王繼耀，程江峰

(1.青島科技大學(xué)，海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院，山東青島 266042；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島 266071；3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，山東青島266237)

氯芬新(lufenuron)是一種苯甲酰脲類殺蟲劑，適用于對(duì)擬除蟲菊酯和有機(jī)磷類殺蟲劑產(chǎn)生抗性的害蟲的防治，也可用于魚類魚虱病的防治[1-3]。氯芬新是通過干擾新合成的角質(zhì)層中甲殼素的形成來擾亂生物關(guān)鍵發(fā)育階段的蛻皮過程致其死亡[4-5]，因而對(duì)甲殼類水生生物具有很大的危害性。隨著氯芬新在農(nóng)業(yè)方面的用量的逐年增加，其很容易通過循環(huán)廢水、農(nóng)業(yè)徑流等途徑進(jìn)入水體環(huán)境，對(duì)水生生物造成危害，并在生物體內(nèi)富集，通過食物鏈對(duì)消費(fèi)者造成毒害作用[6]。為防止氯芬新殘留對(duì)消費(fèi)者健康、水產(chǎn)行業(yè)發(fā)展及國(guó)際貿(mào)易造成不良影響，我國(guó)、美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局和歐盟獸用藥品委員會(huì)等機(jī)構(gòu)制訂了許多針對(duì)氯芬新的國(guó)際公約、法規(guī)及限量標(biāo)準(zhǔn)。我國(guó)規(guī)定氯芬新在結(jié)球甘藍(lán)和蘋果中的最大殘留限量為1.00 mg/kg，在柑、橘和橙中的最大殘留量限量為0.50 mg/kg，在韭菜和番茄中的最大殘留限量為3.00 mg/kg[7]。歐盟獸用藥品委員會(huì)(EU)發(fā)布制定氯芬新在鮭科和鰭魚類中氯芬新的最大殘留限量值為1.35 mg/kg[8]。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)也發(fā)布公告確定氯芬新在鮭中的最大殘留限量為1.35 mg/kg[9]。歐盟食品安全局(EFSA)在2020年規(guī)定氯芬新在牛的肌肉、脂肪、肝臟中的最大殘留限量為0.02 mg/kg，在果蔬為0.01～0.80 mg/kg[10]。

目前，氯芬新在歐盟是針對(duì)魚虱病的專用漁藥，在我國(guó)尚沒有批準(zhǔn)使用，其在魚中的殘留多是由于違規(guī)使用和濫用造成的，并可通過食物鏈對(duì)消費(fèi)者造成不良影響。 QuEChERS作為一種快捷、簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉同時(shí)可提供高質(zhì)量藥物殘留分析的前處理方法，已經(jīng)在藥物殘留檢測(cè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[11-14]。本研究以草魚為代表基質(zhì)，采用QuEChERS法對(duì)樣品進(jìn)行前處理，結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)，建立了魚中氯芬新殘留的檢測(cè)方法；同時(shí)采用建立的方法測(cè)試了采集自不同地區(qū)的13種128份魚類樣品；分別采用FDA和歐盟等制定鮭以及歐盟制定部分動(dòng)物源性食品中的氯芬新最大殘留限量，結(jié)合風(fēng)險(xiǎn)熵值法進(jìn)行安全性分析。本研究通過建立針對(duì)氯芬新的專一藥物殘留的方法，并利用該技術(shù)首次對(duì)我國(guó)13種魚類樣品中氯芬新殘留量進(jìn)行了測(cè)試，并進(jìn)行了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，以期為我國(guó)水產(chǎn)品中氯芬新殘留狀況、潛在安全風(fēng)險(xiǎn)分析提供技術(shù)支持和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯芬新農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法學(xué)研究所用草魚(Ctenopharyngodonidella)空白基質(zhì)樣品采自山東省青島市的水產(chǎn)品養(yǎng)殖基地。

128份魚類樣品分別采自北京、天津、江蘇、浙江和河北等省市的集貿(mào)市場(chǎng)或水產(chǎn)養(yǎng)殖企業(yè)，具體份數(shù)見表1。

乙腈、乙酸銨(均為色譜純，德國(guó)Merck公司)；氯化鈉、無水硫酸鈉、無水硫酸鎂、N-丙基乙二胺(primary secondary amine，PSA)、十八烷基硅烷鍵合相(C18)(美國(guó)Agilent科技公司)；陶瓷均質(zhì)子(美國(guó)Agilent科技公司)；氯芬新標(biāo)準(zhǔn)溶液(lufenuron，1 mg/mL，天津阿爾塔科技有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ Endura 三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(配有電噴霧離子源(ESI)，美國(guó)Thermo Fisher公司)；Himac CR 22G高速離心機(jī)(日本Hitachi公司)；XW-80A渦旋混合器(上海醫(yī)大儀器廠)；分析天平(感量0.01 g，德國(guó)賽多利斯公司)；Gradient A10 Mill-Q超純水儀(美國(guó)Millipore公司)。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理方法

1.3.1.1 樣品制備

草魚中可食部分參考GB/T 30891—2014《水產(chǎn)品抽樣規(guī)范》中取樣方法進(jìn)行。取3尾草魚清洗后去頭、骨、內(nèi)臟，取肌肉魚皮等可食部分絞碎混合均質(zhì)。均質(zhì)后的樣品在-20 ℃冰箱中保存，使用時(shí)提前解凍。

1.3.1.2 提取方法

準(zhǔn)確稱取勻質(zhì)樣品5.00 g(精確至0.01 g)，置于50 mL具螺旋蓋聚丙烯離心管中，加入陶瓷均質(zhì)子，加入10 mL乙腈，渦旋5 min，加入4 g無水Na2SO4、1 g NaCl，以8 000 r/min離心5 min，取上清液于50 mL刻度離心管中。再加入10 mL乙腈，重復(fù)提取一次，合并兩次提取的上清液于50 mL刻度離心管中，再加乙腈定容至20 mL混勻。

1.3.1.3 凈化方法

吸取5 mL上清液于含有復(fù)合凈化材料(400 mg PSA、400 mg C18、1 200 mg無水MgSO4)的15 mL離心管中，渦旋1 min，8 000 r/min 高速離心5 min，取上清液2 mL，以氮?dú)獯抵两桑右译? mL，過0.22 μm濾膜至進(jìn)樣瓶，待測(cè)。

1.3.2 儀器條件

液相色譜條件：色譜柱XB-C18(2.1 mm×100 mm，2.6 μm)；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相：A為2 mmol/L乙酸銨水溶液，B為乙腈；流速：0.300 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；梯度洗脫程序如表2所示。

表2 流動(dòng)相及梯度洗脫條件Tab.2 Mobile phase and gradient elution conditions

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)；選擇反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(SRM)，負(fù)離子模式；噴霧電壓3 000 V；離子源溫度350 ℃；鞘氣壓力35 Arb；輔助氣壓力5 Arb；氯芬新的定性離子對(duì)為m/z509.0/325.9，定量離子對(duì)為m/z509.0/338.9，碰撞能分別為27 eV和20 eV。

1.4 檢測(cè)方法參數(shù)測(cè)定

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的建立

氯芬新標(biāo)準(zhǔn)品以乙腈配制濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并稀釋至標(biāo)準(zhǔn)工作液(1.0 μg/mL)，避光4 ℃貯存。分別在5 g空白樣品中，加入適量氯芬新標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照樣品處理方法進(jìn)行同樣操作。得到0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0和100.0 ng/mL的基質(zhì)添加匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)HPLC-MS/MS測(cè)定。以定量離子峰面積(y)為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到氯芬新的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.4.2 回收率、精密度、檢出限的測(cè)定

用不含氯芬新的陰性草魚樣品進(jìn)行空白加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，選擇1.0、2.0、5.0和50.0 μg/kg四個(gè)濃度水平的加標(biāo)量。稱取5 g樣品根據(jù)選擇的不同加標(biāo)量，加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)品，按1.3節(jié)進(jìn)行前處理后，用HPLC-MS/MS儀測(cè)定并計(jì)算加標(biāo)回收率。以添加回收樣品信噪比大于3得方法檢出限(limit of detection，LOD)，使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)計(jì)算樣品濃度。

1.4.3 魚類樣品測(cè)試方法

待測(cè)魚類樣品按上述方法進(jìn)行提取、凈化和濃縮處理，經(jīng)HPLC-MS/MS 測(cè)定，基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量。魚類樣品檢測(cè)結(jié)果計(jì)算如公式1：

(公式1)

式中：X為魚類樣品中氯芬新的含量/(μg/kg)；C為魚類樣品溶液中氯芬新的質(zhì)量濃度/(ng/mL)；V為試樣最后的定容體積/mL；n為樣品稀釋倍數(shù)；m為試樣質(zhì)量/g。

1.4.4 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)方法

采用風(fēng)險(xiǎn)熵值法(RQ)對(duì)魚類中氯芬新殘留進(jìn)行安全性分析，計(jì)算方法見公式2，國(guó)際通用安全閾值為RQ=1。我國(guó)目前尚未制定水產(chǎn)品中的氯芬新殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，因此MRL分別參照歐盟規(guī)定鮭中氯芬新的最大殘留限量值1 350 μg/kg和歐盟在部分動(dòng)物源性食品中規(guī)定的氯芬新最大殘留限量值20 μg/kg進(jìn)行安全性評(píng)估。根據(jù)RQ 值大小將風(fēng)險(xiǎn)分為3 個(gè)等級(jí)：RQ>1 為高風(fēng)險(xiǎn)，1≥RQ>0.1 為中等風(fēng)險(xiǎn)，RQ≤0.1 為低風(fēng)險(xiǎn)[15]。

(公式2)

其中X為魚類樣品中氯芬新的含量/(μg/kg)，MRL為氯芬新最大殘留限量。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件

2.1.1 提取方法

樣品中提取農(nóng)藥殘留常用的溶劑主要有乙腈、甲醇、二氯甲烷和丙酮等[15-16]。因?yàn)槎燃淄槎拘暂^大，易造成環(huán)境污染，丙酮提取會(huì)產(chǎn)生大量油脂，所以不選作水產(chǎn)樣品的提取劑。本研究以草魚為基質(zhì)分別考察了乙腈、1%甲酸乙腈的提取效率。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乙腈和1%甲酸乙腈兩者均可以在實(shí)驗(yàn)中得到良好的提取效果，按照簡(jiǎn)便快速的原則，本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈進(jìn)行提取。

2.1.2 凈化方法

凈化前后草魚的總離子流圖(total ion chromatogram，TIC)譜圖如圖1所示。對(duì)于草魚基質(zhì)，復(fù)合凈化材料凈化后的色譜圖中雜峰更少，響應(yīng)值增強(qiáng)，表明較多的PSA和C18填料能更好地去除魚肉中的干擾成分，減小基質(zhì)干擾。因此選擇復(fù)合凈化材料即400 mg PSA、400 mg C18、1 200 mg無水MgSO4用于前處理的凈化。

圖1 使用復(fù)合凈化材料凈化前(A)和凈化后(B)草魚的TIC譜圖Fig.1 TIC spectrum of grass carp before(A)and after(B)purification with composite purification material

2.2 檢測(cè)方法評(píng)價(jià)

2.2.1 氯芬新基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線

以定量離子峰面積(y)為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到氯芬新的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。在0.5～100.0 ng/mL線性范圍內(nèi)，氯芬新的線性回歸方程為Y=20.030 3X-2.679 2，線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)(r2)大于0.995。

2.2.2 檢出限

空白草魚中添加氯芬新濃度為1.0 μg/kg時(shí)，峰形信號(hào)明顯，信噪比(S/N)大于3，確定方法檢出限(LOD)為1.0 μg/kg，色譜圖如圖2所示。結(jié)果表明，氯芬新檢出限為1.0 μg/kg，靈敏度滿足檢測(cè)要求。

圖2 草魚樣品中氯芬新添加濃度為1.0 μg/kg時(shí)提取離子色譜圖Fig.2 Extracted ion chromatogram of grass carp samples at a concentration of 1.0 μg/kg of lufenuron addition

2.2.3 精密度和準(zhǔn)確度

精密度和準(zhǔn)確度結(jié)果如表3所示，氯芬新的平均回收率為79.16%～106.33%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(n=6)為1.63%～7.26%。此實(shí)驗(yàn)方法滿足GB/T 27404-2008對(duì)回收率60%～120%、精密度<15%的要求，具有較好的回收率和重復(fù)性，可以用于魚肉中氯芬新殘留的測(cè)定。

表3 氯芬新在陰性樣品中的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Tab.3 Spiked recoveries and relative standard deviations of lufenuron in negative samples(n=6)

2.3 魚類中氯芬新殘留安全性分析

2.3.1 魚類中氯芬新殘留檢測(cè)結(jié)果

在鳙、鯉、鯽、鱘、虹鱒、鰱、鳊、鱖和大菱鲆中未檢出氯芬新殘留。在25份魚類樣品檢出氯芬新殘留，其中加州鱸、草魚、大黃魚和烏鱧中氯芬新殘留的檢出率分別為37.21%、29.41%、40.00%和16.67%，殘留含量值分別為1.38～343.02、1.37～58.43、1.05～33.19和1.49～1.87 μg/kg。

結(jié)果表明，在檢出的陽性魚類樣品中，鱸中的氯芬新殘留的檢測(cè)值和檢出數(shù)量均很高。造成鱸中氯芬新殘留檢測(cè)值較高的原因之一可能是存在氯芬新違規(guī)使用情況。有研究表明鱸會(huì)感染魚虱病和其他寄生蟲病[18]，為防止鱸大量死亡，在鱸養(yǎng)殖等水產(chǎn)養(yǎng)殖中會(huì)使用氯芬新殺死魚虱[1-3]。鱸中的氯芬新殘留的檢測(cè)值和檢出數(shù)量較高這一現(xiàn)象在我國(guó)已有科學(xué)研究中均未見報(bào)道，因此亟需引起高度重視，并進(jìn)一步深入調(diào)查。

2.3.2 魚類中氯芬新殘留的安全性分析

計(jì)算得到不同魚類樣品中氯芬新殘留的RQ值見表4。采用FDA和歐盟鮭魚中氯芬新的最大殘留限量值1 350 μg/kg計(jì)算得到草魚、烏鱧和大黃魚為低風(fēng)險(xiǎn)，加州鱸中等風(fēng)險(xiǎn)；采用歐盟在部分動(dòng)物源性食品中的最大殘留限量值20 μg/kg進(jìn)行計(jì)算，得到僅烏鱧為低風(fēng)險(xiǎn)，草魚、大黃魚和加州鱸均為高風(fēng)險(xiǎn)，尤其是加州鱸RQ值是風(fēng)險(xiǎn)值的17倍之多，表明鱸中存在較嚴(yán)重的氯芬新殘留食用風(fēng)險(xiǎn)。

表4 不同品種魚中氯芬新殘留風(fēng)險(xiǎn)熵值Tab.4 Risk entropy values of lufenuron residues in different fish species

3 結(jié)論

本研究采用QuEChERS進(jìn)行前處理法，基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量，建立了魚類中氯芬新殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。同時(shí)對(duì)13種128份魚類樣品進(jìn)行檢測(cè)，在鳙、鯉、鯽、鱘、虹鱒、鰱、鳊、鱖和大菱鲆中均未檢出氯芬新殘留，表明這些品種的魚類存在氯芬新殘留食用風(fēng)險(xiǎn)很小。參照歐盟制定鮭中氯芬新殘留最大殘留限量值1 350 μg/kg計(jì)算，草魚、烏鱧和大黃魚為低風(fēng)險(xiǎn)，加州鱸為中等風(fēng)險(xiǎn)；參照歐盟動(dòng)物源產(chǎn)品中最大殘留限量值20 μg/kg進(jìn)行計(jì)算，烏鱧為低風(fēng)險(xiǎn)，草魚、大黃魚和加州鱸魚為高風(fēng)險(xiǎn)，尤其是加州鱸RQ值是風(fēng)險(xiǎn)值的17倍之多。表明在我國(guó)部分魚類養(yǎng)殖過程中可能存在較為嚴(yán)重的氯芬新違規(guī)使用現(xiàn)象，存在氯芬新污染的風(fēng)險(xiǎn)。