也深受周圍環(huán)境因子的影響，如蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)對As的吸附隨著pH的升高而增加，但當(dāng)pH大于7.5時，吸收效率反而會降低[13]；低pH值環(huán)境下，硫桿菌(Thiobacillus)對重金屬的吸附能力降低[14]。然而，關(guān)于庫區(qū)及上游沉積物細菌微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性與重金屬含量之間的響應(yīng)關(guān)系鮮見報道。

為此，本研究在三峽庫區(qū)及上游典型江段采集表層沉積物，利用MiSeq平臺高通量測序技術(shù)分析細菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性，以初步探究重金屬含量與細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的關(guān)系，以期為庫區(qū)及上游水生態(tài)環(huán)境保護與修復(fù)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2020年10-11月在三峽水庫上游合江(HJ)和江津(JJ)，以及庫區(qū)木洞(MD)和長壽(CS)(圖1)，共4個江段采集表層沉積物，每個江段設(shè)置上游(S)、中游(Z)和下游(X)3個斷面，每個斷面設(shè)置左岸(1)和右岸(2)兩個采樣點，如合江上游左岸樣品編號為HJS1。由于部分采樣點不方便到達，未取樣，共采集樣品21個。在每個采樣點使用PSC-1/40彼得森采集器采集0～5 cm左右的表層沉積物，每個采樣點采集3次，然后將樣品混合均勻，取10 g左右沉積物裝入滅菌的冷凍離心管中，液氮保存，用于細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析。

圖1 樣品采樣江段Fig.1 Map of sampling sections

1.2 微生物群落分析

將冷凍干燥的沉積物用MagPure Soil DNA Kit試劑盒(Magen)說明書提供的方法提取微生物總DNA。采用超微量紫外分光光度計對提取到的DNA進行定量，并通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量。對檢驗合格樣品的16S rRNA基因可變區(qū)(V3～V4區(qū))進行PCR擴增，所用前引物序列為338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCA)，后引物序列為806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)。PCR產(chǎn)物定量和均一化處理后，利用Illumina MiSep平臺進行高通量測序，并對測序數(shù)據(jù)進行生物信息學(xué)和統(tǒng)計學(xué)分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

通過Qiime調(diào)用DADA2對測序得到的原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)控、去噪、拼接、去嵌合體，完成對所有文庫的去噪后，合并擴增子序列變異體(amplicon sequence variants，ASVs)，得到ASVs特征序列。利用Qiime軟件計算Chao1、Shannon、Simpson和Good’s coverage指數(shù)，采用Kruskal-Wallis檢驗α多樣性指數(shù)在不同采樣江段之間的差異是否在統(tǒng)計學(xué)上顯著，箱線圖使用R軟件包繪制。以P<0.05作為差異顯著水平。

重金屬數(shù)據(jù)參考文獻[15]。使用SPSS軟件對微生物多樣性指數(shù)與重金屬之間的關(guān)系進行Pearson相關(guān)分析，使用采樣江段沉積物前六大菌門細菌的相對豐度數(shù)據(jù)和重金屬數(shù)據(jù)進一步分析重金屬與細菌群落結(jié)構(gòu)變化的關(guān)系。As、Hg、Cu、Pb、Cd和Cr作為解釋變量，而細菌相對豐度作為響應(yīng)變量。所有數(shù)據(jù)在建模前都經(jīng)過log10(x+1)轉(zhuǎn)換以滿足數(shù)據(jù)的正態(tài)分布和增加數(shù)據(jù)的同質(zhì)性，去趨勢對應(yīng)分析(detrended correspondence analysis，DCA)顯示使用線性模型，故采用冗余分析(redundancy analysis，RDA)[16]。分析前，采用方差膨脹系數(shù)(variance inflation factor，VIF)檢驗各變量間的共線性，VIF值大于20的變量具有明顯的共線性，將其排除在RDA分析中。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌群落序列分析

從21個采樣點的沉積物中共獲得細菌原始序列2 272 087條，通過質(zhì)量控制和序列優(yōu)化，篩選出有效序列1 862 709條，高質(zhì)量序列1 611 763條，其中高質(zhì)量序列的平均長度為386.3 bp。共獲得33 189個擴增子序列變異體(ASV)，其中庫區(qū)木洞(1 663個)和長壽江段(1 656個)平均ASV數(shù)顯著高于上游江津(1 546個)和合江江段(1 460個)。細菌ASV劃分為65門179綱446目784科和1 926屬。

2.2 細菌α多樣性分析

采樣江段細菌群落豐富度和多樣性如圖2(a)所示，沉積物細菌Chao1指數(shù)為2 779.88～7 064.58，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)分別為10.64～11.92和0.998～0.999，且三者的變化趨勢一致，均表現(xiàn)為木洞和長壽江段的指數(shù)高于江津和合江江段，但兩兩之間沒有顯著差異；采樣江段右岸的Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)顯著高于左岸[圖2(b)]。結(jié)果顯示沉積物中細菌群落豐富度和多樣性表現(xiàn)為：庫區(qū)江段>庫區(qū)上游江段，右岸江段>左岸江段。各采樣點沉積物Good’s coverage指數(shù)值較高，均在0.99以上，說明本次樣品中的細菌絕大部分被檢測出來。

2.3 細菌群落結(jié)構(gòu)組成

在門分類水平上，變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)的相對豐度較高[圖3(a)]。第一優(yōu)勢菌門均為變形菌門，相對豐度為42.35%～54.56%，次優(yōu)勢菌門為酸桿菌門，相對豐度為9.07%～18.46%。

在綱分類水平上，γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)為第一優(yōu)勢菌綱，相對豐度為12.65%～28.30%，其次為α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)、擬桿菌綱(Bacteroidia)、厭氧繩菌綱(Anaerolineae)(圖3(b))。

在屬分類水平上，Subgroup_6是第一優(yōu)勢菌屬，相對豐度為2.43%～7.95%，其次是Subgroup_17、SC-I-84、KD4-96和嗜甲基菌屬(Methylotenera)[圖3(c)]。

2.4 重金屬與細菌群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)分析

從表1細菌多樣性指數(shù)與重金屬的Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，江津江段細菌多樣性Chao1指數(shù)與Cd含量呈顯著正相關(guān)，木洞江段細菌多樣性Simpson指數(shù)與Hg、Pb和Cd含量呈顯著負相關(guān)。從整個研究江段來看，表層沉積物細菌多樣性Chao1指數(shù)與As含量和Hg含量呈顯著正相關(guān)；Shannon指數(shù)與As含量呈顯著正相關(guān)；Good’s coverage指數(shù)與As、Hg、Pb和Cd含量呈顯著負相關(guān)。

表1 沉積物細菌多樣性指數(shù)與重金屬的Pearson相關(guān)性Tab.1 Pearson correlation analysis between bacterial diversity index and heavy metals in sediments

采用冗余分析(RDA)對相對豐度前六位的菌門和重金屬之間的關(guān)系作進一步分析。本研究Cd的方差膨脹系數(shù)值為25.02，不作為解釋環(huán)境因子而運用在后續(xù)的分析中，其他5個環(huán)境因子中有4個環(huán)境因子與沉積物細菌群落結(jié)構(gòu)變動顯著相關(guān)(As，F(xiàn)=19.914，P=0.001；Cu，F(xiàn)=3.152，P=0.049；Pb，F(xiàn)=6.668，P=0.002；Cr，F(xiàn)=2.814，P=0.046)。As、Pb、Cr和Cu含量與綠彎菌門呈顯著正相關(guān)，與厚壁菌門呈顯著負相關(guān)?？傊x的5個環(huán)境因子共同解釋了群落結(jié)構(gòu)60.09%的變異，其中前兩個規(guī)范軸共同解釋了群落結(jié)構(gòu)44.27%的變異，其中軸1單獨解釋了群落結(jié)構(gòu)31.82%的變異(圖4)。

圖4 相對豐度最高的六類菌門與重金屬的冗余分析Fig.4 Redundancy analysis on the six highest abundance bacterial phylum and heavy metals藍色箭頭表示環(huán)境因子As，Hg，Cu，Pb，Cr，紅色箭頭表示不同菌門，Pro為變形菌門，Aci為酸桿菌門，Act為放線菌門，Chl為綠彎菌門，Bac為擬桿菌門，F(xiàn)ir為厚壁菌門

3 討論

3.1 細菌群落結(jié)構(gòu)特征

三峽庫區(qū)及上游沉積物樣品中第一大優(yōu)勢類群為變形菌門，其次為酸桿菌門、放線菌門、綠彎菌門、擬桿菌門和厚壁菌門，與之前在三峽庫區(qū)的研究結(jié)果類似。QIN等[12]和WANG等[17]均發(fā)現(xiàn)三峽庫區(qū)以變形菌門、綠彎菌門和酸桿菌門等為主。變形菌門之所以可以作為庫區(qū)及其它河流中最豐富的菌群，可能與該菌群具有較高的吸收能力和生長速率有關(guān)[18-19]，且大多數(shù)變形菌門在有機物分解和循環(huán)中起著重要作用[20]。另外，本研究檢測到的優(yōu)勢菌綱屬于變形菌門中的γ-變形菌綱、α-變形菌綱和δ-變形菌綱，這些優(yōu)勢菌群可能對庫區(qū)及上游沉積物的碳氮循環(huán)具有重要意義[21]。在不同研究江段中，優(yōu)勢菌群的組成相同，但是不同江段優(yōu)勢菌群的相對豐度不盡相同，這與研究江段的地理位置和周圍環(huán)境有關(guān)[22]。優(yōu)勢菌群在庫區(qū)長壽江段和木洞江段的相對豐度高于庫區(qū)上游江津江段和合江江段，庫區(qū)江段相比于上游江段，流速低，水溫高，可能更適宜細菌生長和繁殖，同時說明了細菌群落組成對環(huán)境變化具有高度的響應(yīng)性，不同生境之間細菌群落存在一定差異。

3.2 細菌群落對重金屬污染的響應(yīng)

一般情況下，重金屬污染程度越高，其環(huán)境細菌多樣性越低[23-24]。本研究發(fā)現(xiàn)Cd、Cr、As、Hg和Pb含量與細菌多樣性密切相關(guān)。其中Hg、Pb和Cd含量與木洞江段Simpson指數(shù)顯著負相關(guān)，表明重金屬污染越嚴重，其細菌多樣性越低。而Cd和Cr含量與江津江段的細菌多樣性指數(shù)呈正相關(guān)，隨著這兩種重金屬污染加重，其沉積物細菌多樣性隨之升高。這與王秀麗等[25]和SUN等[6]的研究結(jié)果不同，他們發(fā)現(xiàn)重金屬污染與細菌多樣性呈負相關(guān)，但與張建等[26]的研究結(jié)果相似，均發(fā)現(xiàn)不同采樣點重金屬污染與細菌多樣性之間具有不同的響應(yīng)關(guān)系，有的采樣地點重金屬污染程度與細菌多樣性呈負相關(guān)，而有的采樣地點則呈正相關(guān)，這可能因為細菌多樣性不僅與重金屬含量有關(guān)，還受其他環(huán)境因子的影響[27]。有研究發(fā)現(xiàn)三峽庫區(qū)微生物多樣性與溫度、氧化還原電位顯著正相關(guān)[17]；水溫和溶解氧影響著周圍環(huán)境微生物群落的組成和分布[9]。

微生物通過參與環(huán)境因子的物質(zhì)循環(huán)來降解污染物質(zhì)，反過來污染物質(zhì)的存在會使可降解該類污染物質(zhì)的細菌富集，從而改變細菌群落結(jié)構(gòu)組成[28]。本研究采用RDA分析重金屬對細菌群落結(jié)構(gòu)變化的響應(yīng)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)As、Pb、Cu和Cr含量與綠彎菌門相對豐度呈顯著正相關(guān)。綠彎菌門在庫區(qū)及上游沉積物中的相對豐度較高，為5.25%～12.56%，尤其是在木洞江段(9.15%)和長壽江段(8.51%)，根據(jù)課題組前期研究結(jié)果[15]，可知這兩個江段的重金屬含量也普遍較高，驗證了RDA的分析結(jié)果。有研究表明不同微生物對重金屬污染表現(xiàn)出不同的耐受力[29]。本研究和林海等[30]也得到類似結(jié)論。本研究發(fā)現(xiàn)與其他細菌群落相比，厚壁菌門對重金屬污染的響應(yīng)截然不同，As、Pb、Cu和Cr含量與厚壁菌門相對豐度呈顯著負相關(guān)，說明厚壁菌門對這些重金屬污染可能具有較低的耐受力，對三峽庫區(qū)及上游沉積物重金屬污染具有指示作用。