蔣俊賢，張 凱，王廣軍，郁二蒙，龔?fù)麑?，李志斐，謝 駿

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省水產(chǎn)動(dòng)物免疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510380)

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模及集約化程度不斷擴(kuò)大，水產(chǎn)養(yǎng)殖尾水排放逐漸引起人們的重視。MOURA等[1]發(fā)現(xiàn)，水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘中投入生產(chǎn)的近79%的N和83%的P隨尾水排出。雖然水產(chǎn)養(yǎng)殖尾水相比畜禽業(yè)、工業(yè)、生活污水污染較低，但是其較低的碳含量和較高的硝酸鹽濃度對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖尾水的凈化造成不小的挑戰(zhàn)。在低碳氮比的尾水處理過(guò)程中，碳源的缺乏會(huì)導(dǎo)致硝化和反硝化細(xì)菌活性低下、生長(zhǎng)速度緩慢進(jìn)而影響處理效果[2]。實(shí)踐證明，人工濕地種植植物能顯著提高對(duì)污染物的去除率。雖然植物對(duì)水體中主要污染物氮磷的直接去除率不高，但是植物可以通過(guò)根系釋放的分泌物及根系泌氧，在根際形成交替的有氧與無(wú)氧環(huán)境，進(jìn)而影響根際微生物群落結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)污水處理效果[3]。

植物向根際區(qū)釋放的分泌物的組成受植物種類、基因型、發(fā)育階段、根系性狀、養(yǎng)分有效性和環(huán)境等條件影響[4]。鳶尾(IristectorumMaxim)和風(fēng)車草(CyperusinvolucratusRottboll)是兩種常用于人工濕地的植物，它們對(duì)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，根系發(fā)達(dá)，對(duì)氮、磷的吸收效果較強(qiáng)[5]。已有研究表明，鳶尾或風(fēng)車草釋放的根系分泌物種類有乳酸、酒石酸、腐殖酸、色氨酸、草酸、蘋果酸、多糖、氨基酸等[6-8]，且部分根系分泌物有利于尾水中TN和TP的去除。然而，這些研究多是定向檢測(cè)已知的植物分泌物種類，且處理的尾水多為高氨氮廢水，與水產(chǎn)養(yǎng)殖尾水有著較大差異。人工濕地植物在處理水產(chǎn)養(yǎng)殖尾水時(shí)分泌物釋放情況以及根系分泌物與其處理效果之間的關(guān)系鮮有報(bào)道。

因此，本研究通過(guò)搭建由鳶尾和風(fēng)車草組成的垂直流人工濕地處理模擬水產(chǎn)養(yǎng)殖尾水，通過(guò)超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)其根系分泌物釋放情況并分析其與污染物去除率之間的聯(lián)系，以期為強(qiáng)化人工濕地處理水產(chǎn)養(yǎng)殖尾水效果提供參考。

1 材料與方法

1.1 人工濕地搭建

實(shí)驗(yàn)于中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所芳村基地進(jìn)行。使用有機(jī)玻璃為原材料的圓柱體(直徑20 cm，高50 cm)搭建垂直流人工濕地。填充材料為沸石、陶粒、椰殼炭的混合物，混合比例為1∶1∶2[9]，基質(zhì)鋪設(shè)高度為35 cm，濕地水深40 cm。共設(shè)置3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，不種植植物的濕地(NP)為對(duì)照組，種植植物為鳶尾(YW)或風(fēng)車草(FCC)的濕地為處理組，植物種植密度約為31株/m2(圖1)，每組有3個(gè)平行。

圖1 人工濕地裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of constructed wetland

1.2 濕地運(yùn)行與水質(zhì)檢測(cè)

1.3 根系分泌物收集與檢測(cè)

根系分泌物收集方法參考MA等[6]的方法，用超純水輕輕沖去植物根部黏附的基質(zhì)與死亡的植物組織，之后將根部置于400 mL超純水中用錫箔紙避光培養(yǎng)12 h。培養(yǎng)后的溶液通過(guò)0.45 μm濾膜過(guò)濾以除去雜質(zhì)，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在45 ℃減壓濃縮至20 mL，于-20 ℃保存待上機(jī)檢測(cè)。樣品中加入10 μL 100 μg/mL內(nèi)標(biāo)，過(guò)0.22 μm PTFE濾頭上機(jī)檢測(cè)。使用超高效液相色譜儀(Thermo Vanquish UHPLC)，色譜柱：C18色譜柱[Zorbax Eclipse C18(1.8 μm×2.1 mm×100 mm)]，色譜分離條件為：柱溫為30 ℃；流速0.3 mL/min；流動(dòng)相組成A：0.1%甲酸水溶液，B：純乙腈，流動(dòng)相梯度洗脫程序見(jiàn)表1；進(jìn)樣量為2 μL，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度4 ℃。質(zhì)譜條件：正(負(fù))模式：加熱器溫度325 ℃；鞘氣流速：45 arb；輔助氣流速：15 arb；吹掃氣流速：1 arb；電噴霧電壓：3.5 kV；毛細(xì)管溫度：330 ℃；S-Lens RF Level：55%。掃描模式：一級(jí)全掃描(Full Scan，m/z100～1 500)與數(shù)據(jù)依賴性二級(jí)質(zhì)譜掃描(dd-MS2，TopN=10)；分辨率：120 000(一級(jí)質(zhì)譜)&60 000(二級(jí)質(zhì)譜)。碰撞模式：高能量碰撞解離(HCD)。根據(jù)各樣品中代謝物的峰面積，計(jì)算其在樣品中相對(duì)濃度。

表1 液相色譜流動(dòng)相條件Tab.1 LC mobile phase conditions

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

用IBM SPSS 26.0對(duì)各測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與Pearson相關(guān)系數(shù)的計(jì)算，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05被認(rèn)為有顯著差異，并用鄧肯多重比較進(jìn)行排序。圖形采用origin 2022繪制。

2 結(jié)果

2.1 不同植物人工濕地對(duì)尾水的凈化效果

圖2 不同植物組出水N的濃度Fig.2 Effluent nitrogen concentration of different groups

圖3 不同植物組對(duì)N的去除率Fig.3 Nitrogen removal efficiency of different groups不同小寫字母標(biāo)注表示平均去除率差異顯著，P<0.05

圖4 不同植物組對(duì)COD和TP的平均去除率Fig.4 Average COD and TP removal efficiency of different groups不同小寫字母標(biāo)注表示差異顯著，P<0.05

2.2 根系分泌物

兩種植物的根系分泌物共分離檢測(cè)出249種物質(zhì)，其中正離子模式下有145種，負(fù)離子模式下有104種。其中3個(gè)平行中均檢測(cè)到并且具有CAS號(hào)(Chemical Abstracts Service Registry Number)的化合物有84種，可歸為28類：苯并吡喃(No.1)，苯酚醚(No.2)，苯及其取代衍生物(No.3～9)，吡啶及其衍生物(No.10～11)，大環(huán)內(nèi)酯類及其類似物(No.12)，二嗪(No.13～14)，二嗪烷(No.15)，酚類(No.16～17)，呋喃(No.18)，黃酮類化合物(No.19～20)，類固醇和類固醇衍生物(No.21～24)，硫醚(No.25)，咪唑嘧啶類(No.26～28)，嘧啶核苷(No.29～31)，萘并呋喃類(No.32)，內(nèi)酰胺(No.33)，偶氮苯(No.34)，嘌呤核苷(No.35～36)，羥基酸及其衍生物(No.37)，肉桂酸及其衍生物(No.38～39)，羧酸及其衍生物(No.40～52)，異黃酮類(No.53)，吲哚及其衍生物(No.54)，有機(jī)氮化合物(No.55～56)，有機(jī)磷酸及其衍生物(No.57～59)，有機(jī)氧化合物(No.60～67)，孕烯醇酮脂類(No.69～77)，脂肪酰類(No.78～84)。如表2所示，鳶尾的根系分泌物種類共有82種，風(fēng)車草的根系分泌物共有24種。

表2 不同植物組根系分泌物的組成Tab.2 Composition of root exudates in different groups

2.3 根系分泌物與污染物去除率關(guān)系

圖5 不同處理組污染物去除率與根系分泌物濃度的相關(guān)性Fig.5 Correlation of pollutants removal efficiency and root exudates concentration of different groups

3 討論

3.1 根系分泌物的功能

根系分泌物本質(zhì)上是植物光合作用及自身生理代謝固定轉(zhuǎn)化的含碳化合物，因此它可以作為細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育所需的能源物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出的根系分泌物在許多以往的研究中有報(bào)道，如次黃嘌呤和尿囊素可以作為一些淡水綠藻生長(zhǎng)的氮源[11]；萊茵衣藻可以利用腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤作為氮源[12]；吳海露[13]將植物根系浸泡得到的根系分泌物濃縮后加入反硝化培養(yǎng)基作為輔助碳源，促進(jìn)了反硝化作用及反硝化微生物的生長(zhǎng)。另外，本研究檢測(cè)出的許多根系分泌物還具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用，如2，4-二硝基苯酚能促進(jìn)玉米根系代謝和吸收外源底物[14]；膽堿處理能有效地促進(jìn)玉米等植物的生長(zhǎng)[15]。根系分泌物中還檢測(cè)出多種氨基酸類化合物，氨基酸類是植物中各種酶合成的催化劑，在植物生長(zhǎng)和代謝中起重要作用，如纈氨酸能夠促進(jìn)桃幼苗的根系生長(zhǎng)，可提高其凈光合速率和果實(shí)品質(zhì)[16]；施用有機(jī)肥和L-苯丙氨酸對(duì)牛膝草的生長(zhǎng)、產(chǎn)量和品質(zhì)均有積極的影響[17]。

除了直接作為促生長(zhǎng)物質(zhì)，根系分泌物還可以提高植物的抗病、抗脅迫、抗應(yīng)激等能力。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出的根系分泌物在之前的研究中展現(xiàn)了一定的抗菌活性，如異香草酸和扁塑藤素分別具有抗細(xì)菌和抗真菌活性[18，19]；熊果酸能特別針對(duì)細(xì)菌包膜，包括革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌[20]。另外，外源施用保護(hù)性植物代謝物如檸檬酸或檸檬酸鹽已成為提高植物對(duì)環(huán)境脅迫抗性的有效方法[21]，本研究測(cè)得鳶尾根系分泌物中檸檬酸相對(duì)濃度高達(dá)62.3 μg/mL，為本研究檢測(cè)出相對(duì)濃度最高的根系分泌物。結(jié)合鳶尾的良好長(zhǎng)勢(shì)，表明檸檬酸可能發(fā)揮了重要作用。本研究中其它檢測(cè)出的根系分泌物也有著利于植物抗脅迫應(yīng)激的作用，吡哆醇是胚后根發(fā)育、耐受滲透和氧化脅迫所必需的一種維生素[22]；外源煙酸的施用可增強(qiáng)玉米的耐旱性；熊果酸和齊墩果酸可參與植物抵御失水和病原體的防御過(guò)程[23]。

根系分泌物還能作為介導(dǎo)植物-微生物關(guān)系的信號(hào)分子，本研究檢測(cè)出的壬二酸可作為擬南芥莖液中病原菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的代謝物，具有多種遠(yuǎn)距離抗性啟動(dòng)信號(hào)[24]；苯乙炔可以影響微生物群落結(jié)構(gòu)[25]，也有文獻(xiàn)報(bào)道其是一種硝化抑制劑[26]，表明根系可能更多發(fā)生的是反硝化作用；谷氨酸在植物宿主和其微生物之間起著直接聯(lián)系作用，可重塑植物微生物群以保護(hù)植物免受病原體的侵害[27]。

3.2 根系分泌物對(duì)人工濕地處理性能的影響

多數(shù)研究表明植物對(duì)COD的去除起著積極的作用[32]。COD除了作為反硝化的碳源被利用，也能被氧化分解去除。植物的加入使得根際泌氧增加并通過(guò)根系分泌物增強(qiáng)了反硝化作用，進(jìn)而提高了COD的去除率。鳶尾的根際泌氧較風(fēng)車草低[29]，而本研究中其對(duì)COD去除率高于風(fēng)車草，推測(cè)鳶尾更多地通過(guò)根系分泌物促進(jìn)了反硝化作用進(jìn)而去除了更多的COD。說(shuō)明在一定的溶氧范圍內(nèi)，人工濕地內(nèi)反硝化作用比氧化分解能消耗更多的COD，因?yàn)镃OD的去除主要是通過(guò)微生物的作用[33]。人工濕地對(duì)P的去除主要是靠基質(zhì)吸附、植物吸收和微生物的同化作用[34]。在濕地建立初期，基質(zhì)吸附量未達(dá)到飽和，因此3組濕地系統(tǒng)對(duì)P的去除率都在80%以上。植物根系分泌的低分子量有機(jī)酸可以促進(jìn)微生物對(duì)P的轉(zhuǎn)化與利用而更利于植物吸收[35]，導(dǎo)致種植植物組對(duì)TP的處理效果略高于未種植組。

4 結(jié)論

(1)種植植物可以顯著提高人工濕地對(duì)N，P的處理效果，不同的植物釋放的根系分泌物種類與數(shù)量有差異，并與污染物的去除有一定相關(guān)性。

(2)鳶尾根系分泌物種類與數(shù)量均占一定優(yōu)勢(shì)，其對(duì)TN，TP的去除率也高于風(fēng)車草，表明根系分泌物對(duì)污染物的去除有積極影響。